Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-7:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán

• Số hiệu: TCVN8400-7:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-7:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 7: BỆNH ĐẬU CỪU VÀ ĐẬU DÊ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 7: Sheep pox and goat pox disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các nguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp hoặc thất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra môi trường.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đậu trên cừu và dê.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

...

...

...

Bệnh truyền nhiễm gây ra bởi các vi rút đậu cừu (SPPV) thuộc giống Capripoxvirus của họ Poxviridae.

2.2. Bệnh đậu dê (goat pox disease)

Bệnh truyền nhiễm gây ra bởi các vi rút đậu dê (GTPV) thuộc giống Capripoxvirus của họ Poxviridae.

CHÚ THÍCH: Không có sự khác biệt đáng kể về mặt lâm sàng giữa bệnh gây ra do vi rút đậu cừu và vi rút đậu dê

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần không chứa DNase hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

Xem Phụ lục A về mô tả tất cả các dung dịch thuốc thử.  Dung dịch axit sulfuric (H2SO4) 1 N

- Axeton (C3H6O) đậm đặc.

- Etanol đậm đặc (99,99 %).

...

...

...

- Kháng nguyên chuẩn vi rút đậu dê

- Kháng thể thỏ kháng vi rút đậu dê.

- Kháng thể dê kháng vi rút đậu dê.

- Chất gắn kết cho ELISA kháng nguyên (Rabbit anti-goat IgG-horseradish peroxidase conjugate)

- Chất gắn kết cho phương pháp kháng thể huỳnh quang (anti-GTPV gamma-globulin conjugated to fluorescein isothiocyanate)

- Chất gắn kết cho phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (anti-rabbit gamma-globulin conjugated to FITC).

- Etylen diamin tetra-axit axetic (EDTA).

- Proteinase K.

- Phenol.

...

...

...

- Isoamylalcohol.

- Bột agarose.

- Dung dịch TAE.

- Etidi bromua.

- Thuốc nhuộm, thang chuẩn dùng cho điện di sản phẩm PCR.

- Enzym EcoRI.

- Kít chiết tách ADN.

- Kít nhân gen.

- Primer và probe phát hiện ADN của vi rút đậu dê.

...

...

...

- Huyết thanh thai bê (FCS).

- Tế bào tinh hoàn hoặc thận cừu.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và cụ thể sau đây:

- Tủ lạnh.

- Tủ ấm, tủ ấm CO2.

- Tủ sấy.

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 10-4 g.

- Nồi hấp.

...

...

...

- Máy ly tâm lạnh.

- Máy khuấy từ.

- Kính hiển vi đảo ngược (dùng soi tế bào).

- Kính hiển vi huỳnh quang

- Máy đọc ELISA.

- Máy PCR/Realtime PCR.

- Thiết bị điện di và chụp ảnh điện di.

- Bộ đồ mổ tiểu gia súc.

- Đĩa ELISA.

...

...

...

- Ống PCR 0,2 ml.

- Bộ cối chày sứ.

- Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm.

- Bộ micropipet và đầu tip.

- Bông cồn.

- Lọ nuôi tế bào loại T25, T75.

- Đĩa nuôi tế bào loại 6 giếng.

- Lam kính, lá kính.

- Giấy dán nhãn.

...

...

...

- Bút chì mỡ ghi lam kính.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

Vi rút đậu cừu và đậu dê gây bệnh cho cả cừu và dê ở mọi lứa tuổi, mọi giống và không phân biệt giới tính. Dê, cừu chưa từng phơi nhiễm với vi rút đậu cừu và đậu dê, khi nhiễm bệnh có tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết rất cao, có thể lên tới 100 %. Ở những vùng bệnh đậu cừu và đậu dê đã lưu hành thành dịch địa phương thì tỷ lệ mắc còn khoảng 5 % đến 10 % và tỷ lệ chết rất thấp, do động vật mắc bệnh sau khi hồi phục đã sinh kháng thể kháng lại vi rút ngoài tự nhiên .

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng đặc trưng là sốt cao từ 40 oC đến 41 oC, ở trên da có xuất hiện các nốt đậu kích thước từ 0,5 cm đến 1 cm, đặc biệt là các vùng mũi miệng, tai, cổ, bụng, mặt sau đuôi, và chân, các hạch lympho bề mặt sưng đặc biệt là hạch sau hầu, chảy nước mắt, nước mũi, nước dãi nhiều và có lẫn mủ do các nốt đậu trong niêm mạc mắt, mũi, mồm bị loét. Con bệnh thở khó và có tiếng kêu do hạch sau hầu sưng gây áp lực lên đường hô hấp.

Thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 1 tuần đến 2 tuần, sau đó bắt đầu bằng những triệu chứng sốt, thở khó và kém ăn. Một đến hai ngày tiếp theo, các nốt đậu xuất hiện trên da và phát triển theo một quá trình như sau: trước tiên các nốt thâm xuất hiện, dần dần các nốt này sần lên rồi phát triển thành mụn nước, tiếp đến là mụn mủ và kết thúc bằng việc tạo thành các vảy đậu. Vảy đậu có thể mang mầm bệnh trong nhiều tháng. Trong trường hợp bệnh cấp tính, con vật có thể chết mà không có tổn thương trên da.

