Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-26:2018 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 26

• Số hiệu: TCVN8685-26:2018
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2018

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-26 : 2018

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 26: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC PHÒNG BỆNH VIÊM THANH KHÍ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (ILT) Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 26: Infectious Laryngotracheitis Vaccine, Live

Lời nói đầu

TCVN 8685-26 : 2018 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

...

...

...

- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

...

...

...

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8686-20 : 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21 : 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22 : 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

...

...

...

- TCVN 8685-24 : 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25 : 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn

- TCVN 8685-26 : 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27 : 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà.

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 26: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC PHÒNG BỆNH VIÊM THANH KHÍ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (ILT) Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 26: Infectious Laryngotracheitis Vaccine, Live

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định về quy trình kiểm nghiệm vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT) do vi rút Laryngotracheitis gây ra ở gà.

...

...

...

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011 “Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết”

3  Ký hiệu và chữ viết tắt

ILT

Infectious Laryngotracheitis

EID₅₀

50 % Egg Infective Dose

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

...

...

...

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng phương pháp phân tích trong phòng thử nghiệm và các chỉ tiêu an toàn, hiệu lực được đánh giá trên động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Gà 2 tuần tuổi, gà khỏe, không có kháng thể kháng vi rút ILT

5.2  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

5.3  Kit ELISA phát hiện kháng thể ILT

5.4  Trứng gà sạch, có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl

...

...

...

6.3  Đầu tip phù hợp với micropipet

6.4  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

6.6  Bơm tiêm, dung tích 1 ml, 3 ml, 5 ml

6.7  Máy đọc ELISA, có bước sóng từ 405 nm đến 650 nm

6.8  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra cảm quan khi lọ kín, không rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng nhất, hòa tan hoàn toàn trong nước muối sinh lý (5.2) sau 2 min có lắc nhẹ.

7.2  Kiểm tra vô trùng

...

...

...

7.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. Theo TCVN 8684 : 2011

7.3  Kiểm tra tính an toàn

· Nhỏ mắt mũi cho 10 gà (5.1), mỗi con 10 liều vắc xin ghi trên nhãn.

· Theo dõi toàn bộ gà thí nghiệm trong 14 ngày.

· Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả gà sống khỏe, phát triển bình thường và không có biểu hiện triệu chứng của bệnh ILT như ủ rũ, xù lông, thở khó, hắt hơi, viêm mũi, viêm mí mắt, phù đầu.

7.4  Kiểm tra hiệu lực

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.1  Phương pháp ELISA

Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

...

...

...

Nhóm 2: nhỏ nước muối sinh lý (5.2) vào mắt mũi cho 10 gà với liều lượng như gà nhóm 1.

Sau khi nhỏ vắc xin 28 ngày tất cả gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, chắt huyết thanh để thực hiện phản ứng ELISA (tham khảo phụ lục A).

Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi ít nhất 90 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 đạt giá trị dương tính; trong khi đó ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 đạt giá trị âm tính.

7.4.2  Chuẩn độ hiệu giá vi rút

Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi mỗi liều vắc xin có hiệu giá vi rút ≥ 10^2^.^5 EID₅₀ (xem phụ lục B)

8  Kết luận

Vắc xin đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm khi đạt các chỉ tiêu kiểm tra cảm quan, kiểm tra vô trùng, kiểm tra tính an toàn và kiểm tra hiệu lực.

Phụ lục A

...

...

...

Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

A.1  Vật liệu thử

A.1.1  Huyết thanh gà cần kiểm tra

A.1.2  Nước cất 2 lần

A.1.3  Kit ELISA phát hiện kháng thể ILT

VÍ DỤ: Dùng Kit ELISA của hãng SYNBIOTICS (Fowl laryngotracheitis virus antibody test kit - Item. No. 966231)I).

A.2  Cách tiến hành

A.2.1  Pha loãng huyết thanh (A.1.1) bằng dung dịch sample diluent theo tỷ lệ 1/50.

A.2.2  Dùng micropipet (6.1) hút 50 µl dung dịch sample diluent vào tất cả các giếng (từ giếng A1 đến giếng H12) của đĩa có phủ kháng nguyên ILT.

...

...

...

A.2.4  Dùng micropipet (6.1) hút 50 µl Positive control ILT vào giếng B1 và B2 của đĩa có phủ kháng nguyên ILT.

