Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-25:2018 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 25

• Số hiệu: TCVN8685-25:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

CPE	Cytopathic effect
MEM	Minimum Essential Media
EMEM	Eagle’s Minimum Essential Media
TCID50	Tissue Culture Infectious Dose 50
PK15	Porcine kidney
FBS	Fetal Bovine Serum
PBS	Phosphate Buffered Saline

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng, an toàn và hiệu lực bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm và trên động vật mẫn cảm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Chuột nhắt trắng, khỏe, trọng lượng từ 15 g đến 20 g

5.2  Chuột lang, khỏe, trọng lượng từ 300 g đến 350 g

5.3  Thỏ, khỏe, trọng lượng từ 1,8 kg đến 2 kg

5.4  Lợn con, 14 ngày tuổi đến 28 ngày tuổi, không có kháng thể kháng vi rút Giả dại

5.5  Lợn, trọng lượng từ 15 - 35 kg, không có kháng thể kháng vi rút Giả dại

5.6  Đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK-15

...

...

...

5.8  Môi trường tế bào MEM, 1x

5.9  Môi trường nuôi dưỡng EMEM

5.10  Huyết thanh thai bê (FCS), 5 %

5.11  Dung dịch PBS, pH 7,2

5.12  Kháng nguyên chuẩn Giả dại

5.13  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Tủ ấm CO2 duy trì nhiệt độ 37 °C có bổ sung 5% CO₂

...

...

...

6.3  Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

6.4  Đĩa Petri vô trùng

6.5  Micropipet, dung tích từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 5µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl

6.6  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl

6.7  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

6.8  Đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK15

6.9  Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ từ 1000 rpm đến 3000 rpm

6.10  Ống ly tâm vô trùng

6.11  Bơm tiêm dung tích 5 ml

...

...

...

6.13  Chai thủy tinh schott (100 ml, 1000 ml) vô trùng

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

7.1.1  Vắc xin nhược độc: Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra cảm quan khi lọ kín, không rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng nhất, hòa tan hoàn toàn trong nước muối sinh lý (5.13) sau 2 min có lắc nhẹ.

7.1.2  Vắc xin vô hoạt: Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra cảm quan khi hỗn dịch đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

7.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn. Theo TCVN 8684 : 2011

7.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. Theo TCVN 8684 : 2011

7.3  Kiểm tra tính an toàn

...

...

...

7.3.1  Phương pháp trọng tài

Tiêm cho 2 lợn (5.4), mỗi con 10 liều (đối với vắc xin nhược độc) và 1 liều (đối với vắc xin vô hoạt) theo đường khuyến cáo của nhà sản xuất. Theo dõi toàn bộ lợn thí nghiệm trong 14 ngày (đối với vắc xin vô hoạt) và 21 ngày (đối với vắc xin nhược độc). Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra tính an toàn nếu tất cả lợn sống khỏe, phát triển bình thường và không có biểu hiện của bệnh Giả dại như rối loạn hô hấp (ho, khó thở), rối loạn thần kinh (run rẩy, chảy nhiều nước dãi, giật cầu mắt).

7.3.2  Phương pháp thay thế

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

7.3.2.1  Tiêm cho 10 chuột nhắt trắng (5.1), mỗi con 0,5 ml vắc xin theo đường trong màng bụng hoặc dưới da. Theo dõi toàn bộ chuột thí nghiệm trong 7 ngày (đối với vắc xin nhược độc) và 14 ngày (đối với vắc xin vô hoạt). Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra tính an toàn nếu tất cả chuột sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường cục bộ hay triệu chứng toàn thân.

7.3.2.2  Tiêm cho 2 chuột lang (5.2), mỗi con 0,5 ml vắc xin theo đường trong màng bụng hoặc dưới da. Theo dõi toàn bộ chuột thí nghiệm trong 7 ngày. Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra tính an toàn nếu tất cả chuột sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường cục bộ hay triệu chứng toàn thân.

7.4  Kiểm tra hiệu lực

7.4.1  Kiểm tra hiệu lực đối với vắc xin nhược độc

Sử dụng đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK-15 (5.6) để chuẩn độ hiệu giá vi rút trong mỗi liều vắc xin (xem Phụ lục A). Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra hiệu lực khi mỗi liều vắc xin có hiệu giá vi rút ≥ 10^2^.^3 TCID₅₀.

...

...

...

- Sử dụng 10 lợn (5.5), chia làm 2 nhóm:

Nhóm 1: gồm 5 lợn, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường khuyến cáo của nhà sản xuất;

Nhóm 2: gồm 5 lợn làm đối chứng, mỗi con được tiêm nước muối sinh lý (5.13) với liều lượng và đường tiêm tương tự như lợn nhóm 1.

Sau khi tiêm vắc xin 14 ngày, lợn nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, chắt huyết thanh và kiểm tra kháng thể bằng phản ứng trung hòa (xem Phụ lục B).

Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra hiệu lực khi ít nhất 80 % huyết thanh của lợn nhóm 1 có hiệu giá ≥ 1 : 8 và ít nhất 80 % huyết thanh của lợn nhóm 2 có hiệu giá < 1 : 2.

8  Kết luận

Vắc xin đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm khi đạt các chỉ tiêu kiểm tra cảm quan, kiểm tra vô trùng, kiểm tra tính an toàn và kiểm tra hiệu lực.

Phụ lục A

...

...

...