Động vật non, động vật già hay con cái đang tiết sữa có thể mắc bệnh ở thể nặng hơn do sức đề kháng yếu. Khi đó, một số triệu chứng khác có thể quan sát được là dê, cừu non đang bú sữa có nhiều dịch nhày lẫn mủ tiết ra ở miệng và mũi, viêm phổi nặng, con cái bị sưng bầu vú và sảy thai, lợi và lưỡi có nhiều nốt loét.

...

...

...

5.1.3.1 Bệnh tích đại thể

Phổi bị xuất huyết, bề mặt phổi có nhiều nốt đậu màu trắng hoặc đỏ to, kích thước có thể lên tới 1 cm. Khí quản chứa nhiều dịch màu hồng lẫn bọt khí. Niêm mạc đường tiêu hóa, hô hấp trông như bị hoại tử. Tất cả các hạch trong cơ thể sưng to và phù. Trên niêm mạc dạ múi khế, thỉnh thoảng trên vách dạ cỏ, ruột già, lưỡi, vòm miệng, khí quản và thực quản có các nốt đậu, có thể bị loét. Quá trình xuất hiện của các nốt đậu trên niêm mạc đường tiêu hóa, hô hấp xảy ra tương tự như ở ngoài da.

5.1.3.2 Bệnh tích vi thể

Kiểm tra mô học bằng phương pháp nhuộm tiêu chuẩn H&E và soi kính hiển vi thấy:

Ở các các vảy đậu, nốt đậu trong giai đoạn cấp tính, có sự thâm nhiễm tế bào, viêm huyết quản và phù. Ở các tổn thương sớm có sự tích tụ của các tế bào bạch huyết, tương bào quanh huyết quản, lúc đầu chỉ có các đại thực bào, bạch cầu hạt (trung tính và ái toan) thâm nhiễm vào, sau đó khi tổn thương tiếp tục tiến triển, nhiều đại thực bào hơn và các tế bào bạch huyết và tương bào được thâm nhiễm vào. Huyết quản bị viêm kèm theo triệu chứng huyết khối và nhồi huyết dẫn đến phù và hoại tử

Ở lớp da trong chân bì có những tế bào lớn hình sao có các thể bao hàm trong bào tương không rõ ràng, ái toan và nhân rỗng. Lớp biểu bì bị dày lên, bị á sừng và dày sừng.

Ở các tổ chức khác cũng có những thay đổi tương tự, nhất là sự thâm nhiễm tế bào và viêm huyết quản. Ở đường hô hấp trên có các tổn thương loét.

5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

...

...

...

- Vảy đậu, nốt đậu trên da, trong phổi: lấy trong tuần đầu tiên xuất hiện triệu chứng lâm sàng, trước khi có sự phát triển kháng thể trung hòa, để phân lập hoặc xét nghiệm ELISA đối với vi rút. Mẫu lấy sau khi có kháng thể trung hòa, chỉ nên để xét nghiệm PCR.

- Dịch tiết từ mắt, mũi và nước dãi được lấy bằng tăm bông: thời gian lấy mẫu giống như đối với mẫu vảy đậu, nốt đậu.

- Máu (được chống đông bằng heparin hoặc EDTA) lấy ở giai đoạn nhiễm trùng huyết để phân lập vi rút, xét nghiệm ADN của vi rút.

5.2.1.2 Bệnh phẩm cho phát hiện kháng thể

Huyết thanh lấy ở động vật mắc bệnh sau khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng từ 10 ngày trở đi.

5.2.1.3 Bảo quản

Trong quá trình vận chuyển, tất cả các loại mẫu phải được giữ ở nhiệt độ từ 2 oC đến 4 oC, ngoài ra mẫu là các vảy đậu, nốt đậu hoặc mẫu là swab phải được giữ trong môi trường vận chuyển [PBS (A.2) có chứa 1 % BSA, 1 % dung dịch kháng khuẩn (A.1)], các mẫu tổ chức có nốt đậu nếu dùng cho xét nghiệm kháng thể huỳnh quang thì không cần giữ trong môi trường bảo quản, chỉ cần giữ ở nhiệt độ lạnh 2 oC đến 4 oC trong 24 h.

Tại phòng thí nghiệm, mẫu để phân lập hoặc xét nghiệm vi rút phải được giữ ở -20 oC, nếu để lâu (hơn 1 tuần) chưa xét nghiệm phải giữ ở -70 oC, huyết thanh giữ ở 4 oC trong vòng 1 tuần và -20 oC nếu để lâu hơn.

5.2.2 Phát hiện kháng nguyên

...

...

...

- Mẫu là các vảy đậu, nốt đậu lấy từ trên da hoặc trong phổi: lấy từ 1 g đến 2 g, cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ vô trùng với dung dịch PBS (A.2) thành huyễn dịch 10 %, bổ sung 0,1 ml dung dịch kháng khuẩn (A.1). Thực hiện quy trình đông (-70 oC) và tan 3 lần đối với huyễn dịch. Ly tâm ở 600g trong 10 min rồi thu lấy dịch nổi để xét nghiệm vi rút bằng các phương pháp phân lập vi rút trên tế bào, ELISA phát hiện kháng nguyên và ADN của vi rút bằng PCR hoặc Real-time PCR.

- Dịch mắt, mũi, mồm được lấy bằng tăm bông và giữ trong môi trường bảo quản: lắc mạnh và đều, rồi hút lấy môi trường bảo quản đem chiết tách ADN để xét nghiệm bằng PCR hoặc lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm để sử dụng cho phân lập vi rút.

