TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 9109 : 2011
THỨC ĂN CHĂN NUÔI –
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RACTOPAMINE HYDROCLORUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO
Animal feeding stuff
– Determination of ractopamine hydrochloride content by high performance liquid chromatographic
method
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định
hàm lượng ractopamine hydroclorua (ractopamine – HCl) trong thức ăn chăn nuôi
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5
mg/kg.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho
việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố
thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3. Nguyên tắc
Ractopamine-HCl trong thức ăn chăn nuôi được
chiết bằng metanol/nước với tỷ lệ 90:10 (thể tích) đã được axit hóa. Dịch chiết
được pha loãng bằng dung dịch axit axetic 2% sau đó được định lượng bằng HPLC
với deteror huỳnh quang.
4. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân
tích và sử dụng nước loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696)
4.1. Metanol, loại dùng cho HPLC.
4.2. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.3. Dung dịch axit axetic loãng
Lấy 980 ml nước vào cốc thủy tinh, thêm 20 ml
axit axetic băng. Trộn kỹ.
4.4. Chất chuẩn ractopamine-HCl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.5.1. Dung dịch chuẩn gốc, 1000 µg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn ractopamine-HCl, chính
xác đến 0,0001 g, cho vào bình định mức 100 ml (lượng cân được điều chỉnh theo
hàm lượng chất chuẩn ractopamine-HCl). Hòa tan và thêm metanol đến vạch. Trộn
đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 3 tháng.
4.5.2. Dung dịch chuẩn trung gian, 20 mg/ml
Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc
(4.5.1) vào bình định mức 50 ml và thêm dung dịch axit axetic loãng (4.3) đến vạch.
Lắc đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2
°C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 2 tuần.
4.5.3. Dung dịch chuẩn làm việc, 0,1 µg/ml, 0,4 µg/ml,
0,8 µg/ml và 1,6 µg/ml.
Lấy chính xác lần lượt các thể tích 0,5 ml,
1,0 ml, 2,0 ml và 4,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.5.2) vào các bình định
mức tương ứng 100 ml, 50 ml, 50 ml và 50 ml và thêm dung dịch axit axetic loãng
(4.3) đến vạch. Lắc đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 2 tuần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Lấy 900 ml metanol vào cốc thủy tinh dung tích
1500 ml, thêm 100 ml nước và 2 ml axit clohydric đậm đặc (37 %). Trộn kỹ.
4.7. Pha động cho HPLC
Lấy 400 ml axetonitril vào cốc thủy tinh dung
tích 1500 ml, thêm 600 ml nước, 20 ml axit axetic băng và 1,08 ± 0,05 g natri
1-octanesulfonat (C8H17O3SNa). Trộn kỹ và lọc
qua bộ lọc dung môi có màng lọc 0,45 µm.
5. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử
nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1. Cân phân tích, có thể cân chính
xác đến 0,0001 g.
5.2. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.
5.3. Máy nghiền, có mắt sàng kích
thước 3 mm.
5.4. Máy trộn phòng thử nghiệm, ví dụ máy trộn
Hobart hoặc tương tự.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.6. Giấy lọc, Whatman. No. 41 (15
cm) hoặc loại tương đương.
5.7. Bình nón, dung tích 500 ml, có
nút mài.
5.8. Bình nón, dung tích 125 ml.
5.9. Đầu lọc, gắn được vào
xyranh, có cỡ lỗ 0,45 µm.
5.10. Xyranh nhựa, dùng một lần, dung
tích 3 ml.
5.11. Micropipet, dung tích từ 10 µl
đến 100 µl.
5.12. Lọ đựng mẫu (vial), dung tích 2 ml, có
nắp vặn PTFE, loại dùng cho HPLC.
5.13. Hệ thống HPLC, được trang bị:
5.13.1. Bơm cao áp, đã khử xung, tốc độ
dòng từ 0,1 ml/min đến 0,5 ml/min.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.13.3. Detertor huỳnh quang, có thể đặt được
bước sóng kích thích ở 226 nm và bước sóng phát xạ ở 305 nm.
5.13.4. Bộ phận xử lý tín hiệu, hoặc kết nối máy
tính.
5.13.5. Cột phân tích trên hệ thống HPLC.
5.13.5.1. Cột phân tích, 5 µm C18, 3,9 mm x
15 cm hoặc loại tương đương.
5.13.5.2. Cột bảo vệ, C18 hoặc loại tương
đương.
6. Lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu không được quy định trong
tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002)[1].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu
đại diện, không bị suy giảm chất lượng hay bị thay đổi trong quá trình vận
chuyển và bảo quản.
