Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12384:2018 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng xơ không tan, xơ hòa tan và xơ tổng số

• Số hiệu: TCVN12384:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

Mẫu thử	Enzym thử nghiệm	Phần khối lượng mẫu thử, g	Độ thu hồi dự kiến, %
Pectin của cây có múi	Pectinase	0,1	từ 95 đến 100
Stractan	Hemicellulase	0,1	từ 95 đến 100
Tinh bột lúa mì	Amylase	1,0	từ 0 đến 1
Tinh bột ngô	Amylase	1,0	từ 0 đến 2
Casein	Protease	0,3	từ 0 đến 2
β-Glucan^a	β-Glucanase	0,1	từ 95 đến 100
^a Chế phẩm của công ty Sigma Chemical.

7.2  Phân hủy mẫu bằng enzym

7.2.1  Mẫu trắng

Với mỗi lần phân tích, cho chạy các mẫu trắng đồng thời cùng với các mẫu.

7.2.2  Mẫu thử

a) Cân mẫu chính xác hai lần, mỗi lần 1,000 g ± 0,005 g mẫu cho vào bình phân hủy 250 ml (4.2).

b) Bổ sung enzym

Làm ẩm mẫu với 1,0 ml etanol (hoặc IMS) và thêm 40 ml hỗn hợp α-amylase/AMG tuyến tụy (3.5) vào mỗi bình. Vặn nắp bình.

Chuyển bình vào nồi cách thủy (4.7) để lắc theo quỹ đạo hoặc lắc tuyến tính và đảm bảo các bình nằm đúng vị trí. Cách khác, sử dụng thiết bị có máy khuấy từ (4.7).

c) Ủ ấm với α-amylase tuyến tụy/AMG

...

...

...

d) Chỉnh pH đến khoảng 8,2 (pH từ 7,9 đến 8,4), bất hoạt α-amylase và AMG

Sau 16 h, lấy các bình đựng mẫu ra khỏi nồi cách thủy có lắc và thêm ngay 3,0 ml dung dịch Tris base 0,75 M (3.11) để kết thúc các phản ứng phân hủy tinh bột (tại cùng thời điểm này, nếu chỉ có sẵn một nồi cách thủy có lắc thì tăng nhiệt độ của nồi cách thủy có lắc đến 60 °C sẵn sàng cho bước ủ protease.) Nới nhẹ nắp bình và đặt bình vào nồi cách thủy (không lắc) ở 95 °C đến 100 °C và ủ 20 min, thỉnh thoảng lắc (bằng tay). Sử dụng nhiệt kế (4.29) đo để chắc chắn rằng nhiệt độ cuối cùng của lượng chứa trong bình lớn hơn 90 °C (kiểm tra chỉ một bình là đủ).

e) Làm nguội

Lấy tất cả các bình đựng mẫu ra khỏi nồi cách thủy (sử dụng găng tay thích hợp) và làm nguội đến khoảng 60 °C.

f) Xử lý bằng protease

Thêm 0,1 ml dung dịch protease (3.6), sử dụng bộ phân phối thích hợp, thu được dung dịch sánh. Ủ ấm ở 60 °C trong 30 min.

g) Chỉnh pH

Bổ sung 4,0 ml axit axetic 2 M (3.12) vào từng bình và trộn đều. Dung dịch này cho độ pH cuối cùng khoảng 4,3.

h) Bổ sung dung dịch nội chuẩn

...

...

...

i) Tiến hành theo 7.3 (a) để xác định IDF khi cần xác định các giá trị IDF và SDF. Tiến hành theo Phụ lục B (a) khi TDF được yêu cầu không phân tách thành IDF và SDF.

Hình 1 - Bố trí cách thủy phân mẫu sử dụng Mixdrive 15 có khuấy từ trong nồi cách thủy thông thường

Hình 2 - Bố trí bơm và cột để khử ion của dịch chiết mẫu

CHÚ GIẢI

a: Cột sắc ký dùng một lần [Ví dụ: Bio-Rad Econo-Pac® (Cat. No. 732-1010)]

b: Nút bông côttông

c: Van một chiều

...

...