A.2.5  Dùng micropipet (6.2) hút 50 µl huyết thanh đã pha loãng (A.2.1) vào các giếng còn lại (trừ giếng A1, A2, B1, B2) của đĩa có phủ kháng nguyên ILT.

A.2.6  Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

A.2.7  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần (A.1.2), mỗi giếng 350 µl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

A.2.8  Dùng micropipet (6.2) cho Goat Anti-Chicken Peroxidase Conjugate Solution đã pha loãng 1/100 vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 µl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

A.2.9  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần (A1.2), mỗi giếng 350 µl ước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

A.2.10  Dùng micropipet (6.2) cho Tetramethylbenzidine substrate vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 µl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

A.2.11  Dùng micropipet (6.2) cho dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 µl, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.7) ở bước sóng 405 nm đến 650 nm để ra các giá trị Optical Density (OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

...

...

...

1

2

3

4

5

6

7

8

9

...

...

...

11

12

A

NC

NC

S7

S7

S15

S15

...

...

...

S23

S31

S31

S39

S39

B

PC

PC

S8

...

...

...

S16

S16

S24

S24

S32

S32

S40

S40

C

...

...

...

S1

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

...

...

...

S41

D

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

...

...

...

S34

S34

S42

S42

E

S3

S3

S11

S11

...

...

...

S19

S27

S27

S35

S35

S43

S43

F

S4

...

...

...

S12

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

...

...

...

G

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

...

...

...

S37

S45

S45

H

S6

S6

S14

S14

S22

...

...

...

S30

S30

S38

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC (negative control): đối chứng âm;

PC (positive control): đối chứng dương;

...

...

...

A.3  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình (PCx)

=

OD giếng A1 + OD giếng A3

2

- Đối chứng âm trung bình (NCx)

=

OD giếng A2 + OD giếng A4

...

...

...

- Giá trị S/P

=

OD Mẫu - NCx

PCx

- Hiệu giá S/P log₁₀ Titer = 1,450 x (log₁₀S/P) + 3,726

A.4  Điều kiện kết quả

Giá trị OD của đối chứng đạt điều kiện như sau thì phản ứng đạt:

0,25 < OD đối chứng dương - OD đối chứng âm < 0,9 (0,25 < PCx - NCx < 0,9)

...

...

...

A.5  Diễn giải kết quả

Giá trị S/P ≤ 0,15 mẫu kiểm tra âm tính (S/P ≤ 0,15 : N)

Giá trị S/P > 0,15 mẫu kiểm tra dương tính (S/P > 0,15 : P)

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn độ hiệu giá vi rút trong vắc xin

B.1  Vật liệu thử

- Vắc xin cần kiểm tra

...

...

...

- Nước muối sinh lý (5.2)

B.2  Cách tiến hành

B.2.1  Vắc xin được pha loãng với nước muối sinh lý (5.2) theo cơ số 10 thành các nồng độ từ nồng độ 10^-1 đến nồng độ 10^-^10.

B.2.2  Tiêm huyễn dịch vắc xin đã pha loãng (B.2.1) vào màng CAM (Chorioallantoic Membrane) của trứng gà sạch (5.4), mỗi trứng tiêm 0,1 ml.

B.2.3  Ấp các trứng đã được tiêm (B.2.2) ở tủ ấm (6.8) trong 5 ngày, hàng ngày soi trứng và loại bỏ trứng chết phôi trước 24 h.

B.2.4  Sau 5 ngày theo dõi, trứng được mổ và kiểm tra bệnh tích đặc trưng của phôi trứng do vi rút ILT gây ra, đó là xuất hiện những mảng xám dày trên màng CAM của trứng, từ đó tính liều gây nhiễm của vi rút trong vắc xin cho 50 % phôi trứng (EID₅₀) theo công thức Reed - Muench như sau:

LgEID₅₀ = LgA + Xlgf

Trong đó:

...

...

...

A: Nồng độ pha loãng vi rút gây nhiễm cho trứng cận trên 50 %

A’: Tỷ lệ % trứng bị nhiễm cận trên 50 %

B': Tỷ lệ % trứng bị nhiễm cận dưới 50 %

f: Cơ số pha loãng vi rút

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Asean standard requirements for Infectious Laryngotracheitis Vaccine, Live

[2] OIE: Chapter 2.3.3 Avian Infectious Laryngotracheitis

[3] 11 VR - 10KN1 - Quy trình Kiểm nghiệm vắc xin Viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT) nhược độc

...

...

...