7. Chuẩn bị mẫu thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.2. Đối với mẫu dạng bột có kích thước hạt nhỏ
hơn hoặc bằng 3 mm và mẫu dạng viên đã được chuẩn bị theo 7.1 thì trộn đều một
lượng mẫu phòng thử nghiệm từ 0,5 kg đến 2 kg bằng thiết bị trộn phòng thử
nghiệm (5.4) trong vòng 10 min. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc
chia tư nếu cần cho đến khi thu được lượng phần mẫu thử không nhỏ hơn 500 g.
7.3. Phần mẫu thử được bảo quản trong lọ kín, ở
điều kiện nhiệt độ từ 2°C đến 25°C, nơi khô ráo.
CHÚ THÍCH: Nên chuẩn bị mẫu trong phòng có
thông gió. Nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.
8. Cách tiến hành
8.1. Chiết mẫu
8.1.1. Cân 80 g ± 1 g phần mẫu thử, chính xác đến
0,0001 g, cho vào bình nón dung tích 500 ml có nút mài (5.7), thêm 200 ml ± 2
ml dung dịch chiết (4.6) và đưa lên máy lắc (5.5) trong thời gian ít nhất là 12
h (để qua đêm), với tốc độ lắc tối thiểu là 250 r/min, sao cho mẫu sau khi lắc
được chiết hoàn toàn. Sau đó để yên mẫu trong thời gian 30 min rồi lọc dịch
chiết qua giấy lọc Whatman No. 41 (5.6) vào bình nón dung tích 125 ml (5.8).
8.1.2. Pha loãng dịch chiết thu được từ 8.1.1 bằng
dung dịch axit axetic loãng (4.3) (tối thiểu 10 lần) sao cho hàm lượng
ractopamine-HCl trong dịch chiết sau khi pha nằm trong phạm vi đường chuẩn.
Trộn kỹ.
8.1.3. Lọc một thể tích thích hợp dịch chiết đã pha
loãng vào trong lọ chứa mẫu (5.12) qua đầu lọc (5.9).
CHÚ THÍCH: Dịch chiết đã pha loãng ổn định được
ít nhất 72 h ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng huỳnh quang.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thực hiện chiết mẫu trắng như đối với mẫu thử
theo 8.1. Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi không có ractopamine-HCl.
8.3. Phân tích trên HPLC
8.3.1. Điều kiện vận hành HPLC
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ môi trường;
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/min;
- Thể tích bơm: 20 µl;
- Bước sóng kích thích: 266 nm;
- Bước sóng phát xạ: 305 nm;
- Thời gian vận hành: 10 min.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nên sử dụng cột bảo vệ, việc sử dụng bảo vệ
cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích. Cân bằng hệ thống sắc
ký bằng pha động (4.7) trong 30 min trước khi bơm mẫu.
Quy trình bơm mẫu theo thứ tự sau:
- dung dịch mẫu trắng;
- dung dịch chuẩn;
- dung dịch pha loãng;
- mẫu thu hồi;
- mẫu thử nghiệm;
- dung dịch chuẩn.
CHÚ THÍCH: Cần bơm các dung dịch chuẩn trước
và sau mỗi đợt phân tích, mỗi đợt phân tích không quá 20 lần bơm mẫu. Nếu vượt
quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm một lần vào khoảng giữa đợt
bơm mẫu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sau khi vận hành, phải làm sạch hệ thống HPLC
bằng hỗn hợp gồm axetonitril (4.2) [hoặc metanol (4.1)] : nước với tỉ lệ 1:1
(thể tích) trong 30 min.
8.4. Đường chuẩn
Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa
diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được của dung dịch chuẩn làm việc (4.5.3)
với nồng độ ractopnmine-HCl, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml), theo quan
hệ tuyến tính bậc 1:
y = ax + b
trong đó:
y là diện tích (hoặc chiều cao) pic;
x là nồng độ của ractopamine-HCl;
a là hệ số góc;
b là hằng số.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9. Tính kết quả
Hàm lượng ractopamine-HCl trong mẫu thử, X,
được tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:
trong đó:
A là hiệu số giữa diện tích (hoặc chiều cao)
pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu trắng;
a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax +
b;
V là thể tích dịch pha loãng cuối cùng theo
8.1.2, tính bằng mililit (ml);
w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của
hai lần phân tích lặp lại, được biểu thị đến hai chữ số thập phân.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các
thông tin dưới đây:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu
thử;
- phương pháp sử dụng, viện dẫn của tiêu
chuẩn này;
- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;
- ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu
(nếu biết);
- ngày tháng thử nghiệm;
- các điểm đặc biệt quan sát được trong quá
trình thử nghiệm;
- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn
này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về các sự cố bất kỳ mà có
thể ảnh hưởng đến kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn
chăn nuôi – Lấy mẫu.