...

e: Bơm Minipuls® Evolution

f: Vật chứa bình Duran

7.3  Xác định IDF

a) Cài đặt chế độ lọc

Cân chén có chứa Celite (đã nung đến khối lượng không đổi) (xem 4.3), chính xác đến 0,1 mg. Làm ướt và phân phối lại Celite trong chén nung, sử dụng 15 ml etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (4.2) từ bình rửa. Dùng dụng cụ hút để chuyển Celite vào chén lọc xốp. Loại bỏ dịch lọc.

b) Lọc

Sử dụng chân không để lọc dịch phân hủy (7.2.2) qua chén. Sử dụng bình rửa với 21,9 ml hoặc một lượng ít hơn nước đã khử ion (3.7) (được làm ấm đến 60 °C) để chuyển các hạt còn lại vào chén và tráng rửa cặn. Giữ lại dịch lọc đã gộp để xác định xơ hòa tan trong nước theo 7.4 (a).

c) Rửa

Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Loại bỏ nước.

...

...

...

d) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C.

e) Làm nguội chén trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa cặn IDF và Celite, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén đã cân để thu được khối lượng cặn.

f) Xác định protein và tro

Phần cặn của một trong hai chén nung được dùng để phân tích protein và phần cặn của chén thứ hai được dùng để phân tích tro. Thực hiện phân tích protein bằng phương pháp Kjeldahl hoặc đốt. Cẩn thận khi sử dụng máy phân tích đốt dùng để phân tích protein trong phần cặn; Celite hóa hơi từ mẫu có thể làm tắc nghẽn đường truyền của thiết bị. Sử dụng hệ số 6,25 cho tất cả các trường hợp để tính số miligam protein. Để phân tích tro, nung phần cặn của chén thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) và cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén và Celite để xác định tro.

g) Tiến hành xác định xơ hòa tan trong nước theo 7.4 (a).

7.4  Xác định xơ hòa tan trong nước

a) Tạo kết tủa SDFP tan trong nước

Đối với từng dịch lọc mẫu, thêm phần nước còn lại từ quá trình chuyển IDF và tráng IDF [xem 7.3 (b)] hoặc thêm một lượng nước, nếu cần để đưa tổng thể tích chính xác đến 70 ml, sau đó thêm 279 ml etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1) (đo ở nhiệt độ phòng), được làm nóng trước đến 60 °C và trộn kỹ. Tạo kết tủa SDFP ở nhiệt độ phòng trong 60 min.

b) Cài đặt chế độ lọc

...

...

...

c) Lọc

Sử dụng chân không để lọc SDFP đã kết tủa [7.4 (a)] từ phần nổi phía trên qua chén. Sử dụng bình rửa với etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2), chuyển hết các hạt còn lại trên thành chén. Giữ lại dịch lọc và nước rửa [7.4 (d)] để xác định SDFS.

d) Rửa

Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Gộp với dịch lọc của bước lọc [7.4 (c)].

e) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C.

f) Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa phần xơ và Celite còn lại, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng chén rỗng (nghĩa là khối lượng của chén nung và Celite khô) để thu được khối lượng cặn.

g) Xác định hàm lượng protein và tro

Phần cặn của một trong hai chén được dùng để phân tích protein và phần cặn của chén thứ hai được dùng để phân tích tro. Thực hiện phân tích protein bằng phương pháp Kjeldahl hoặc đốt. Cẩn thận khi sử dụng máy phân tích đốt dùng để phân tích protein trong phần cặn; Celite hóa hơi từ mẫu có thể làm tắc nghẽn đường truyền của thiết bị. Sử dụng hệ số 6,25 cho tất cả các trường hợp để tính số miligam protein. Để phân tích tro, nung phần cặn của chén thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) và cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén và Celite để xác định tro.

h) Tiến hành theo 7.5.5.

...

...

...

7.5.1  Yêu cầu chung

Sắc ký đồ của maltodextrin, maltose, glucose, sorbitol và glycerol trên cột Sugar-Pak (4.21.3) được thể hiện trong Hình A.1 và của xơ hòa tan (WASDF hoặc SDFS) trong hỗn hợp nước: cồn, glucose và sorbitol trong Hình A.2.

