Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-16:2017 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin – Phần 16: phòng bệnh viêm teo mũi

• Số hiệu: TCVN8685-16:2017
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2017

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-16:2017

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 16: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH VIÊM TEO MŨI TRUYỀN NHIỄM Ở LỢN

Vaccine testing procedure - Part 16: Bordetella bronchiseptica vaccine, inactivated

Lời nói đầu

TCVN 8685-16:2017 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

...

...

...

- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

...

...

...

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro.

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 16: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH VIÊM TEO MŨI TRUYỀN NHIỄM Ở LỢN

Vaccine testing procedure - Part 16: Bordetella bronchiseptica vaccine, inactivated

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định qui trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn được sản xuất từ chủng vi khuẩn Bordetella bronchiseptica.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684 : 2011 “Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phương pháp kiểm tra thuần khiết”

3  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

4  Động vật thí nghiệm và giống gốc công cường độc

4.1  Lợn từ 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, không có kháng thể Bordetella bronchiseptica

4.2  Chuột lang trọng lượng từ 350 g đến 400g, khỏe mạnh

...

...

...

4.4  Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 g đến 20 g, khỏe mạnh

4.5  Vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc

4.6  Vắc xin tham chiếu (Vắc xin chuẩn)

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1  Tủ ấm CO₂ có thể duy trì nhiệt độ 37°C

5.2  Tủ lạnh có thể duy trì nhiệt độ từ 2°C đến 8°C

5.3  Tủ lạnh sâu có thể duy trì nhiệt độ âm 80°C

5.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

5.5  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 12 000 g

...

...

...

5.7  Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl

5.8  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

5.9  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng

5.10  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U

5.11  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng

5.12  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

5.13  Bơm kim tiêm một lần 5 ml, 10 ml

5.14  Cân phân tích có dải đo từ 0 g đến 30 g

6  Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm

...

...

...

Số lượng mẫu cần lấy: 12 mẫu (chai/lọ)

6.2  Chuẩn bị động vật thí nghiệm

- Ít nhất 10 lợn (4.1)

- Ít nhất 02 chuột lang (4.2)

- Ít nhất 152 chuột nhắt trắng (4.4)

- Ít nhất 05 thỏ (4.3)

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

...

...

...

7.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684 : 2011

7.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN 8684 : 2011

7.3  Kiểm tra tính an toàn

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.3.1. Phương pháp trọng tài

- Tiêm ít nhất cho 02 lợn (4.1), mỗi con 02 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường tiêm bắp. Theo dõi lợn từ 10 -14 ngày.

Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả lợn thí nghiệm sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi về cục bộ, bất thường hay triệu chứng toàn thân.

7.3.2. Phương pháp thay thế

- Tiêm ít nhất cho 02 chuột lang (4.2), mỗi con 2 ml vắc xin theo đường dưới da.

...

...

...

Theo dõi động vật thí nghiệm từ 10 ngày đến 14 ngày.

Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả chuột sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi về cục bộ, bất thường hay triệu chứng toàn thân.

7.4  Kiểm tra hiệu lực

Chọn 1 trong 3 phương pháp sau:

7.4.1  Phương pháp công cường độc trên lợn

Lợn được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm bắp ít nhất 05 lợn (4.1) mỗi con tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Nhóm 2: Tiêm bắp ít nhất 03 lợn (4.1) nước sinh lý vô trùng với liều lượng như tiêm vắc xin.

- 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ lợn nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất.

...

...

...

- Theo dõi động vật thí nghiệm trong 7 ngày đến 10 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt nếu:

+ Ít nhất 2/3 lợn nhóm 2 chết hoặc có triệu chứng bệnh tích điển hình của bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn

+ Ít nhất 4/5 lợn nhóm 1 không có bất kỳ các triệu chứng bệnh tích nào của bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn

7.4.2  Phương pháp công cường độc trên chuột nhắt trắng

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.2.1  Phương pháp tính hiệu lực tương đối

Chuột được chia thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm vắc xin cần kiểm tra theo đường dưới da hoặc phúc xoang cho chuột nhắt trắng (4.4) với hàm lượng bằng 1/6 liều ghi trên nhãn (1/6 được coi là độ pha loãng ban đầu). Pha loãng theo cơ số 2 ở 4 nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, mỗi nồng độ tiêm 4 chuột.

...

...

...

