Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4804:1989 (ST SEV 4318-83) về thức ăn chăn nuôi - phương pháp xác định aflatoxin

• Số hiệu: TCVN4804:1989
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: 25/12/1989

Animal feeding stuffs

Method for determination of aflatoxin

Tiêu chuẩn này phù hợp với ST SEV 4318-83, áp dụng cho thức ăn chăn nuôi: thức ăn hỗn hợp, thức ăn chăn nuôi: dạng hạt, cám, lạc (arachis), thức ăn thô cũng như khô dầu lạc, khô dầu cải, khô dầu bông, khô dầu đậu tương, khô dầu trích ly và qui định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin (độc tố vi nấm ) B1, B2, G1 và G2.

1. Bản chất của phương pháp

Phương pháp dựa trên sự tách chiết aflatoxin từ mẫu thử bằng cloroform, rửa phần chiết qua cột sắc ký, sau đó xác định hàm lượng các aflatoxin (độc tố vi nấm) riêng lẻ trên sắc ký bản mỏng (SKBM) trên cơ sở đánh giá bằng mắt hay bằng mật độ huỳnh quang kế- (Densitomet), kích thước và cường độ các vết phát quang và tiến hành thử nghiệm hoá học để xác nhận trên sắc ký bản mỏng (SKBM).

2. Các vấn đề chung

2.1. Để tiến hành thử nếu không có các chỉ dẫn khác dùng thuốc thử tinh khiết để phân tích (TKPT) và nước cất hay nước có độ sạch tương ứng.

2.2. Hàm lượng tối thiểu và phương pháp có thể phát hiện là 1mg/kg.

3. Thiết bị

...

...

...

3.2. Cột sắc ký thuỷ tinh có van mài đường kính trong 2,2 cm và dài 40 cm.

3.3. Thiết bị bốc hơi chậm khung quay loại rôto hay loại Cudex- Danhit.

3.4. Nguồn bức xạ tử ngoại (cực tím) (OF) có bước sóng 365 mm.

3.5. Mật độ huỳnh quang kế có bộ lọc sóng đảm bảo phát xạ tử ngoại bước sóng 365 mm có bộ lọc lần hai bước sóng 336 mm.

3.6. Máy lắc.

3.7. Phổ quang kế đảm bảo đo trong vùng phổ tử ngoại từ 300 đến 400 nm.

3.8. Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ đến 200^0C.

3.9. Bình khí nitơ hay khí trơ khác.

3.10. Bếp cách thuỷ hay cách cát đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ đến 100^0C.

...

...

...

3.12. Cân kỹ thuật với sai số phép cân không lớn hơn ± 0,1g.

3.13. Máy nghiền phòng thí nghiệm (máy tán) đảm bảo độ mịn của bột không quá 1mm.

3.14. Bơm hút bằng ống nước.

3.15. Phễu Bunhe (Buchner) đường kính 10 cm.

3.16. Phễu thuỷ tinh .

3.17. Bình Eclenmaye (dung tích 500 cm^3).

3.18. Bình nón nút mài dung tích 250, 400 và 750 cm^3.

3.19. Bình định mức dung tích 10 cm^3.

3.20. ống đo (hình trụ) dung tích 50, 100 và 250 cm^3.

...

...

...

3.22. ống thuỷ tinh nút mài dung tích 10 cm^3.

3.23. Vòi phun thuỷ tinh.

3.24. Sàng (lưới) đường kính lỗ 1 mm.

3.25. Đũa thuỷ tinh.

4. Thuốc thử, dung dịch và vật liệu

4.1. Axeton

4.2. Metyl xyanua (Acetonitryl)

4.3. Benzen

4.4. Sắt clorua

...

...

...

4.6. Axit triflo axetic

4.7. Axit axetic băng

4.8. Cacbonat đồng - hyđroxit đồng CuCO₃, Cu(OH)₂

4.9. Natri sunfat khan

4.10. Chì axetataxit

4.11. Rượu n.amylic bậc 1

4.12. Rượu metylic

4.13. Rượu etylic

4.14. Toluen

...

...

...