CHÚ THÍCH: Việc khử ion đúng cách là một phần quan trọng của việc thu dữ liệu sắc ký chính xác về SDFS. Đối với việc khử ion bằng phương pháp thủ công, phải hiểu rõ về xuất hiện của các pic muối trong sắc ký đồ của SDFS có thể ảnh hưởng đến việc xác định xơ. Trong việc đánh giá cột chứa khoảng 8 g nhựa hỗn hợp, hòa tan 10 mg natri clorua vào 9 ml nước đã khử ion, thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn LC (3.16) 100 mg/ml và tiến hành theo 7.5.6 “chuyển 2 ml lên đỉnh cột...”. Sắc ký lỏng của dung dịch này sẽ không có các pic trong khoảng thời gian tương ứng với cacbohydrat của DP > 3. Để đồng thời khử ion và định lượng bằng LC, xem Hình A.2 về sự thay đổi xảy ra trong chạy sắc ký khi khả năng trao đổi ion của cột bị vượt quá.

7.5.2  Cài đặt hệ thống LC

a) Cài đặt hệ thống LC theo Hình 3 và Hình 4 tùy thuộc vào cách đồng thời khử ion cùng với quá trình sắc ký hoặc thủ công.

Các điều kiện hoạt động của cột Sugar-Pak (4.21.3) là:

- Nhiệt độ: 90 °C.

- Pha động-khử ion bằng phương pháp thủ công: Nước cất cộng với dung dịch Na₂CaEDTA 50 mg/l (3.18); tốc độ dòng, 0,5 ml/min.

Đồng thời khử ion và định lượng:

...

...

...

+ Pha động dùng cho bơm thứ hai: Na₂CaEDTA 500 mg/l (3.19); tốc độ dòng 0,05 ml/min.

- Hệ thống phải tách được maltose ra khỏi các malto-oligosaccharide cao hơn (Hình A.1).

- Thời gian chạy: 30 min để đảm bảo rằng tất cả các mẫu từ quá trình bơm được làm sạch khỏi cột trước khi bơm tiếp.

- Detector RI (4.21.4) ở 50 °C.

CHÚ THÍCH  đối với các mẫu có chứa một lượng lớn polyfructose chuỗi ngắn, nên dùng sắc ký của SDF trên hai cột sắc ký lòng ngoại cỡ (TSK-Gel 30 cm x 7,8 mm) để kết nối (ví dụ Sigma Aldrich Part No. 808020) sử dụng các điều kiện được mô tả trong AOAC 2009.01).

Hình 3 - Sơ đồ lắp thiết bị hệ thống sắc ký lỏng dùng cho cột phân tích Sugar-Pak-khử ion bằng phương pháp thủ công

...

...

...

7.5.3  Hiệu chuẩn diện tích sắc đồ cần đo đối với SDFS

Sử dụng xyranh LC 100 µl (4.27), đưa mẫu vào vòng bơm 50 µl (4.21.2) với dung dịch chuẩn có thời gian lưu LC (3.15). Xác định điểm phân giới giữa DP 2 và 3 oligosaccharide (disaccharide sucrose và maltose so với oligosaccharides cao hơn). Xem Hình A.1 và Hình A.2.

7.5.4  Xác định hệ số đáp ứng (R_f) đối với D-glucose

Vì D-glucose cho đáp ứng RI của LC tương đương với R_f của các polysaccharide không phân hủy được tạo nên SDFS, nên LC được hiệu chuẩn bằng D-glucose và R_f được sử dụng để xác định khối lượng của SDFS. Đối với từng dung dịch nội chuẩn/D-glucose (3.17), sử dụng xyranh dung tích 100 µl (4.27), để đổ đầy vào vòng bơm 50 µl.

a) Phương pháp nội chuẩn

Ghi lại các giá trị diện tích pic của D-glucose và dung dịch nội chuẩn từ sắc ký đồ. Giá trị nghịch đảo của độ dốc thu được bằng cách so sánh tỷ lệ diện tích pic của D-glucose/diện tích pic của dung dịch nội chuẩn (trục y) với tỷ lệ khối lượng của D-glucose/khối lượng của nội chuẩn (trục x) là “Hệ số đáp ứng”. Xác định hệ số đáp ứng trung bình (R_f) (thường là 0,91 so với dung dịch nội chuẩn D-sorbitol).

Hệ số đáp ứng trung bình, R_f, được tính bằng Công thức (1):

(1)

...

...