- Máu (có 5 % chất chống đông heparin hoặc EDTA): có thể dùng trực tiếp để xét nghiệm ADN của vi rút bằng phương pháp PCR/real-time PCR hoặc tách các tế bào bạch huyết cho phân lập vi rút bằng cách ly tâm từ 5 ml đến 8 ml máu chống đông ở gia tốc 600g trong 15 min, hút phần dịch trong giữa tương bào và hồng cầu cho vào 5 ml nước lạnh. Đợi 30 s, cho 5 ml môi trường tăng trưởng (DMEM) lạnh (từ 0 oCđến 4 oC) vào và trộn đều. Ly tâm hỗn dịch 2 lần ở 600gtrong 15 min. Loại bỏ dịch nổi, thu lấy phần cặn, rồi hòa với 5 ml môi trường tăng trưởng để dùng cho phân lập.

5.2.2.2 Phân lập và giám định vi rút

5.2.2.2.1 Phân lập vi rút

a) Chuẩn bị tế bào

Các loại tế bào có nguồn gốc từ bò, cừu, dê đều có thể sử dụng để phân lập, nuôi cấy vi rút đậu dê, đặc biệt các tế bào tinh hoàn cừu, thận cừu sơ cấp hoặc thứ cấp dùng để phân lập, nuôi cấy tốt nhất. Phụ lục B quy định phương pháp chuẩn bị tế bào tinh hoàn cừu.

Dùng môi trường tăng trưởng (DMEM) có bổ sung hepes, 10 % FCS và dung dịch kháng khuẩn (xem A1) để nuôi tế bào trong chai T25 cho đến khi phát triển thành một lớp đơn và bao phủ 90 % diện tích nuôi cấy thì đem sử dụng.

b) Gây nhiễm bệnh phẩm cho tế bào

...

...

...

5.2.2.2.2 Giám định vi rút

Những chai tế bào có CPE được giám định vi rút đậu cừu và đậu dê bằng phương pháp PCR.

5.2.2.3 Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp ELISA

Dùng đĩa ELISA polysteryne 96 giếng (ví dụ, của hãng Nunc, Maxisorp) để thực hiện phản ứng ELISA .

Nhỏ vào mỗi giếng của đĩa ELISA 75 µl kháng thể thỏ kháng vi rút đậu dê pha trong dung dịch đệm phủ đĩa (A.5), tỷ lệ 1:25, rồi ủ đĩa ở 4 oC qua đêm.

Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBST (A.3), 300 µl/giếng/lần.

Nhỏ 50 µl đối chứng âm (môi trường tế bào không nhiễm vi rút hoặc dịch nổi mẫu mô bình thường) vào các giếng A1 và A2 .

Nhỏ 50 µl đối chứng dương (môi trường tế bào đã nhiễm vi rút đậu hoặc dịch nổi mẫu mô nhiễm vi rút) vào các giếng A3 và A4.

Nhỏ 50 µl mẫu kiểm tra (dịch nổi huyễn dịch bệnh phẩm, môi trường tế bào đã cấy bệnh phẩm) vào các giếng còn lại trong đĩa, làm lặp lại trong 2 giếng.

...

...

...

Rửa đĩa như trên.

Nhỏ vào tất cả các giếng, 75 µl kháng thể phát hiện (kháng thể chế trên dê sử dụng kháng nguyên vi rút đậu dê thuần khiết), pha 1:100 trong đệm ngăn chặn (A.4).

Ủ và lắc đĩa ở 37 oC trong 60 min.

Rửa đĩa như trên.

Nhỏ 75 µl chất gắn kết (rabbit anti-goat IgG-horseradish peroxidase conjugate) pha 1:5000 trong đệm ngăn chặn (A.4) vào tất cả các giếng.

Ủ và lắc đĩa ở 37 oC trong 75 min.

Rửa đĩa như trên.

Nhỏ 75 µl cơ chất (A.6) vào tất cả các giếng.

Ủ đĩa ở 37 oC trong 15 min.

...

...

...

Phân tích kết quả: Mẫu dương tính khi có giá trị OD lớn hơn giá trị OD ngưỡng. 
Giá trị OD ngưỡng = OD đối chứng âm x 1,2 (20 % cao hơn giá trị OD đối chứng)

Với giá trị ngưỡng được tính như trên, phương pháp có độ nhạy từ 70 % đến 86 % và độ đặc hiệu từ 80 % đến 100 %.

5.2.2.4 Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp kháng thể huỳnh quang

5.2.2.4.1 Khái quát

Phương pháp kháng thể huỳnh quang là phương pháp nhanh, có thể sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản cắt lạnh của các nốt đậu trên da, phổi. Tiêu bản kiểm tra được chuẩn bị từ nốt đậu trên da, phổi được cắt lạnh hoặc lamen tế bào.

5.2.2.4.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp

a) Chuẩn bị tiêu bản

Dùng máy cắt lạnh để cắt các tổ chức bệnh phẩm (có các nốt đậu) thành những lát mỏng không dày hơn 8 µm, rồi dán lên lam kính, mỗi lam kính từ 2 lát đến 3 lát. Dùng bút chì mỡ đánh dấu ký hiệu bệnh phẩm, chủng loại tổ chức lên phía góc trái của lam kính. Để tiêu bản khô tự nhiên.