Chuẩn độ hiệu giá vi rút trong vắc xin

A.1  Chuẩn bị

- Vắc xin cần kiểm tra

- Đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK 15 (5.6)

- Môi trường tế bào MEM 1X (5.8)

- Dung dịch PBS (5.11)

A.2  Cách tiến hành

A.2.1  Vắc xin được pha loãng với môi trường tế bào MEM 1X (5.8) theo cơ số 10 thành các nồng độ từ nồng độ 10^-^1 đến nồng độ 10^-8

A.2.2  Dùng micropipet (6.6) cho 100 µl vắc xin pha loãng (A.2.1) vào đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK 15, mỗi nồng độ gây nhiễm cho 5 giếng

...

...

...

A.2.4  Rửa bỏ những vi rút không bám trên bề mặt tế bào bằng dung dịch PBS (5.9)

A.2.5  Dùng micropipet (6.6) cho 100 µl môi trường MEM 5 % vào tất cả các giếng của đĩa 96 giếng

A2.6  Đặt đĩa 96 giếng (A.2.5) vào trong tủ ấm CO₂ (6.1) và quan sát bệnh tích tế bào trong thời gian từ 4 ngày đến 5 ngày. Tính liều gây nhiễm của vi rút gây hủy hoại 50 % số giếng tế bào (TCID₅₀) theo phương pháp Spearman - Kaber như sau:

Trong đó:

Xo là log của bậc pha loãng vi rút cao nhất;

d là log của bậc pha loãng;

ri là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng;

n là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng.

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Phản ứng trung hòa

B.1  Chuẩn bị

- Huyết thanh cần kiểm tra

- Đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK 15 (5.6)

- Đĩa nhựa 96 giếng (5.7)

- Môi trường tế bào MEM (5.8)

- Môi trường nuôi dưỡng EMEM (5.9)

...

...

...

- Dung dịch PBS (5.11)

- Kháng nguyên chuẩn Giả dại (5.12)

B.2  Cách tiến hành

B.2.1  Dùng micropipet (6.6) cho 100 µl môi trường MEM (5.8) vào tất cả các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (5.7)

B.2.2  Dùng micropipet (6.6) cho 100 µl mẫu huyết thanh (7.4.2) vào giếng A1 của đĩa phản ứng (B.2.1), trộn đều huyết thanh với môi trường MEM ở giếng 1, hút 100 µl chuyển sang giếng A2, trộn đều, hút 50 µl chuyển sang giếng A3, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng A8 rồi bỏ đi 100 µl

B.2.3  Dùng micropipet (6.6) cho 100 µl dung dịch kháng nguyên chuẩn Giả dại (5.12) tương đương với 100 TCID₅₀ vào các giếng của đĩa tế bào

B.2.4  Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (6.1) trong 45 min đến 60 min

B.2.5  Thực hiện phản ứng theo sơ đồ sau:

Dùng micropipet (6.6) chuyển 100 µl hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau từ đĩa phản ứng (B.2.4) sang đĩa 96 giếng có 1 lớp tế bào PK 15 (5.6) từ giếng A1 đến giếng H10

...

...

...

Giếng đối chứng vi rút: Dùng micropipet (6.5) cho 100 µl dung dịch kháng nguyên chuẩn Aujeszky (5.12) (nồng độ 100 TCID₅₀) vào các giếng từ giếng A12 đến giếng H12

Sơ đồ vị trí mẫu trong phản ứng trung hòa

1

2

3

4

5

6

...

...

...

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

...

...

...

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

B

...

...

...

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

...

...

...

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

...

...

...

1/8

1/8

D

1/16

1/16

1/16

1/16

...

...

...

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

E

1/32

...

...

...

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

...

...

...

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

...

...

...

1/64

G

1/128

1/128

1/128

1/128

1/128

...

...

...

1/128

1/128

1/128

1/128

H

1/256

1/256

...

...

...

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

...

...

...

Đối chứng vi rút

Đối chứng tế bào

B.2.6  Ủ đĩa (B.2.5) ở tủ ấm CO₂ (6.1) trong 60 min. Loại bỏ hỗn hợp trên đĩa, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS (5.11)

B.2.7  Dùng micropipet (6.6) cho vào mỗi giếng 100 µl môi trường nuôi dưỡng EMEM (5.9) có bổ sung huyết thanh thai bê FCS 5% (5.10)

B.2.8  Đặt đĩa (B.2.7) ở tủ ấm CO₂ (6.1) và quan sát bệnh tích tế bào trong thời gian từ 48 h đến 60 h

Ghi lại số lượng giếng dương tính và âm tính.

B.3  Điều kiện kết quả

Phản ứng có giá trị khi:

- Giếng đối chứng tế bào (B.2.5): bình thường;

...

...

...

B.4  Diễn giải kết quả

- Hiệu giá kháng thể có trong mẫu huyết thanh được tính ở nồng độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh có trong hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên là nơi 50 % số giếng được bảo hộ.

- Mẫu huyết thanh được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính) nếu có hiệu giá kháng thể ≤ 1 : 2.

- Mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể (mẫu dương tính) nếu có hiệu giá kháng thể ≥ 1 : 8.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Asean standard requirements for Aujeszky's Disease (Live) Vaccine

[2] Asean standard requirements for Aujeszky's Disease (Inactivated) Vaccine

[3] OIE: Chapter 2.1.2 Aujeszky's Disease (Infection with Aujeszky’s Disease virus)

...

...

...