...

S_IS  là diện tích pic của dung dịch nội chuẩn (D-sorbitol);

S_Glu  là diện tích pic D-glucose;

m_Glu  là khối lượng D-glucose chứa trong 1 ml dung dịch chuẩn, tính bằng miligam (m_Glu = 5 mg, 10 mg hoặc 20 mg);

m_IS  là khối lượng của dung dịch nội chuẩn có trong 1 ml dung dịch chuẩn nội gốc, tính bằng miligam (m_IS = 10 mg).

b) Phương pháp ngoại chuẩn

Thu lấy các giá trị diện tích pic của D-glucose từ ba sắc ký đồ. Hệ số đáp ứng trung bình (R_f), được tính bằng Công thức (2):

(2)

Trong đó

...

...

...

S_Glu  là diện tích pic D-glucose.

7.5.5  Lọc thu hồi, khử ion và phân tích LC

Chuyển phần dịch lọc 7.4 (c) của mẫu thử vào bình cô quay 1 L và cô đặc bằng máy cô quay (4.28) đến khô ở 50 °C. Hòa tan cặn trong 10 ml nước đã khử ion (3.7) và chuyển sang bình chứa kín, bảo quản ở 4 °C nếu có phương án bảo quản qua đêm trước khi khử ion. Khi thực hiện tiếp thì một nửa dịch lọc được cô đặc đến khô và hòa tan lại trong 5 ml nước. Điều này cho kết quả tương tự, nhưng giảm một nửa thời gian cô quay. Để khử ion bằng phương pháp thủ công, tiến hành theo 7.5.6. Để đồng thời khử ion và định lượng LC, tiến hành theo 7.5.7.

7.5.6  Khử ion của mẫu

Ly tâm hoặc lọc dung dịch mẫu rồi chuyển 2 ml lên đỉnh cột nhựa hỗn hợp và cho phép cột rửa giải ở khoảng 1 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml của máy cô quay (4.28). Khi mức chất lỏng giảm đến nút bông trên đỉnh cột thì tráng mẫu bằng 2 ml nước cất và cho dịch chảy qua nhựa. Thu lấy dịch rửa giải. Sau đó, thêm khoảng 20 ml nước cất lên đỉnh cột và rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml ở tốc độ khoảng 1 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải cho đến khi mức chất lỏng đạt đến đỉnh của nhựa trên cột. Làm bay hơi dung dịch ở 50 °C đến khô. Hòa tan mẫu bằng nước cất và thêm nước đủ đến 2 ml bằng cách xoay trong khoảng 2 min. Dùng pipet Pasteur chuyển mẫu vào ống bảo quản polypropylen.

7.5.7  Chuẩn bị mẫu để phân tích HPLC

Sử dụng xyranh dùng một lần dung tích 10 ml (4.26) và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (4.23) để chuyển dung dịch từ 7.5.5 hoặc 7.5.6.

7.5.8  Phân tích HPLC đối với dung dịch mẫu

Dùng xyranh (4.27) đổ đầy dịch chiết mẫu đã lọc vào vòng bơm 50 µl (4.21.2) trên hệ thống LC. Đối với các mẫu được khử ion bằng phương pháp thủ công (7.5.6) sau bước lọc (7.5.7), cho các dung dịch qua vòng bơm (4.21.2), trực tiếp lên cột Waters sugar-pak (4.21.3) bố trí như trong Hình 3. Đối với các mẫu được khử ion theo 7.5.5 sau bước lọc 7.5.7, áp dụng các dung dịch cho vòng bơm và cột bảo vệ khử muối (4.20), bố trí như trong Hình 4.

...

...

...

Xác định diện tích pic của S_DFS (S_SDFS) và dung dịch nội chuẩn nếu được sử dụng (S_IS) trong sắc ký đồ của dịch chiết mẫu

Ghi lại diện tích của tất cả các pic của DP lớn hơn điểm DP 2/DP 3 như S_SDFS. Ghi lại diện tích pic của dung dịch nội chuẩn là S_IS.

7.6  Xác định hàm lượng TDF

Hàm lượng TDF có thể xác định gián tiếp từ tổng hàm lượng IDF (xem 7.3) và SDF (xem 7.4 và 7.5) hoặc xác định trực tiếp (xem Phụ lục B).