Nếu không có máy cắt lạnh thì dùng phương pháp in tổ chức: dùng dao sắc mỏng cắt dứt khoát vào miếng tổ chức bệnh phẩm, dùng panh nhọn gắp miếng tổ chức thấm trên giấy lọc cho đến hết máu, ấn nhẹ mặt cắt tổ chức lên lam kính, dùng bút đánh dấu, để khô tự nhiên.

...

...

...

CHÚ Ý: Cần có 2 lamen đối chứng tế bào khỏe, 2 lamen đối chứng tế bào nhiễm vi rút, đánh dấu các lamen.

b) Cố định tiêu bản

Đặt các lam kính từ tổ chức bệnh phẩm vào cốc nhuộm, đổ axeton vào. Các lamen từ môi trường tế bào có cấy bệnh phẩm thì để nguyên trong ống nuôi cấy, đổ bỏ môi trường đi, cho axeton vào cố định, để ở -20oC trong 1 h hoặc ở nhiệt độ phòng trong 30 min. Sau đó nhấc tiêu bản ra để khô tự nhiên. Đổ axeton vào bình sạch để tái sử dụng.

c) Nhuộm mẫu thử

Dùng chất gắn kết (anti-GTPV gamma-globµlin conjugated to fluorescein isothiocyanate) đã pha loãng ở nồng độ sử dụng (ít nhất là 1/30) nhỏ lên các tiêu bản sao cho thuốc nhuộm phủ kín tổ chức. Đặt các tiêu bản vào khay ấm (giữ cho bề mặt luôn ướt trong suốt quá trình nhuộm) để vào tủ ấm 37 oC trong 30 min.

d) Rửa bỏ chất gắn kết

Lấy tiêu bản ở tủ ấm ra, rửa nhẹ tiêu bản bằng dung dịch PBS (A.2) cho sạch chất gắn kết, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc có chứa PBS (A.2) và ngâm rửa từ 2 lần đến 3 lần, mỗi lần 5 min. Sau lần cuối cùng, tráng lại bằng nước.

Đặt nghiêng tiêu bản trên giấy lọc hoặc thấm nhẹ cho khô.

Nhỏ một giọt dung dịch đệm glyxerin (A.8) lên lam kính tiêu bản (chuẩn bị từ tổ chức bệnh phẩm) rồi đậy lamen sạch lên hoặc nhỏ một giọt dung dịch đó lên phiến kính sạch rồi đậy lamen tế bào lên.

...

...

...

Dùng kính hiển vi huỳnh quang. Đọc các mẫu đối chứng trước, các mẫu bệnh phẩm sau. Lúc đầu sử

dụng vật kính 10 để quan sát vi trường sau đó dùng vật kính 40 để quan sát kỹ các tế bào phát huỳnh quang.

CHÚ Ý: Khi sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang nhất thiết phải có đối chứng. Các đối chứng trong phương pháp huỳnh quang trực tiếp:

+ Đối chứng âm tính (-): tiêu bản tế bào có nguồn gốc dê, cừu hoặc tiêu bản tổ chức khỏe mạnh nhuộm chất gắn kết. Kết quả không phát quang (màu xanh).

+ Đối chứng dương tính (+): tiêu bản tế bào nhiễm vi rút đậu dê dương tính nhuộm chất gắn kết. Kết quả có phát quang sáng rõ ở những tế bào nhiễm vi rút đậu dê.

+ Đối chứng miễn dịch đặc hiệu: tiêu bản bệnh phẩm sau khi cố định axeton được nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vi rút đậu dê đặc hiệu, để ở 37oC trong 30 min. rửa huyết thanh đi bằng PBS (A.2) trước khi gắn chất gắn kết. Kết quả tiêu bản không có đám phát quang.

Đọc kết quả của mẫu bệnh phẩm kiểm tra theo bảng sau:

Các tiêu bản

Kết quả huỳnh quang

...

...

...

Bệnh phẩm

Có

Có vi rút gây bênh đậu cừu và đậu dê

Bệnh phẩm

Không

Không có vi rút gây bệnh đậu cừu và dê

5.2.2.4.3 Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp

Chuẩn bị mẫu và cố định tiêu bản: xem 5.2.2.4. Gắn kháng huyết thanh vi rút đậu dê lên tiêu bản.

Nhỏ 0,1 đến 0,2 ml kháng huyết thanh vi rút đậu dê chế trên thỏ lên mỗi tiêu bản đặt trong khay ấm để ở nhiệt độ 37oC trong 30 min (tiêu bản luôn luôn ướt trong suốt quá trình ủ).

...

...

...

Lấy tiêu bản ra để khô, nhỏ chất gắn kết (anti-rabbit gamma-globµlin conjugated to FITC) lên các tiêu bản, đặt vào khay ẩm ở 37oC trong 30 min.

Lấy tiêu bản ra rửa và làm tiếp như trên.

Đọc kết quả giống như phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp.

5.2.2.5 Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR hoặc Realtime PCR

5.2.2.5.1 Chiết tách ADN

Có thể sử dụng kít chiết tách thương mại và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc thực hiện theo phương pháp sau:

Chuẩn bị mẫu: đối với mẫu máu, lấy 200 µl cho vào 200 µl EDTA, lắc đều rồi cho vào đông lạnh sau đó lấy ra để tan; đối với mẫu mô (tổ chức bị bệnh, các vảy, mụn đậu), nghiền khoảng 0,5 g mẫu với 1 ml PBS (A.2) sau đó ly tâm lấy dịch nổi; đối với tăm bông dịch tiết, lắc đều dung dịch bảo quản chứa tăm bông dịch tiết trước khi chiết tách.