4.16. Ete dietyl mất nước không chứa peroxit

4.17. Ete petrol có nhiệt độ 30-35^0C hay haxan tách từ dầu hoả

4.18. Triclo etylen

4.19. Amoni sunfat dung dịch 40%

4.20. Axetenitrin, dung dịch 2% trong benzen

4.21. Kali hyđroxit, dung dịch chứa (KOH) = 0,02 mol/dm^3

4.22. Natri hyđroxit,dung dịch chứa (NaOH) = 0,2 mol/dm^3

4.23. Axit nitric, dung dịch chứa HNO_3- = 2 mol/dm^3

4.24. Rượu metylic, dung dịch 3% trong clorofoc

...

...

...

4.26. Aflatoxin (độc tố vi nấm) dung dịch

4.26.1. Dung dịch gốc chuẩn bị như sau :

Dung dịch I - cho 1 mg aflatoxin vào bình định mức dung tích 10 cm^3 hoà tan trong hỗn hợp benzen - axetonitrin theo tỷ lệ thể tích và 98+ 2 và định mức đến vạch. Nồng độ dung dịch phải là 0,1mg/cm^3.

Dung dịch II - chuyển 1 cm^3 dung dịch I vào bình định mức dung tích 10 cm^3 và dùng hỗn hợp benzen axetonitrin định mức đến vạch. Nồng độ dung dịch phải là 10mg/cm^3.

Đối với mỗi chất độc aflatoxin dung dịch gốc cần chuẩn bị riêng và bảo quản trong bình kín ở chỗ tối ở nhiệt độ gần 0^0C.

4.26.2. Dung dịch hỗn hợp các chất aflatoxin chuẩn bị như sau : lấy 1cm^3dung dịch gốc II của các aflatoxin B₁và G₁và 0,5cm^3dung dịch gốc II các aflatoxin B₂và G₂ vào bình định mức dung tích 10 cm^3 và định mức đến vạch bằng hỗn hợp benzen - axetonitrin. Nồng độ các aflatoxin trong dung dịch tiêu chuẩn phải là mg/ cm^3 đối với B₁ và G₁ và 0,5 mg/ cm^3 đối với B₂và G₂.

4.26.3. Xác định nồng độ aflatoxin trong dung dịch II bằng phương pháp quang phổ bằng cách đo sự hấp thụ trong phổ tử ngoại (UF) từ 330 đến 370 mm đối với hỗn hợp benzen - axetonitrin.

Nồng độ aflatoxin (C) tính ra microgam trên cm^3, theo công thức :

...

...

...

A - Hấp thụ ở bước sóng 350 nm

m_c - Phân tử lượng, cụ thể đối với các aflatoxin

B₁ - 312, B₂ - 314, G₁ - 328, G₂ - 330.

e - Hệ số hấp thụ phân tử cụ thể đối với các aflatoxin

B₁ - 19.800, B₂ - 20.900, G₁ - 17.100, G₂ - 18.200.

k - Hệ số hiệu chỉnh quang phổ kế sử dụng, nằm trong khoảng từ 0,95 đến 1,05.

4.27. Hỗn hợp các hệ dung môi triển khai tách triết cho SKBM (các pha di động).

4.27.1. Hỗn hợp clorofoc - triclo etylen rượu n-emylic axit foemic theo tỷ lệ thể tích là 80 + 15 + 4 + 1.

4.27.2. Hỗn hợp clorofoc - axeton tỷ lệ thể tích 90 + 10.

...

...

...

4.28. Silicagen - H theo Stan dùng cho sắc ký bản mỏng (SKBM) hay Adsorbosil - 1 hay loại khác có tính chất tương đương.

4.29. Các tiêu chuẩn dùng cho SKBM, chuẩn bị như sau :

Rửa các tấm kính trong dung dịch chất khử bản, tráng bằng tia nước và tráng kỹ bằng nước cất, sấy khô và rửa bằng rượu etylic. Cho 70g silicagen - H hay 50g Adsorbosil - 1 vào bình nón, đổ vào 60 cm^3 nước cất và trộn kỹ; chuyển vữa này vào dụng cụ tạo lớp chất hấp phụ mỏng và để lên các tấm có độ dày 0,25mm (khối lượng chất hấp thụ đã nêu đủ để chuẩn bị 10 tấm có kích thước 20 x 20 cm); sấy các tấm ở nhiệt độ phòng sau đó cho vào tủ sấy, tăng dần nhiệt độ đến 110^0C và để ở nhiệt độ này trong 2h.