8  Tính kết quả

8.1  Tính hàm lượng IDF

8.1.1  Đối với mẫu trắng

Khối lượng IDF của mẫu trắng, B₁, biểu thị bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (3);

...

...

...

Trong đó

B_R1 và B_R2  là khối lượng cặn của mẫu trắng, dùng cho phép xác định mẫu trắng IDF lặp lại tương ứng, tính bằng miligam (mg);

P_B và A_B  là khối lượng của protein và tro tương ứng, xác định được trên phần cặn của mẫu trắng thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg).

8.1.2  Đối với mẫu thử

Hàm lượng IDF của mẫu thử, X₁, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100g), được tính bằng Công thức (4);

(4)

Hàm lượng IDF của mẫu thử, X₁’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (5):

...

...

...

Trong đó:

R₁  là khối lượng thứ nhất của cặn IDF từ phần mẫu thử thứ nhất, m₁, tính bằng miligam (mg);

R₂  là khối lượng thứ hai của cặn IDF từ phần mẫu thử thứ hai, m₂, tính bằng miligam (mg);

m₁  là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, tính bằng gam (g);

m₂  là khối lượng phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g);

A  là khối lượng tro từ R₁, tính bằng miligam (mg);

P  là khối lượng protein từ R₂, tính bằng miligam (mg);

B₁  là khối lượng IDF của mẫu trắng, tính bằng miligam (mg).

8.2  Tính hàm lượng SDFP

...

...

...

Hàm lượng SDFP của mẫu trắng, B₂, biểu thị bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (6);

(6)

Trong đó

B_R1 và B_R2  là khối lượng cặn của mẫu trắng dùng cho phép xác định mẫu trắng SDFP lặp lại tương ứng, tính bằng miligam (mg);

P_B và A_B  là khối lượng của protein và tro xác định được trên phần cặn của mẫu trắng thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg) tương ứng.

8.2.2  Đối với mẫu thử SDFP

Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X₂, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), được tính bằng Công thức (7);

...

...

...

Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X₂’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (8):

(5)

Trong đó

R₁  là khối lượng thứ nhất của cặn SDFP từ phần mẫu thử thứ nhất, m₁, tính bằng miligam (mg);

R₂  là khối lượng thứ hai của cặn SDFP từ phần mẫu thử thứ hai, m₂, tính bằng miligam (mg);

m₁  là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, tính bằng gam (g);

m₂  là khối lượng phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g);

A  là khối lượng tro từ R₁, tính bằng miligam (mg);

...

...

...

B₂  là hàm lượng SDFP của mẫu trắng, tính bằng miligam (mg).

8.2.3  Tính hàm lượng SDFS

a) Phương pháp nội chuẩn

CHÚ THÍCH: Sorbitol có trong một số sản phẩm như đậu đỗ, táo. Nếu mẫu thử chứa sorbitol, sử dụng phương pháp nội chuẩn sẽ cho kết quả lượng SDFS thấp. Do đó nên sử dụng phương pháp ngoại chuẩn. Ngoài ra, dung dịch chuẩn nội vẫn được khuyến cáo làm chuẩn thời gian lưu.

Hàm lượng SDFS của mẫu thử, X₃, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) được tính bằng Công thức (9):

(9)

Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X₃’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (10):

...

...

...

Trong đó

R_f  là hệ số đáp ứng tính được trong 7.5.4;

m_IS  là khối lượng của dung dịch nội chuẩn có trong 1 ml mẫu (nghĩa là 10 mg/ml; thể tích mẫu cuối cùng, 10 ml);

S_SDFS  là diện tích pic của chất xơ hòa tan trong nước:ancol;

S_IS  là diện tích pic của nội chuẩn;

10  là hệ số chuyển đổi từ 1 ml đến 10 ml (thể tích mẫu cuối cùng);

100  là hệ số chuyển đổi sang 100 g mẫu;

m  là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, m₁ hoặc thứ hai, m₂, của mẫu có dịch lọc được cô đặc và được phân tích bằng LC, tính bằng gam (g).

b) Phương pháp ngoại chuẩn

...

...

...

