Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 1023:1991 về Thuốc và dụng cụ y tế - Phương pháp thử vô khuẩn

• Số hiệu: TCVN1023:1991
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Y tế
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 1991

STT	Loại mẫu thử	Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy
1	Dung dịch thuốc  tiêm trong 1 đơn vị đóng gói dưới 1 ml Từ 1 ml đến 4 ml Từ 4 ml đến 20 ml Từ 20 ml đến 100 ml Lớn hơn 100 ml	Toàn bộ 1 đơn vị đóng gói 1/2 đơn vị đóng gói 2 ml 2 ml đến10 ml 1/2 đơn vị đóng gói
2	Dung dịch thuốc  đau mắt và các chế phẩm lỏng không tiêm	5 ml đến10 ml của dung dịch đã hoà loãng đến 10 lần (thể tích/thể tích) bằng dung môi thích hợp nêu trên (2.3)
3	Những chế phẩm là chất rắn, dịch treo, nhũ, dịch, kem hoặc thuốc mỡ	0,5 g đến 1 g của dung dịch đã hoà loãng với tỉ lệ 1 % (khối lượng/thể tích) bằng dung môi thích hợp nêu trên (2.3).

3.3 Kỹ thuật thử: dùng một dung môi A ( 2.3) vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng chế phẩm cần thử như quy định ở Bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc.Lấy màng lọc ra khỏi giá đỡ trong phễu lọc. Lấy kéo cắt màng lọc thành 2 phần, nhúng chìm vào

2 loại môi trường. ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 20 ^OC đến 35 ^OC, ủ môi trường phát hiện nấm mốc ở 20 ^OC đến 25 ^OC. Thời gian ủ ít nhất là 7 ngày.

Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây chuyền, túi lọc máu …) dùng 100 ml dung môi B cho chảy qua thiết bị.

Hứng dung môi ấy, rót lên màng lọc đã được thấm ướt bằng dung môi A rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở trên.

4 Tiến hành thử theo phương pháp nuôi cấy trực tiếp

4.1 Dụng cụ gồm bơm tiêm, pipét, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường phải được tiệt khuẩn trước khi dùng.

4.2 Lượng mẫu thử cần dùng để thử nghiệm

Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo quy định ở Bảng 2.

Bảng 2

...

...

...

Loại mẫu thử

Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy

Thể tích tối thiểu môi trường nuôi cấy

Ghi chú

1

Chế phẩm là chất lỏng trong 1 đơn vị đóng gói dưới 1 ml

Toàn bộ một đơn vị đóng gói

15 ml

Nếu chất lỏng là dầu hay dung dịch dầu phait thêm vào môi trường 1 % polyethoxyetanol

...

...

...

Từ 1 ml đến 5 ml

Từ 5 ml đến 20 ml

Từ 20 ml đến 50 ml

Từ 50 ml đến 100 ml

1/2 đơn vị đóng gói

2 ml

5 ml

10 ml

15 ml

...

...

...

40 ml

80 ml

Hoặc 1 % polysorbat để nhũ hoá

2

Chế phẩm là chất rắn thuốc mỡ hay kem, trong một đơn vị đóng gói dưới 50 mg

Từ 50 mg đến 200 mg

Lớn hơn 200 mg

Toàn bộ 1 đơn vị đóng gói

1/2 khối lượng

...

...

...

Nếu mẫu thử là thuốc mỡ hay kem thì cần hoà loãng với dung môi B theo tỷ lệ 1/10 (khối lượng/thể tích) trước khi cấy vào môi trường.

4.3 Kỹ thuật thử

Dùng bơm tiêm hoặc pipét lấy chế phẩm cấy vào 2 loại môi trường theo số lượng quy định ở Bảng 2. Nếu chế phẩm là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trường và chú ý lắc để chế phẩm phân tán đều trong môi trường. ủ môi trường phát hiện vi khuẩn từ 30 ^OC đến 35 ^OC, ủ môi trường để phát hiện nấm mốc từ 20 ^OC đến 25 ^OC. Thời gian ủ ít nhất là 7 ngày. Nếu chế phẩm làm đục môi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trường 3 ngày đến 7 ngày, nên chuyển một phần nhỏ môi trường này sang một loạt môi trường mới cùng loại. Tiếp tục ủ các ống môi trường đã cấy lại ít nhất 7 ngày.

Khi mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật … nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ chế phẩm vào 100 ml môi trường tương ứng. Khi chế phẩm là dụng cụ (dây chuyền, ống lọc máu …) dùng dung môi A hoặc B cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa ấy, mang cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trường nuôi cấy. ủ môi trường như đã ghi trên.

5 Theo dõi và đánh giá kết quả

Trong suốt thời gian ủ hàng ngày phải quan sát các môi trường đã cấy màng lọc hoặc chế phẩm.

− Nếu không thấy có vi khuẩn hoặc nấm mốc mọc trong suốt thời gian quy định, chế phẩm được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn;

− Nếu thấy có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm mốc mọc, cần phải:

...

...

...

+ Thử lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc.

Tiến hành phân lập so sánh với vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường cấy lại.

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hay nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần đầu, chế phẩm được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hay nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi. Nếu không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), chế phẩm được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc) mọc ở lần lặp lại này, chế phẩm được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.