Ngừng sấy, làm nguội ở nhiệt độ phòng và cho vào bình hút ẩm. Những tấm chuẩn này bảo quản ở trong bình hút ẩm đến 4 tuần.

4.30. Silicagen viên (hạt) có đường kính hạt 0,05 - 0,2 mm dùng cho cột sắc ký, được để ở nhiệt độ 105^0C trong 1 giờ. Sau khi làm nguội cho nước cất theo 1% khối lượng silicagen và lắc trong 2 giờ. Bảo quản ở bình đậy kín.

4.31. Giấy lọc loại nhanh .

4.32. Bông đã tẩy mỡ bằng ête dầu hoả hay bông thủy tinh.

4.33. Điatomit (đá tảo cát) mác xelit - 545 hay Hyflosuper - cel hay loại khác có tính chất tương tự.

5. Chuẩn bị thử

...

...

...

Nghiền mẫu phân tích của thức ăn chăn nuôi bằng máy nghiền, sàng qua sàng và trộn đều. Cân 50g với sai số cho phép cân không lớn hơn ± 0,1g và cho vào bình nón nút mài dung tích 750 cm^3, cho thêm 25% diatomit, đổ vào 25 cm^3 nước, khuấy kỹ bằng đũa thuỷ tinh, sau đó cho thêm vào 250 cm^3clorofoc. Đậy kín bình và đặt lên thiết bị, lắc. Lắc trong 30 phút, lọc phần chiết (chất chiết) qua giấy lọc chứa (5 ± 0,1g) natri sunfat khan. Thu 50 cm^3 phần lọc dầu.

5.2. Chuẩn bị cột sắc ký

Chuẩn bị cột rửa phần lọc như sau :

Cho vào đáy cột nút bông đã tẩy mỡ rồi cho vào 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến nửa chiều cao của cột, cho vào 10g silicagen đã chuẩn bị theo mục 4.30, và tráng thành cột bằng 20 cm^3 clorofoc. Trộn gel (keo) bằng đũa thuỷ tinh sao cho không phá vỡ lớp sunfat. Sau khi chất hút láng (kết tủa) hoàn toàn, phủ gel bằng 15g natri sunfat khan và đổ clorofoc đến mức chất hút.

5.3. Làm (rửa) sạch phần lọc trên cột sắc ký

Đổ 50 cm^3 phần lọc theo đũa thuỷ tinh hay theo thành vào cột đã chuẩn bị như trên, phần này chứa tương đương 10g mẫu phân tích thức ăn chăn nuôi. Mở van và tháo dung môi. Giải hấp (rửa giải) hấp phụ trên gel lần lượt bằng 150 cm^3 hexan và 150 cm^3 ête dietylic khan. Bỏ nước giải hấp (eluent).Tách aflatoxin bằng 150 cm^3 dung dịch rượu metylic trong clorofoc. Làm bốc hơi dung môi tách (eluent) trong thiết bị bốc hơi chân không đến khi còn có thể tích 0,5 cm^3. Sau đó, dùng 3 lượng từng 2 cm^3 clorofoc chuyển định lượng cặn vào các ống khác vạch có nút mài và làm bốc hơi đến khi bằng dòng khí nitơ. Hoà tan phần chiết đã được làm sạch trong 0,5 cm^3 dung dịch axeton nitrin trong benzen và bảo quản dung dịch nhận được trong tủ lạnh đến khi tiến hành thử.

5.4. Chuyển dung dịch và dung dịch thử lên các tấm sắc ký bản mỏng

Cạo sạch lớp chất hút rộng 0,5 cm ở các cạnh thẳng đứng của các tấm. Đánh dấu các cạnh thẳng đứng bằng các vạch rộng 1 - 1,5 cm và dùng đường thẳng ngang giới hạn sự di động của các pha chuyển động ở khoảng cách 13 cm từ đường xuất phát. Trên khoảng cách 2 cm từ cạnh dưới tấm cho 1,2 và 5 cm^3 dung dịch hỗn hợp aflatoxin đã chuẩn bị theo mục 4.26.2 và làm 3 lần từng 10 mm^3 mỗi dung dịch thử. Trên mỗi vết dung dịch thử cho 1 và 2 mm^3 dung dịch hỗn hợp aflatoxin (chuẩn trong). Để tránh nhầm lẫn cần đánh số các vết của dung dịch chuẩn và dung dịch tứ ở phía trên tấm.