(11)

Hàm lượng SDFS của mẫu thử, X₃’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (12):

(12)

Trong đó

(13)

m_Glu  là khối lượng của D-glucose có trong 1 ml dung dịch chuẩn tính bằng miligam (mg) (m_Glu = 5 mg, 10 mg hoặc 20 mg);

...

...

...

S  là diện tích pic của chất xơ hòa tan trong nước:ancol;

10  là hệ số chuyển đổi từ 1 ml đến 10 ml (thể tích mẫu cuối cùng);

100  là hệ số chuyển đổi sang 100 g mẫu;

M  là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, m₁ hoặc phần mẫu thử thứ hai, m₂, của mẫu có dịch lọc được cô đặc và được phân tích bằng LC, tính bằng gam (g).

8.2.4  Tính hàm lượng SDF

Hàm lượng SDF của mẫu thử, X₄, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), được tính bằng Công thức (14):

X₄ = X₂ + X₃

(14)

Hàm lượng SDF, X’₄, biểu thị bằng phần trăm (%), được tính bằng Công thức (15):

...

...

...

(15)

8.2.5  Tính hàm lượng TDF

a) Phương pháp gián tiếp

Hàm lượng TDF của mẫu thử, X’₅, biểu thị bằng phần trăm (%), được tính bằng Công thức (16):

X’₅ = X’₁ + X’₄

(16)

b) Phương pháp trực tiếp: xem Phụ lục B.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc ký đồ

...

...

...

Hình A.2 - Sắc ký đồ của SDFS điển hình trong mẫu trên cột Sugar-Pak được phân tích trước và sau khi sử dụng ống khử ion. Lưu ý khi không có mặt của pic ở 18,4 min chứng tỏ ống khử ion hoạt động bình thường và có xuất hiện pic ion ở 18,4 min thì phải thay ống

Phụ lục B

(Tham khảo)

Xác định TDF không tách riêng IDF và SDP

B.1  Cách tiến hành

a) Tạo kết tủa SDFP tran trong nước với sự có mặt của IDF

...

...

...

b) Chuẩn bị chén nung

Cân chén nung chứa Celite (xem 4.3), chính xác đến 0,1 mg. Làm ướt và phân bố lại Celite trong chén, sử dụng 15 ml etanol 78 % thể tích hoặc IMS (3.2) từ bình rửa. Dùng dụng cụ hút để chuyển Celite vào chén thành lớp, trộn đều. Loại bỏ dịch lọc này.

c) Lọc

Sử dụng chân không để lọc SDFP:IDF đã kết tủa từ phần nổi phía trên qua chén. Sử dụng bình rửa với etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2), chuyển tất cả các hạt còn lại vào chén. Giữ lại dịch lọc và nước rửa để xác định SDF có khối lượng phân tử thấp.

d) Rửa và giữ lại dịch lọc

Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Gộp dịch lọc từ ngay bước trước đó.

e) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C.

f) Làm nguội và cân chén trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa cặn xơ và Celite, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng chén rỗng (nghĩa là khối lượng của chén và Celite khô) để thu được khối lượng cặn.

g) Xác định hàm lượng protein và tro.

...

...

...

h) Tiến hành theo 7.5.5 để xác định SDFS.

B.2  Tính kết quả

B.2.1  Tính tỷ lệ SDFP:IDF

B.2.1.1  Tính khối lượng mẫu trắng

Khối lượng IDF của mẫu trắng, B, tính bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (B.1)

(B.1)

Trong đó

B_R1 và B_R2  là khối lượng cặn của mẫu trắng đối với hai phép xác định mẫu trắng lặp lại SDFP:IDF tương ứng, tính bằng miligam (mg), và

...

...

...

B.2.1.2  Tính tỷ lệ SDFP:IDF

- Tỷ lệ SDFP:IDF, X₆, biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) được tính bằng Công thức (B.2):

(B.2)

- Tỷ lệ SDFP:IDF, X₆’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (B.3):

(B.3)

Trong đó

R₁  là tỷ lệ SDFP:IDF của khối lượng cặn thứ nhất từ phần mẫu thử thứ nhất, m₁, tính bằng miligam (mg);

...

...

...

m₁  là tỷ lệ SDFP:IDF của phần mẫu thử thứ nhất, tính bằng gam (g);

m₂  là tỷ lệ SDFP:IDF của phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g);

A  là khối lượng tro từ R₁, tính bằng miiigam (mg);

P  là khối lượng protein từ R₂, tính bằng miligam (mg);

B  là khối lượng mẫu trắng.