Cho 200 µl mẫu máu có EDTA hoặc mẫu dịch tiết vào 100 µl dung dịch đệm lysis (A.7) hoặc 200 µl mẫu mô vào 1 ml dung dịch đệm lysis trong ống 1,5 ml.

Cho 1 µl proteinase K vào mẫu máu, dịch tiết hoặc 10 µl vào mẫu mô. Ủ mẫu ở 56 oC trong 2 h.

...

...

...

Cho 1 thể tích mẫu vào 1 thể tích hỗn hợp phenol : cloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1, phần thể tích) (300 µl vào mẫu máu, swab và 1000 µl vào mẫu mô), lắc mẫu bằng máy Vortex, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 min.

Ly tâm 14500g trong 15 min.

Cho 2 thể tích etanol (99,99 %) đã được làm lạnh gần 0 oC vào 1 thể tích mẫu rồi để mẫu vào -20 oC trong 1 h.

Ly tâm mẫu ở 14500g trong 15 min rồi loại bỏ dịch nổi.

Rửa phần cặn bằng 100 µl etanol 70 % đến 75 %.

Ly tâm ở 14500g trong 1 min, loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Để khô cặn ADN rồi hòa với 30 µl nước không chứa nuclease.

5.2.2.5.2 Phương pháp PCR

a) Chuẩn bị cặp mồi (primers)

Cặp mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen mã hóa protein bám gắn của vi rút để khuếch đại một sản phẩm có kích thước 191 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:

...

...

...

Trình tự

Mồi xuôi (Forward primer)

5’-d TTTCCTGATTTTTCTTACTAT 3’

Mồi ngược (Reverse primer) 

5’-d AAATTATATACGTAAATAAC

Các mồi này được sử dụng ở nồng độ 10 pmol/µl (10 uM).

b) Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị hỗn hợp mẹ (master) theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

...

...

...

Lượng cho 01 phản ứng, µl

Nước không chứa nuclease

9,5

Platinium quantitative PCR superMix-UDG

12,5

Mồi xuôi (Forward primer)

1

Mồi ngược (Reverse primer)

1

...

...

...

24,0

Tính lượng hỗn hợp mẹ (master) cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một phản ứng nhân với tổng số mẫu và đối chứng.

Sau khi pha hỗn hợp mẹ, chia 24 µl hỗn hợp mẹ vào các ống PCR, sau đó cho 1 µl mẫu/đối chứng ADN dương vào các ống thích hợp, 1 µl nước sạch nuclease vào ống đối chứng âm, ly tâm nhanh, rồi đặt ống PCR vào máy PCR.

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt dựa theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Chu kỳ 1

Chu kỳ 2

Chu kỳ 3

42 oC, 2 min;

...

...

...

72 oC, 1 min

94 oC, 10 min

Giữ ở 4 oC

c) Điện di và hiển thị sản phẩm PCR

Pha 1,5 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 oC đến 60 oC), cho tiếp 2 µl etidi bromua (10 mg/ml) vào. Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.

Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di.

Pha 2 µl đệm tải mẫu (loading dye) với 4 µl 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel.

Pha 2 µl đệm tải mẫu vơi 8 µl mẫu (đối chứng âm và dương) rồi đưa vào các giếng còn lại của miếng gel.

...

...

...

d) Đọc kết quả PCR sau khi điện di

Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương có kích thước 191 bp là dương tính. Đối chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện.

Phân biệt vi rút đậu dê và đậu cừu: Lấy 5 µl sản phẩm PCR (191 bp) trộn với 20 µl đệm có chứa 20 đơn vị enzymEcoRI (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), ủ ở 37 oC trong 3 h. Sau đó điện di sản phẩm như trên trong 2 h và đọc kết quả. Đối với vi rút đậu dê, chỉ xuất hiện 1 vạch sản phẩm duy nhất 191 bp, không bị phân cắt bởi enzym EcoRI. Đối với vi rút đậu cừu, xuất hiện 2 vạch sản phẩm, do sản phẩm 191 bp bị phân cắt bởi enzym EcoRi thành 2 đoạn 129 bp và 62 bp.

5.2.2.5.3 Phương pháp Real-time PCR

a) Chuẩn bị cặp mồi (primers) và mẫu dò (probe)

Cặp mồi và mẫu dò được thiết kế đặc hiệu để phát hiện gen ADN pol của các vi rút thuộc giống Capripoxvirus.

Mồi và mẫu dò

Trình tự

Mồi xuôi (Forward primer)

...

...

...

Mồi ngược (Reverse primer)

5’-CCCTGAAACATTAGTATCTGTATTTGTTGC-3’

Mẫu dò (Taqman probe)

5’-Cy5-CATCRCATCTAGGTTCRCAATGGATT-3’-TAMRA

Pha các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 pmol/µl để sử dụng.

b) Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị hỗn hợp mẹ theo hướng dẫn của bộ kit.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Nguyên liệu

...

...

...

Nước không chứa nuclease

5,5

Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG

12,5

Mồi xuôi, 10 µM

0,5

Mồi ngược,10 µM

0,5

Mẫu dò, 10 µM

...

...

...