5.5. Chuẩn bị buồng khai triển

...

...

...

5.6. Rửa phụ (làm sạch thêm) phần chiết

Nếu dung dịch thử chứa các tạp chất cản trở xác định aflatoxin cần tiến hành làm sạch thêm cặn khô bằng một trong những phương pháp nêu dưới đây :

5.6.1. Hoà tan cặn khô trong 50 cm^3 axeton, cho thêm 20 cm^3 dung dịch amonisunfat và 130 cm^3 nước; trộn và để lắng 2 -5 phút sau đó cho thêm 10g xelit - 545, trộn và lọc hỗn hợp qua giấy lọc cuốn (gấp) sóng. Thu 120 cm^3 phần lọc tương đương với 6g thức ăn chăn nuôi chuyển vào phễu tách dung tích 250 cm^3, cho thêm 10 cm^3 benzen và lắc trong 2 phút.

Sau khi phân lớp, tách bỏ pha nước ở phía dưới, còn trộn pha benzen với 50 cm^3 nước và lại lắc phễu. Sau đó lại tách bỏ pha nước, còn lọc benzen qua lớp natrisunfat khan đã được rửa bằng 5 cm^3 benzen. Gộp các phần lọc và làm bay hơi bằng dòng khí nitơ và hoà tan cặn khô trong 0,5 cm^3 dung dịch axeton nitrin trong benzen. Bảo quản dung dịch thử đã làm sạch trong tủ lạnh đến khi tiến hành thử.

5.6.2. Hoà tan phần chiết đã được làm sạch trong 50 cm^3 hỗn hộp nước – axetonitrin (5+45) cho thêm 25 cm^3 dung dịch chì axetat và 2g xelit- 545. Chuẩn bị dung dịch chì axetat như sau : hoà tan 200g chì axetaaxit Pb (CH₃COO)₂. 3H₂O trong 100 cm^3 nước và đun nóng trên bếp cách thuỷ đến khi tan cho thêm 3 cm^3 axit axetic băng và đổ nước đến thể tích 1 dm^3 ; lọc phần chiết đã được làm sạch qua giấy lọc gấp sóng vào phễu tách (chiết) dung tích 250 cm^3 và rửa phin lọc bằng 50 cm^3 nước; chiết 3 lần dung tích gộp bằng lượng từng 50 cm^3 clorofoc, gộp các pha dưới, sấy qua lớp natri sunfat trên phin lọc và làm bốc hơi trong thiết bị bốc hơi chân không ở nhiệt độ 45^0C.

Dùng 3 luợng mỗi lượng 2 cm^3 clorofoc chuyển dịch lượng cặn khô vào ống nghiệm có nút mài, làm bốc hơi dung môi bằng dòng khí nitơ, còn cặn thì hoà tan trong 0,5 cm^3 dung dịch axetonitrin trong benzen và bảo quản trong tủ lạnh đến khi tiến hành thử.

5.6.3. Hoà tan cặn khô trong 150 cm^3 axeton nước (85 +15 ). Cho vào cốc dung tích 500 cm^3 lần lượt 170 cm^3 natri hyđroxit và dung dịch mới chuẩn bị gồm 20g sắt clorua trong 300 cm^3 nước. Khuấy kỹ hỗn hợp. Cho vào dung dịch phần chiết trong axeton nước 3g đồng cacbonat bazơ và chuyển vào cốc chứa hỗn hợp sắt clorua và natri hyđrôxít. Cho thêm vào 100g xelit- 545 và khuấy kỹ. Lọc lượng chứa trong cốc qua phễu lọc Bunhe (Buchner) và chuyển 150 cm^3 phần lọc chứa 4,3g thức ăn chăn nuôi vào phễu tách dung tích 500 cm^3, cho thêm 150 cm^3 0,03% dung dịch axit sunfuric và 10 cm^3 cloruafoc. Lắc phễu trong 3 phút. Chuyển lớp clorofoc bên dưới vào phễu tách sạch dung dịch 250 cm^3, cho thêm 100 cm^3 dung dịch kali hyđrôxit và lắc trong 30 giây. Sấy clorofoc bằng natri sunfat khan, làm bốc hơi trong dòng khí nitơ và hoà tan cặn khô trong 0,5 cm^3 dung dịch axetonitrin 2% trong benzen. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh đến khi tiến hành thử.