B.2.3  Tính hàm lượng TDF

Hàm lượng TDF, X'₅, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (B.4):

X’₅ = X’₆ + X’₃

(B.4)

...

...

...

X’₆  là tỷ lệ SDFP:IDF, tính bằng phần trăm (%);

X’₃  là hàm lượng SDFS của mẫu thử, tính bằng phần trăm (%) [(xem 8.2.3 a) hoặc 8.2.3 b)].

Phụ lục C

(Tham khảo)

Khử ion bằng phương pháp thủ công

C.1  Phương pháp ban đầu

Cột 1 - 10 g nhựa Ambersep 200 (H^+), khả năng trao đổi ion (dữ liệu về khả năng trao đổi RH do nhà sản xuất cung cấp) 1,6 meq/ml (min), hoặc tương đương.

Cột 2 -10 g nhựa Amberlite FPA53 (OH^-), 1,6 meq/ml (min) hoặc tương đương được nhồi trong các cột riêng biệt [bình hứng sạch dùng để chiết (15 ml) (3.19)] để phân tích từng phần mẫu thử. Trước khi kết nối các cột, rửa nhựa trong từng cột với đủ nước để có được giá trị pH từ 4 đến 7 đối với cột thứ nhất và từ 7 đến 8 đối với cột thứ hai.

...

...

...

Trộn khoảng 4 g nhựa Ambersep 200 (H^+) hoặc tương đương, 1,6 meq/ml (phút) hoặc tương đương với khoảng 4 g nhựa Amberlite FPA53 (OH^-), 1,6 meq/ml (min) hoặc tương đương có khả năng trao đổi ion (dữ liệu về khả năng trao đổi R-OH do nhà sản xuất cung cấp), trong 100 ml cốc và hồ nhão với lượng nước cất tối thiểu. Rót hỗn hợp này vào cột sắc ký dùng một lần Bio-Rad Econo-Pac (Cat. No. 732-1010) được gắn với khóa Allc One stopcock (Cat. No. 211524). Nút miếng bông lên đỉnh cột và rửa nhựa với 20 ml nước cất. Cột này sau đó sẵn sàng để sử dụng.

Nếu sử dụng nhựa khác, xác định rằng carbohydrat không được nhựa giữ lại bằng cách chuẩn bị dung dịch thử bao gồm 1 ml dung dịch nội chuẩn 100 mg/ml (3.16) và 2,5 ml fructooligosaccharide 10 mg/ml được pha loãng thành 10 ml. Thêm 2 ml dung dịch này vào nhựa đã khử ion hỗn hợp (khoảng 8 g) như 7.5.6. Khôi phục các dung dịch chuẩn nội bộ và các fructooligosaccharide phải phù hợp với các dung dịch bơm trực tiếp vào LC.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng D.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với IDF

Mẫu/thông số

A

...

...

...

C

D

E

F

G

H

Số lượng phòng thử nghiệm

14

15

...

...

...

15

13

13

12

13

Giá trị trung bình, %

25,74

4,79

9,23

...

...

...

8,26

11,63

11,52

9,90

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,52

0,18

0,71

0,13

...

...

...

0,48

0,33

0,29

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

1,23

0,47

2,24

0,42

0,48

...

...

...

1,21

0,77

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

2,03

3,76

7,67

12,25

2,26

4,11

...

...

...

2,98

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R

4,76

9,82

24,35

39,64

5,81

9,65

10,53

...

...

...

Chỉ số HorRat

1,94

3,11

8,51

9,98

2,00

3,49

3,80

2,75

...

...

...

Bảng D.2 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với SDF

Mẫu/thông số

A

B

C

D

E

F

G

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

14

14

15

15

14

13

15

13

...

...

...

3,80

5,58

17,32

10,74

12,94

4,56

11,29

8,30

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

...

...

...

0,28

1,03

0,46

0,50

0,83

0,71

0,51

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

0,99

...

...

...

1,30

1,12

1,52

1,66

1,61

1,33

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

11,71

5,10

...

...

...

4,33

3,86

18,10

6,29

6,18

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

26,20

15,20

7,53

...