Platinum Taq ADN Polymerase

0,5

Tổng lượng

20,0

Tính lượng hỗn hợp mẹ cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một phản ứng nhân với tổng số mẫu và đối chứng. Sau khi pha Master mix:

Chia 20 µl hỗn hợp mẹ vào các ống PCR, sau đó cho 5 µl ADN mẫu và đối chứng vào các ống thích hợp, ly tâm nhanh, rồi đặt ống PCR vào máy PCR;

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt dựa theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Chu kỳ 1

...

...

...

50oC, 2 min,

94oC, 15 s; 60o đến 65oC, 30 s đến 45 s

95oC, 10 min

c) Đọc kết quả

Mẫu dương tính là mẫu có giá trị Ct trong vòng 35 chu kỳ đầu của phản ứng và đường nền được đặt ở giai đoàn lũy thừa của sự gia tăng mật độ huỳnh quang.

5.2.3 Phát hiện kháng thể

5.2.3.1 Khái quát

Kháng thể được phát hiện bằng phương pháp trung hòa huyết thanh. Phương pháp này có thể định tính và định lượng kháng thể bệnh đậu cừu và đậu dê có trong huyết thanh kiểm tra.

...

...

...

5.2.3.2. Chuẩn độ vi rút (xem sơ đồ tại Phụ lục C)

Hoàn nguyên vi rút đông khô bằng 1 ml môi trường DMEM, sau đó tiếp tục pha loãng 1:10.

Nhiễm từ 0,3 ml đến 0,5 ml dung dịch vi rút lên tế bào LT trong chai T75 hoặc T175, ủ 37 oC trong 1 tuần.

Thu hoạch vi rút khi CPE đạt khoảng 90 %, rồi thực hiện quy trình đông (-70oC) và tan 3 lần để giải phóng vi rút khỏi tế bào.

Lắc chai nuôi cấy nhẹ và hút tất cả dung dịch tế bào vào ống ly tâm 30 ml, ly tâm 350g trong 3 min.

Hút dịch nổi có chứa vi rút sang ống mới và tiến hành chuẩn độ vi rút sử dụng độ pha loãng hệ số 10.

Chuẩn bị 8 ống (2 ml) vô trùng có chứa 900 µl môi trường DMEM chứa hepes, 10% FCS và gentamycin (0,05 mg/ml).

Lấy 100 µl dung dịch vi rút cần chuẩn độ cho vào ống thứ nhất có chứa 900 µl môi trường DMEM, trộn đều, rồi bỏ đầu típ pipet đi. Nồng độ vi rút 10-1 được chuẩn bị.

Sử dụng đầu tip pipet mới hút 100 µl từ ống thứ nhất (có nồng độ vi rút 10-1) sang ống thứ 2, trộn đều, bỏ đầu típ pipet. Nồng độ vi rút 10-2 được chuẩn bị.

...

...

...

Sử dụng đầu tip pipet riêng rẽ để hút 200 µl dung dịch vi rút ban đầu và của mỗi nồng độ vi rút để chuyển sang các giếng từ A1 đến A9 trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng. Lặp lại tương tự cho các giếng từ B1 đến B9; từ C1 đến C9 và từ D1 đến D9.

Các giếng đối chứng tế bào: A11, A12, B11, B12, C11, C12, D11, D12, cho 200 µl môi trường DMEM có hepes, 10 % huyết thanh thai bê và kháng sinh.

Cho 80 µl tế bào LT có nồng độ 480 000 tế bào/ml vào tất cả các giếng.

Ủ đĩa chuẩn độ vi rút ở 37oC với 5% CO2 trong 12 ngày hoặc cho đến khi các giếng tế bào bắt đầu thoái hóa.

Tính toán lượng vi rút chuẩn độ bằng công thức Reed và Muench.

5.2.3.3 Tiến hành phản ứng

Đánh dấu đĩa trung hòa theo sơ đồ tại Phụ lục C.

Xử lý huyết thanh ở 560C trong 30 min.

Pha loãng huyết thanh kiểm tra, đối chứng dương và âm tính thành 1/5 trong môi trường DMEM: 100 µl huyết thanh + 400 µl môi trường DMEM

...

...

...

Nhỏ 200 µl huyết thanh kiểm tra (pha loãng1/5 trong môi trường DMEM) vào cột 1 trong đĩa, mỗi mẫu 2 giếng.

Dùng pipet đa kênh pha loãng huyết thanh kiểm tra theo cơ số 2 từ hiệu giá 1:10 tới hiệu giá 1:160. Mỗi nồng độ 2 giếng, mỗi giếng 100 µl.

Chuẩn bị dung dịch vi rút 100 TCID50 và 4 độ pha loãng khác của nó từ 10-1 đến 10-4.

Nhỏ 100 µl dung dịch vi rút 100 TCID50 vào các giếng có huyết thanh và đối chứng vi rút, 100 µl của mỗi độ pha loãng vào các giếng kiểm tra chuẩn độ vi rút, mỗi nồng độ 4 giếng Ủ 37 0C với 5 % CO2 trong 1 h.

Thêm 80 µl dịch tế bào, ủ 37 0C với 5 % CO2 tới 12 ngày.

Kiểm tra CPE hàng ngày, bắt đầu từ ngày thứ 4 hoặc ngày thứ 5 cho đến ngày thứ 12. Đọc kết quả:

Các giếng đối chứng huyết thanh dương tính

Không có CPE

Các giếng đối chứng huyết thanh âm tính

...

...

...