6. Tiến hành thử

6.1. Tiến hành sắc ký bản mỏng

...

...

...

6.2. Đánh giá định tính các tấm sắc ký

Xem xét tấm sắc ký trong ánh sáng tử ngoại trong buồng tối ở khoảng cách 20cm từ nguồn phát xạ và xác định các vết huỳnh quang mầu xanh tối có đại lượng tương đối của yếu tố duy trì (khống chế)(Rf) trong hệ sắc ký 4.27.1, 4.27.2 và 4.27.3 đối với aflatoxin B₁ ằ 0,40; 0,59 và 0,35 và tương tự đối với aflatoxin B₂ ằ 0,40; 0,43 và 0,28. Các aflatoxin G₁ và G₂ cần phải phát quang bằng ánh sáng xanh lá cây, đại lượng Rf của chúng trong cùng hệ sắc ký trên phải là ằ 0,24; 0,39; 0,23 đối với G₁và 0,18; 0,30; 0,19 đối với G₂.

6.3. Sự nhận biết aflatoxin

Dùng vòi phun phun các tấm sắc ký chứa các hỗn hợp tách chiết của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử, bằng dung dịch axit sunfuric 25% sấy trong luồng khí ẩm và xem xét lại trong ánh sáng tử ngoại.

Nếu không có sự thay đổi ánh huỳnh quang của các chất từ xanh tím sang xanh lá cây vàng thì có thể loại trừ khả năng có aflatoxin. Nếu có sự thay đổi đó, có thể kết luận sơ bộ là có aflatoxin hay chất khác có thể tham gia phản ứng với axit sunfuric. Trong trường hợp này cần tiến hành sắc ký lại trong hai hệ sắc ký khác theo mục 4.27 và thử lại bằng phương pháp hoá học.

So sánh độ huỳnh quang của các vết bằng mắt hoặc dùng mật độ huỳnh quang kế.

Để tiến hành xác định mật độ huỳnh quang kế có thể dùng các phổ thông chứa các chất giao thoa lạ trong vùng tách aflatoxin. Nếu bằng mắt đã có thể phát hiện là có các chất đó, cần làm sạch thêm cặn khô của nước giải hấp (eluent) từ cột sắc ký dùng một trong những phương pháp nêu ở mục 5.6.

Đặt tấm sắc ký trên mật độ huỳnh quang kế. Ghi phổ mật độ huỳnh quang của aflatoxin theo hướng sử dụng máy. Phân tích định lượng chỉ tiến hành đối với các đại lượng nằm trong giới hạn của chỉ số tuyến tính trên mật độ huỳnh quang kế.

Kết quả so sánh là giá trị trung bình cộng của không ít hơn 3 phép đo.

...

...

...

6.4.1. Xác nhận có aflatoxin B₁ và G₂.

Phép thử dựa trên sự tạo chất dẫn xuất của aflatoxin B₁ và G₂ với axit triflo axetat trực tiếp trên tấm sắc ký.