...

...

11,73

36,40

14,25

16,07

Chỉ số HorRat

8,01

4,92

2,89

3,74

...

...

...

11,44

5,13

5,53

Bảng D.3 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với TDF

Mẫu/thông số

A

B

C

...

...

...

E

F

G

H

Số lượng phòng thử nghiệm

15

15

15

15

...

...

...

13

14

13

Giá trị trung bình, %

29,90

10,45

26,55

11,79

21,37

...

...

...

23,71

18,40

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,86

0,47

1,39

0,49

0,52

1,41

...

...

...

0,64

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

2,05

0,95

2,74

1,10

1,72

2,37

3,14

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

2,88

4,51

5,25

4,17

2,43

8,60

3,65

3,47

...

...

...

6,85

9,11

10,31

9,30

8,04

14,48

13,23

8,47

Chỉ số HorRat

...

...

...

3,24

4,22

3,37

3,19

5,51

5,33

3,28

Bảng D.4 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với phương pháp đo trực tiếp TDF

...

...

...

A

B

C

D

E

F

G

H

Số lượng phòng thử nghiệm

...

...

...

8

9

9

9

7

9

9

Giá trị trung bình, %

28,08

...

...

...

24,60

11,00

21,21

16,47

21,27

16,47

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

1,26

0,41

...

...

...

0,39

1,11

0,72

1,19

1,16

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

1,31

1,24

1,95

...

...

...

2,30

5,27

2,10

2,58

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

4,50

4,16

2,83

3,57

...

...

...

4,38

5,61

7,04

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

4,67

12,41

7,95

23,11

10,86

...

...

...

9,89

15,66

Chỉ số HorRat

1,93

4,39

3,22

8,29

4,30

12,20

...

...

...

5,97

Bảng D.5 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối SDF được đo bằng khử ion

Mẫu/thông số

A

B

C

D

E

...

...

...

G

H

Số lượng phòng thử nghiệm

6

6

6

6

6

6

...

...

...

6

Giá trị trung bình, %

3,45

4,87

16,29

8,60

11,93

2,95

10,98

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,34

0,29

0,58

0,49

0,24

0,16

0,24

0,26

...

...

...

0,64

0,49

1,24

1,99

0,83

0,49

0,40

1,07

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

...

...

...

5,94

3,55

5,73

2,00

5,28

2,18

3,64

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

18,63

...

...

...

7,60

23,12

6,96

16,73

3,64

15,08

Chỉ số HorRat

5,61

3,21

...

...

...

7,99

2,53

4,92

1,31

5,07

Bảng D.6 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với TDF (tổng IDF và SDF) được đo bằng khử ion

Mẫu/thông số

A

...

...

...

C

D

E

F

G

H

Số lượng phòng thử nghiệm

6

6

...

...

...

4

6

6

5

6

Giá trị trung bình, %

29,65

9,95

26,96

...

...

...

20,47

15,06

23,04

17,43

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

0,73

0,36

0,73

0,27

...

...

...

0,43

0,25

0,24

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

1,29

0,66

2,41

0,37

0,90

...

...

...

1,71

0,77

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

2,47

3,58

2,70

2,42

1,58

2,87

...

...

...

1,36

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

4,33

6,62

8,95

3,33

4,40

7,67

7,40

...

...

...

Chỉ số HorRat

1,81

2,34

3,67

1,20

1,73

2,88

2,97

1,69

...

...

...

Bảng D.7 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với SDF được tính bằng phương pháp ngoại chuẩn

Mẫu/thông số

A

B

C

D

E

F

G

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

11

12

12

12

12

11

11

10

...

...

...

3,94

5,49

16,04

10,06

12,52

3,92

11,34

8,09

Độ lệch chuẩn lặp lại, S_r

...

...

...

0,54

1,48

0,81

0,67

0,69

0,44

0,63

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R

1,00

...

...

...

2,02

1,81

2,10

1,20

0,95

1,99

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr

11,42

9,92

...

...

...

8,06

5,37

17,58

3,93

7,81

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R

25,40

20,20

12,62

...

...

...

16,74

30,58

8,39

24,58

Chỉ số HorRat

7,80

6,53

4,79

6,35

...

...

...

9,39

3,02

8,42