Các mấu huyết thanh được coi là dương tính

Không có CPE

Hiệu giá kháng thể kiểm tra được tính bằng

Độ pha loãng cao nhất của giếng có CPE

Các giếng đối chứng tế bào

Để chỉ báo các tế bào có thể tồn tại được bao lâu. Kết quả phản ứng phải đọc trước khi tế bào bị thoái hóa. Nếu có những dấu hiệu giống CPE, thì phản ứng phải làm lại.

Các giếng kiểm tra chuẩn độ vi rút

Để chỉ báo sự phát triển của vi rút trong phản ứng là tối ưu. Một nửa số giếng ở độ pha loãng vi rút 10-2 phải có CPE vào giai đoạn cuối của phản ứng. Tất cả các giếng ở độ pha loãng vi rút thấp hơn có CPE và độ pha loãng cao hơn không có CPE

6. Kết luận

...

...

...

- Phân lập và giám định cho kết quả dương tính.

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính.

- Phản ứng PCR hoặc real-time PCR phát hiện vi rút dương tính. - Phản ứng kháng thể huỳnh quang dương tính.

- Phản ứng trung hòa huyết thanh dương tính đối với dê chưa tiêm phòng vacxin.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch kháng khuẩn

...

...

...

Kanamycin                                            1.000.000 UI

Streptomycin                                        200 mg

Mycostatin                                             250.000 UI

Nước                                                    10 ml

Hòa tan các kháng sinh rồi lọc bằng màng lọc 0,45 µm. Bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh.

A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) 0,1 M pH 7,2

NaCl                                                      80 g

KCl                                                        2 g

Na2HPO4                                             11,5 g

...

...

...

Nước                                                    1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1 N và dung dịch HCl 1 N. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 40C đến 80C.

A.3 Dung dịch PBST (PBS 0,03 M, 1 % Tween 20, pH 7,4)

Lấy 300 ml PBS 0,1 M pha với 700 ml nước, sau đó bổ sung 1 % Tween 20.

A.4 Dung dịch đệm ngăn chặn (PBS 0,15 M, 1 % Tween 20, 2 % BSA, pH 7,4)

NaCl                                                      120 g

KCl                                                        3 g

Na2HPO4                                              17,25 g

KH2PO4                                                3 g

...

...

...

Bổ sung 1 % Tween 20, 2 % BSA, chỉnh pH đến 7,4. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 0C đến 8 0C.

A.5 Dung dịch đệm phủ, pH 9,6

NaHCO3                                                                          2,93 g/l

Na2CO3                                                                           1,59 g/l

Pha loãng dung dịch đệm phủ 0,05 M năm lần để được dung dịch 0,01 M.

A.6 Dung dịch cơ chất

Orthophenylen diamin [C6H4(NH2)2]                                  30 mg

Nước                                                                                    75 ml

Bổ sung 0,05 % hydro peroxit (H2O2).

...

...

...

Guanidin thiocyanat                                                 60 g

KCl                                                                           0,378 g

Tris (1 M, pH 8)                                                        1 ml

Tween 20                                                                 0,5 ml

Nước vừa đủ                                                            100 ml

Cho tất cả các thuốc thử nêu trên vào cốc có mỏ, cho thêm 50 ml nước ấm và khuấy đều. Thêm nước cho đủ 100 ml.

A.8 Dung dịch đệm glyxerin pH 8,3

NaHCO3                                                                   0,0715 g

Na2CO3                                                                   0,0016 g

...

...

...

Glyxerin vừa đủ                                                        100 ml

Bảo quản ở nhiệt độ 4 oC, dùng khi đọc huỳnh quang.

A.9 Dung dịch PBS- không có Ca++ và Mg++

NaCl                                                      8,0 g

KCl                                                        0,2 g

Na2HPO4                                             1,15 g

KH2PO4                                               0,2 g

Nước vừa đủ                                        1000 ml

Chỉnh pH 7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

NaCl                                                      8,0 g

KCl                                                        0,2 g

Na2HPO4                                              1,15 g

KH2PO4                                                0,2 g

CaCl2                                                    0,1 g

MgCl2                                                    0,1 g

Nước vừa đủ                                        1000 ml

Chỉnh pH 7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

...

...

...

(Quy định)

CHUẨN BỊ TẾ BÀO TINH HOÀN CỪU SƠ CẤP

B.1. Chuẩn bị tế bào tinh hoàn cừu sơ cấp

Thực hiện các bước trong điều kiện vô trùng như sau:

Cắt tinh hoàn cừu vào chai có chứa dung dịch đệm PBS+ (A.10) để vận chuyển.

Tại phòng thí nghiệm, hút hết dung dịch PBS+ (A.10) ra và thêm dung dịch PBS- (A.9) vào chai để rửa qua các tinh hoàn. Sau đó gắp vào một đĩa Petri vô trùng.

Dùng pank và kéo để giữ các tinh hoàn và cắt bỏ những phần mô liên kết và mỡ và màng tinh hoàn. Sau đó cắt tinh hoàn thành miếng nhỏ.

Chuyển những mẩu tinh hoàn vào ống ly tâm 50 ml và cho thêm 40 ml PBS- (A.9). Lắc nhẹ, đều ống ly tâm và ly tâm ở 2000g trong 10 min. Tuỳ thuộc vào lượng tinh hoàn để sử dụng nhiều ống ly tâm hơn.

Sau khi ly tâm, hút bỏ dịch nổi. Thêm 40 ml PBS- (A.9) vào ống ly tâm, lắc đều và ly tâm như trên. Lặp lại bước này thêm 2 lần.