- Nhóm 3: Tiêm nước sinh lý vô trùng theo đường dưới da hoặc phúc xoang cho 10 chuột nhắt trắng (4.4) với liều lượng như tiêm vắc xin cần kiểm tra.

- 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ chuột nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất.

- 7 ngày sau mũi tiêm thứ 2 toàn bộ chuột nhóm 1 và chuột nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5), mỗi con 0,2 ml (tương đương với liều 10^8 - 10^9 CFU/0,2 ml) theo đường dưới da.

- Theo dõi trong 10 ngày, vắc xin được coi là đạt nếu Hiệu lực của vắc xin (The relative potency of the bacterin) ≥ 0.5

Hiệu lực của vắc xin

=

Số nghịch đảo 50% ở độ pha loãng cuối cùng của vắc xin kiểm tra

≥ 0.5

Số nghịch đảo 50% ở độ pha loãng cuối cùng của vắc xin tham chiếu

...

...

...

Chuột được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) mỗi con tiêm 0,2 ml vắc xin cần kiểm tra.

- Nhóm 2: Tiêm nước sinh lý vô trùng vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) với liều lượng như tiêm vắc xin cần kiểm tra.

- 21 ngày sau, chuột của cả 2 nhóm được thử thách với vi khuẩn cường độc Bordetella bronchiseptica (4.5) .

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Lấy 0,2 ml canh trùng cường độc được pha loãng với PBS theo cơ số 10 để được các nồng độ từ 10^-^1 đến nồng độ 10^-^10.

- Ở mỗi nồng độ tiêm vào phúc xoang cho 5 chuột với liều 0.1 ml/con.

- Theo dõi trong 7 ngày, vắc xin được coi là đạt nếu LD₅₀ của nhóm 1 lớn hơn nhóm 2 ít nhất 10 ^2.0.

- Liều LD₅₀ của cả 2 nhóm chuột được tính toán tính theo công thức Reed - Muench:

LgLD₅₀ = LgA + Xlgf

...

...

...

Trong đó:

X: Khoảng cách tỷ lệ

A: Độ pha loãng vi khuẩn gây chết chuột nhắt trắng cận trên 50%

A': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận trên 50%

B': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận dưới 50%

f: Hệ số pha loãng vi khuẩn

7.4.3  Phương pháp huyết thanh học

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.3.1  Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ELISA

...

...

...

- Tiêm bắp ít nhất 05 thỏ (4.3), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ thỏ được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, thỏ được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ELISA.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn khi ít nhất 75 % mẫu huyết thanh đạt giá trị dương tính.

7.4.3.2. Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết

- Tiêm bắp ít nhất 05 lợn (4.1), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ lợn được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục).

- Vắc xin được coi là đạt nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch cho kết quả ≥ 1:16.

Phụ lục A

(Quy định)

Kiểm tra hiệu giá kháng thể Bordetella bronchiseptica bằng phản ứng ngưng kết chậm

...

...

...

- Đĩa thạch chocolate bổ sung Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 5 %

- Đĩa thạch máu đường kính 8-10 cm

- Canh thang Brain heart infusion (BHI) đóng ống 4 ml

- Acid Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 1N

- Formaldehyde solution min 37 % (HCHO)

- Dung dịch PBS: 1000ml được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl)

8 g

Kali clorua (KCI)

...

...

...

Natri hiđro photphat (Na₂HPO₄)

1,15 g

Mono kali photphat (KH₂PO₄)

0,2 g

Nước

1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 1 h. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C.

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen - KN xử lý acid EDTA)

A.2.1  Cấy 0,01 ml vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5) vào đĩa thạch chocolate bổ sung NAD 5 % (A.1), ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

...

...

...

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch chocolate (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch chocolate (A.2.3) bằng cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml EDTA 1 %, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37°C (5.1) trong 24 h

A.2.7  Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3 % Formaldehyde solution min 37 % (A.1), lặp lại 2 lần.

A.2.8  Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.7) bằng máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu hoạch kháng nguyên

A.2.9  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.8) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết.

A.3. Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

Lấy máu động vật (7.4.3.2) và chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy (5.6) ở nhiệt độ 56°C trong 30 min.

...

...

...

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U

Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Cho dung dịch PBS vào các dãy giếng thí nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng)

+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2

+ Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên

- Đối với các giếng đối chứng:

...

...

...

+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch và pha loãng theo cơ số 2

+ 50 μl kháng nguyên

- Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37°C (5.1) qua đêm

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...