PHỤ LỤC

Cách pha chế và kiểm tra chất lượng của môi trường

1 Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

1.1 Môi trường thioglycolat

...

...

...

L.Cystin

0,5 g

Natriclorua

2,5 g

Dextrose (C₆H₁₂O₆.H₂O)

5,5 g

Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15 %)

0,75 g

Cao men bia (có khả năng tan trong nước)

...

...

...

Natrithioglycolat hoặc

0,5 g

Axit thioglycolic

0,3 g

Resazurin (dung dịch 1 % mới pha)

10 ml

Nước cất

1000 ml

pH sau khi tiệt trùng

...

...

...

Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên trừ thioglycolat và resazurin trong cối nghiền, thêm vào 1 lít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp, thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp ở nồi cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm natrithioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyt 1 N điều chỉnh sao cho môi trường sau khi tiệt trùng có pH = 7,1 ± 0,2. Đun nóng lại dung dịch, tránh đun sôi, lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch resazurin trộn đều, đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp đem hấp tiệt trùng ở 121 ^OC trong 18 phút đến 20 phút. Lấy ra làm lạnh nhanh tới 25 ^OC tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 20 ^OC đến 30 ^OC tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc bình) môi trường có mầu hồng, môi trường sẽ không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất mầu rồi mang làm lạnh đột ngột. Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môi trường phục hồi lần 2. Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3 tuần.

1.2 Môi trường thioglycolat không có thạch

Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao.

L.Cystin

0,5 g

Natriclorua

2,5 g

Dextrose (C₆H₁₂O₆.H₂O)

5,5 g

...

...

...

 5,5 g

Casein pancreatic

15,0 g

Natrithioglycolat hoặc

0,5 g

Axit thioglycolic

0,3 g

Nước cất

1000 ml

...

...

...

7,1 ± 0,2

Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy đều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyt 1 N (TT) điều chỉnh để cho pH sau khi tiệt trùng đạt 7,1 ± 0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp. Hấp tiệt trùng 121 ^OC trong khoảng 18 phút đến 20 phút. Sau khi tiệt trùng mang làm lạnh ngay tới 25 ^OC môi trường không được đun nóng trở lại.

2 Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm

Môi trường Soybean − casein

Casein pancreatic

17,0 g

Bột papaic soybean

3,0 g

Natriclorua

...

...

...

Dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

2,5 g

Dextrose (C₆H₁₂O₆.H₂O)

2,5 g

Nước cất

1000 ml pH

sau khi tiệt trùng

7,1 ± 0,2

Hoà tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng NaOH 0,1 N (TT) để điều chỉnh (nếu cần) để cho pH sau khi tiệt trùng ở trong khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt trùng 121 ^OC trong khoảng 20 phút.

...

...

...

3.1 Độ vô trùng

Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ 30 ^OC đến 35 ^OC trong 4 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kị khí. ủ ở nhiệt độ 20 ^OC đến 25 ^OC đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy nấm mốc − ít nhất 7 ngày. Các loại môi trường phải không được có vi khuẩn nấm mốc mọc.

3.2 Khả năng dinh dưỡng

Cấy vào mỗi loại môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn sau:

− Loại vi khuẩn hiếu khí dùng staphylococus aureus (ATCC 12228);

− Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus Subtilis (ATCC 6633);

− Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes (ATCC 11437);

− Loại nấm dùng candida albicans (ATCC 10231).

Mỗi loại chủng chỉ thị đã được cấy vào loại môi trường tương ứng, mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 7 ngày. Trên mỗi loại môi trường sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt.

...

...

...

Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất người ta đã cho thêm những chất bảo quản, hoặc ở những chế phẩm mới, ảnh hưởng của chế phẩm đến sự phát triển của vi khuẩn, nấm chưa xác định nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vi khuẩn, nấm mốc.

3.3.1 Đối với vi khuẩn kỵ khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí clostridium sporogenes (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào clostridium sporogenes. Đem ủ tất cả các ống ở 30 ^OC đến 35 ^OC ít nhất 7 ngày.

3.3.2 Đối với vi khuẩn hiếu khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng cấy vào mỗi ống 100 tế bào staphylococus aureus (khoảng 0,1 ml nhũ dịch vi khuẩn đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm và cũng cấy vào mỗi ống 100 tế bào staphylococus aureus. Đem ủ tất cả các ống ở 30 ^OC đến 35 ^OC ít nhất 7 ngày.

3.3.3 Đối với nấm mốc

Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm mốc, hai ống dùng làm chứng cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans. Hai ống kiểm tra cấy 100 tế bào Candida albicans và một lượng chế phẩm bằng nhau. ủ tất cả các ống ở 20 ^OC đến 25 ^OC trong ít nhất 7 ngày.

3.3.4 Đánh giá kết quả

Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt (dễ dàng và phong phú), đối với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng. Chế phẩm không có tác dụng ức chế. Nếu trên các ống môi trường có chế phẩm mà vi khuẩn, nấm mọc yếu, chậm phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt. Chế phẩm có tác dụng ức chế. Ta phải loại bỏ tác dụng này.

...

...

...