...

...

...

Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào vào các chai nuôi cấy thích hợp. Thêm 70 ml Dispase 0,3 % và lắc đều trong vòng 1 h trên máy khuấy từ.

Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào vào 2 ống ly tâm 50 ml và ly tâm ở 2000g trong 10 min.

Hút bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn với môi trường duy trì tế bào (môi trường Glasgow Eagle’s) không có huyết thanh và lắc đều để làm tơi phần tế bào lắng cặn.

Chuẩn bị môi trường tế bào có bổ sung các yếu tố tăng trưởng và kháng sinh (môi trường DMEM + Hepes + 10 % huyết thanh thai bê + kháng sinh penicilin và streptomycin). Sau đó chia 70 ml môi trường tăng trưởng vào mỗi chai nuôi cấy (175 cm2).

Dùng pipet trộn đều tế bào đã được hoà với môi trường duy trì trong ống ly tâm 50 ml ở trên rồi chuyển một lượng bằng nhau vào các chai nuôi cấy có môi trường tăng trưởng. Tuỳ thuộc vào Lượng tế bào trong mỗi ống ly tâm có thể chia ra cho từ 5 chai đến 15 chai nuôi cấy (175 cm2).

Sau 24 h nuôi, thay môi trường tăng trưởng. Hút bỏ môi trường cũ. Rửa thảm tế bào bằng dung dịch PBS+ (A.10) để loại bỏ hồng cầu và xác tế bào chết. Cho 70 ml môi trường tăng trưởng được chuẩn bị mới.

Đặt các chai nuôi cấy vào tủ ấm ở 35oC đến 39oC. Theo dõi sự phát triển của tế bào và kiểm tra tạp khuẩn hàng ngày.

Tỷ lệ phát triển của tế bào như sau:

- Sau 24 h: từ 30 % đến 40 % diện tích nuôi cấy được bao phủ.

...

...

...

- Sau 72 h: 100 % diện tích nuôi cấy được bao phủ.

Sau khi tế bào đạt 100% diện tích nuôi cấy, có thể cấy chuyển đời tế bào sang môi trường mới, đông lạnh. Nếu không thay môi trường, có thể duy trì được trong thời gian 10 ngày ở 37oC hoặc lâu hơn nếu để ở 28oC đến 33oC hoặc nếu giảm nồng độ huyết thanh từ 5% xuống 1%.

B.2. Chuyển đời tế bào

Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS- (A.9) vào để rửa lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch đệm PBS.

Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào và ủ ở 37oC trong 2 min đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ chai nuôi cấy để tế bào bong ra.

Hút toàn bộ dung dịch tế bào sang ống ly tâm 50 ml và thêm vào 5 ml môi trường tăng trưởng (huyết thanh trong môi trường tăng trưởng sẽ vô hoạt trypsin). Ly tâm ở 2000g trong 2 min.

Hút bỏ phần dịch nổi. Hoà phần tế bào lắng cặn với môi trường tăng trưởng (10 ml). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.

Chia đều dung dịch tế bào sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường tăng trưởng mới. Ủ ở 37 OC, từ 5 ngày đến 7 ngày. Theo dói tế bào phát triển hàng ngày và kiểm tra tạp khuẩn.

Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lương tế bào từ một chai (175 cm2) đạt 100 % diện tích nuôi cấy, có thể chuyển đời sang 5 chai (175 cm2) khác.

...

...

...

B.3. Đông lạnh tế bào

Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS - (A.9) vào để rửa lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch PBS- (A.9).

Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào và ủ ở 37OC trong 2-5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ chai nuôi cấy để tế bào bong ra.

Hút toàn bộ dung dịch tế bào sang ống ly tâm thích hợp. Ly tâm ở 2000g trong 5 min.

Bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn trong 1 ml môi trường không có huyết thanh (Glasgow Eagle’s) và dùng pipet trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống.

Cho 3 ml chất bảo vệ đông lạnh (90% huyết thanh bò + 10% DMSO) và trộn đều nhẹ để tránh bọt.

Chuyển 4 ml dung dịch tế bào vào ống đông lạnh (4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông hoặc giấy vệ sinh để làm chậm quá trình đông lạnh. Đặt ống đông lạnh vào nhiệt độ -50oC đến - 90oC qua đêm, sau đó chuyển vào giữ ở nitơ lỏng.

B.4. Khôi phục tế bào

Lấy ống tế bào được đông lạnh trong nitơ lỏng ra và đặt vào nước ấm 35oC đến 39oC cho đến khi rã đông hoàn toàn.

...

...

...

Đảo ngược ống đông lạnh từ 2 lần đến 3 lần, dùng pipet hút dung dịch tế bào sang một ống thích hợp và trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống để tránh bọt.

Chuyển tế bào vào chai nuôi cấy có môi trường tăng trưởng, ủ ở 35oC đến 39oC qua đêm.

Vào buổi sáng ngày hôm sau, thay môi trường tăng trưởng để loại bỏ DMSO: rửa lớp tế bào bằng PBS+ (A.10), rồi cho môi trường tăng trưởng mới vào, ủ ở 35oC đến 39oC để tế bào phát triển.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

SƠ ĐỒ ĐĨA CHUẨN ĐỘ VI RÚT VÀ ĐÁNH DẤU ĐĨA LÀM PHẢN ỨNG TRUNG HÒA HUYẾT THANH

...

...

...