Chia tấm sắc ký làm 2 phần bằng nhau. Đậy một nửa bằng tấm kính sạch, nhỏ lên nửa kia hai vết (1 – 10 mm^3) dung dịch thử chứa 0,5 -5mg aflatoxin B₁ và G₁, cũng như 2 và 5 mm^3 theo mục 4.26.2. Cho thêm vào một trong các vật thử nghiên cứu 2 mm^3 dung dịch aflatoxin (chuẩn nội bộ). Sau đó cho thêm vào tất cả các vết, mỗi vết 2 mm^3 hỗn hợp mới chuẩn bị của axit triflo axetic với clorofoc (1+1). Sấy tấm sắc ký trong luồng hơi nóng (35-40^oC) trong 10 phút sau đó mở phần hai của tấm sắc ký và cho lên một khối lượng như trên dung dịch aflatoxin theo mục 4.26.2 và dung dịch nghiên cứu (thử). Không cho dung dịch axit triflo axetic. Cho vào đáy buồng sắc ký sạch một mảng bông thuỷ tinh hẹp có nước, dùng pipet cho vào phần còn lại của buồng gần 50 cm^3 hệ tách chuẩn bị theo mục 4.27.2. Cho tấm sắc ký vào sao cho móng có nước nằm trước tấm sắc ký. Tiến hành sắc ký đến độ cao 13cm và xem xét trong ánh sáng tử ngoại với bước sóng 365nm. Những aflatoxin không tham gia phản ứng với axit triflo axetic đều phải nằm gần đường tuyến của dung môi . Những aflatoxin huỳnh quang tạo thành sau phản ứng có ánh xanh tím B_2a và G_2a phải nằm phía dưới tấm và có đại lượng Rf nhỏ hơn 4 lần so với B₁và G₁.

Phun tấm kính thêm bằng dung dịch axit sunfuric dung dịch này thay đổi huỳnh quang xanh tím của tất cả các aflatoxin xanh lá cây vàng.

6.4.2. Xác nhận có aflatoxin G₁ và G₂.

Phép thử này được dùng khi trên các tấm sắc ký xuất hiện các tạp chất giao thoa (nhiễu) dịch chuyển cùng aflatoxin G. Tiến hành sắc ký tấm sắc ký chứa dung dịch trong hệ tách benzen - rượu etylic - nước (46+35+19). Hệ được chuẩn bị trước khi dùng 24 giờ bằng cách lắc tất cả các chất trong phễu tách sau khi phân lớp tách từng pha vào các bình riêng. Nếu hỗn hợp đang chuẩn bị bị đục, cần đun nóng hỗn hợp. Để 50 cm^3 lớp dưới cùng vào buồng sắc ký, còn 50 cm^3 lớp trên cùng đổ vào máng thuỷ tinh riêng và đặt máng vào buồng trước tấm sắc ký. Sau khi lấy tấm sắc ký chứa các chất tách được ra, sấy tẩm sắc ký, xem xét trong ánh sáng tử ngoại và xác định hàm lượng aflatoxin.

7. Xử lý kết quả

7.1. Khi so sánh độ phát huỳnh quang của các vết bằng mắt, hàm lượng aflatoxin trong mẫu thử thức ăn chăn nuôi (X) tính bằng microgram trên kilogram theo công thức:

...

...

...

V_W - Thể tích dung dịch hỗn hợp aflatoxin theo mục 4.26.2 tương ứng mẫu thử , mm^3

C - Nồng độ aflatoxin trong dung dịch hỗn hợp theo mục 4.26.2 mg/cm^3

V_k - Thể tích cuối của dung dịch thử, mm^3

V_e - Thể tích dung dịch thử trên tấm sắc ký, mm^3

m - Khối lượng mẫu chứa trong thể tích phần chiết, lấy làm sạch, g.

7.2. Khi so sánh độ phát huỳnh quang của aflatoxin, bằng mật độ kế, hàm lượng aflatoxin trong mẫu thử thức ăn chăn nuôi tính bằng micogram trên kilogram xác định bằng cách so sánh diện tích các đỉnh (pic) theo công thức :

Trong đó :

S_e - Diện tích đỉnh (pic) dung dịch thử

...

...

...

V_w - Thể tích dung dịch hỗn hợp aflatoxin cho lên tấm sắc ký, mm^3

V_K - Thể tích cuối của dung dịch thử, mm^3

S_w - Diện tích pic aflatoxin

V_e - Thể tích dung dịch thử cho lên tấm sắc ký, mm^3

m - Khối lượng mẫu chứa trong thể tích phần chiết , lấy làm sạch, g.

7.3. Kết quả xác định cuối cùng là giá trị trung bình cộng của ít nhất là 2 phép xác định song song. Chênh lệch cho phép kết quả các phép xác định song song không được quá 20%

8. Biên bản thử

Biên bản thử cần ghi các số liệu sau :

1. Tên thức ăn chăn nuôi và mác

...

...

...

3. Khối lượng mẫu, g

4. Kết quả thử

5. Ký hiệu tiêu chuẩn SEV này

6. Thời gian thử (ngày thứ).