Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8736:2011 về thuốc thú y - định lượng tổng số bào tử bacillus

• Số hiệu: TCVN8736:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Quy cách đóng gói (g hoặc ml)	Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao gói)
Đến 2	70
Từ 2 đến 5	30
Từ 5 đến 50	7
Từ 50 đến 100	4
Từ 100 trở lên	3

Trong trường hợp đặc biệt thì tùy theo quy cách đóng gói và tính chất của thuốc chỉ lấy mẫu đủ để phân tích và lưu.

5.3 Bảo quản mẫu

Xem tiêu chuẩn cụ thể đối với sản phẩm liên quan hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị dung dịch pha loãng

Cân 9 g natri clorua, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức 1000 ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình 90 ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9 ml dung dịch trên. Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8 0C, sử dụng trong 15 ngày.

6.2 Chuẩn bị môi trường

Cân các thành phần môi trường PCA theo 4.1 hoặc lấy 22,5 g môi trường tổng hợp, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Lắc đều và đun cách thủy hoặc trong lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250 ml lượng môi trường 100 ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min.

Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 0C ± 1 0C ở bể điều nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 đến 8 0C không quá 30 ngày.

...

...

...

Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 min. Đặt trong bể điều nhiệt 80 0C trong 10 min.

6.4 Các bước tiến hành

6.4.1 Pha loãng mẫu

Dùng micropipet lấy 1 ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng cần thiết để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa theo dự kiến.

Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng.

Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri.

Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái.

Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang.

Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 min.

...

...

...

Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 h đến 24 h.

6.6 Đọc kết quả

Sau 24 h, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa.

Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi. Để khẳng định là Bacillus bao gồm: Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, thì tiến hành kiểm tra ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình theo cách sau: -

- Nhuộm Gram: Bacillus là trực khuẩn Gram (+) tạo thành chuỗi.

- Thử phản ứng Catalase: Bacillus cho catalase (+).

- Nhuộm Glycogen: hạt glycogen trong vi khuẩn bắt màu đỏ nâu.

- Nếu trong 80 % trường hợp, tức là không ít hơn 4 khuẩn lạc trong 5 khuẩn lạc được khẳng định là thuộc chủng Bacillus thì tất cả các khuẩn lạc đặc trưng phát triển trong đĩa được coi là thuộc nhóm này.

- Trong các trường hợp còn lại số vi khuẩn chủng Bacillus được xác định từ tỉ lệ phần trăm của khuẩn lạc đã được khẳng định trên tổng số khuẩn lạc đặc trưng được lấy để kiểm tra.

...

...

...

7.1 Tính kết quả

Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, thì tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:

Trong đó:

C là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;

V là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại;

n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.

...

...

...

Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).

Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.

Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả là trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm.

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau:

- Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1 ml sản phẩm.

- Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1 g sản phẩm.

trong đó d là hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (10-1).

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) nhiệt độ ủ;

e) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tuỳ ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

f) kết quả thử nghiệm thu được.