Tiêu chuẩn TCVN 8684:2022 về Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết

• Số hiệu: TCVN8684:2022
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2022

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8684:2022

VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y - PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT

Veterinary vaccines and biological products - Purity tests

Lời nói đầu

TCVN 8684:2022 thay thế TCVN 8684:2011.

TCVN 8684:2022 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y - PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phép thử độ thuần khiết của vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

2.1  Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Độ thuần khiết là không có sự tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, kháng nguyên lạ, vi sinh vật ngoại lại và tồn dư của các hóa chất sử dụng trong quá trình sản xuất vắc xin và chế phẩm sinh học.

2.2  Chữ viết tắt

AS (Allantoic Sac): túi niệu nang

CAM (Chorio - Allantoic Membrane): màng đệm niệu nang

...

...

...

SPF (Specific Pathogens Free): không có tác nhân gây bệnh đặc biệt

3  Nguyên tắc

Vắc xin và chế phẩm sinh học được kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, thuần khiết, các vi rút ngoại lai và tồn dư Formaldehyde bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm.

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

4.1  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1.1  Huyết thanh ngựa.

4.1.2  Chất chiết nấm men.

4.1.3  Nước muối sinh lý vô trùng nồng độ từ 0,85 % đến 0,9 %.

...

...

...

4.1.5  Methylbenzothiazole hydrazone hydrocloride.

4.1.6  Dung dịch sắt (III) clorua (FeCI₃) trong axit sulfamic (NH₂SO₃H).

4.2  Môi trường nuôi cấy

4.2.1  Môi trường thioglycollate.

4.2.2  Môi trường lỏng TSB (Trypticase soy broth).

4.2.3  Môi trường nước thịt (NB - Nutrient broth).

4.2.4  Môi trường thạch Sabouraud.

4.2.5  Môi trường thủy phân casein đậu tương.

4.2.6  Môi trường nước thịt PPLO.

...

...

...

4.2.8  Môi trường thạch MacConkey.

4.2.9  Môi trường thạch Salmonella-Shigella.

4.2.10  Môi trường thạch Brilliant Green.

4.2.11  Môi trường thạch desoxycholate citrate.

4.2.12  Môi trường thạch XLD (xyloza lysin deoxycholate).

4.2.13  Môi trường lỏng selenite.

4.2.14  Môi trường lỏng tetrathionate.

4.2.15  Môi trường thạch máu.

CHÚ THÍCH: Các hóa chất và môi trường sử dụng trong tiêu chuẩn là sản phẩm thương mại, cách chuẩn bị môi trường và hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

4.3.1  Trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi (trứng gà SPF hoặc trứng gà có nguồn gốc từ các đàn gà bố mẹ có huyết thanh âm tính với bệnh Newcastle, Viêm phế quản truyền nhiễm, Marek, Hội chứng giảm đẻ 76 và bệnh do Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Salmonella pullorum).

4.3.2  Gà khỏe mạnh, ở độ tuổi nhỏ nhất phù hợp với mẫu kiểm tra tương ứng (gà SPF hoặc không có kháng thể Newcastle, Viêm phế quản truyền nhiễm, Marek, Hội chứng giảm đẻ 76, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae và Salmonella pullorum).

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Pipet, dung tích từ 10 μl đến 100 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl, từ 1000 μl đến 5000 μl.

5.2  Ống nghiệm thủy tinh vô trùng, dung tích 20 ml.

5.3  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0.5 °C.

5.4  Que cấy vô trùng.

5.5  Bình thủy tinh vô trùng, dung tích 100 ml.

...

...

...

5.7  Máy lắc tròn, có tốc độ lắc từ 50 vòng/phút đến 2400 vòng/phút.

5.8  Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet 1 cm, có thể đo được ở bước sóng 628 nm.

5.9  Bơm tiêm 1 lần, dung tích 1 ml, 3 ml, 5 ml.

5.10  Đĩa petri thủy tinh vô trùng, đường kính 9 cm.

5.11  Nồi hấp, có thể duy trì nhiệt độ 121 °C ± 0.5 °C.

5.12  Kính hiển vi, có độ phóng đại 100 X.

6  Cách tiến hành

6.1.  Chuẩn bị mẫu

Mẫu được đồng nhất trước khi kiểm tra. Trong trường hợp mẫu ở dạng đông khô cần hoàn nguyên và đồng nhất bằng nước muối sinh lý vô trùng (4.1.3) theo dung tích của lọ mẫu.

...

...

...

6.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

6.2.1.1  Chuẩn bị

- Chuẩn bị ống môi trường nuôi cấy gồm:

+ 2 ống nghiệm thủy tinh (5.2), mỗi ống có 5 ml môi trường thioglycollat (4.2.1).

+ 2 ống nghiệm thủy tinh (5.2), mỗi ống có 5 ml môi trường thạch máu (4.2.15).

+ 2 ống nghiệm thủy tinh (5.2), mỗi ống có 5 ml môi trường nước thịt (4.2.3).

- Hấp vô trùng các ống môi trường nuôi cấy ở nồi hấp (5.11) trong 15 min.

6.2.1.2  Cách tiến hành

- Dùng pipet (5.1) hút 0,5 ml đến 1 ml mẫu đã được đồng nhất (6.1) vào từng ống môi trường nuôi cấy (6.2.1.1), sau đó ủ trong tủ ấm (5.3) và theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.

...

...

...

+ Dùng pipet (5.1) lấy 0,5 ml mẫu cấy vào 02 ống nghiệm thủy tinh (5.2), mỗi ống chứa 10 ml môi trường nước thịt (4.2.3), sau đó ủ ở tủ ấm (5.3) và theo dõi trong 3 ngày.

+ Dùng pipet (5.1) chuyển môi trường nước thịt đã cấy mẫu sang 2 ống môi trường canh thang thịt mới, mỗi ống 0,5 ml, sau đó ủ ở tủ ấm (5.3) và theo dõi trong 14 ngày.

6.2.1.3  Đánh giá kết quả

- Mẫu đạt yêu cầu kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn khi không có dấu hiệu phát triển của vi sinh vật trên môi trường đã nuôi cấy mẫu trong thời gian theo dõi.

- Đối với mẫu có xuất hiện tạp nhiễm: tiến hành xác định số lượng khuẩn lạc tạp nhiễm trong một liều đông khô. Mẫu được coi là đạt khi trong một liều không được vượt quá 01 đơn vị khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí không dung huyết.

- Trong một vài trường hợp đặc biệt (như vắc xin toàn phôi, liều lớn, không pha loãng) tiêu chuẩn đánh giá được quy định cụ thể trong quy trình kiểm nghiệm của vắc xin đó.

6.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc

6.2.2.1  Chuẩn bị

- 2 đĩa thạch Sabouraud (4.2.4).

...

...

...

6.2.2.2  Cách tiến hành

- Dùng pipet (5.1) chuyển mẫu (6.1) vào từng đĩa môi trường nuôi cấy (6.2.1.1), mỗi đĩa 0,1 ml. Sau đó sử dụng que cấy (5.4) dàn đều mẫu trên mặt thạch.

- Theo dõi trong 14 ngày ở nhiệt độ phòng.

6.2.2.3  Đánh giá kết quả

Mẫu đạt yêu cầu kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc khi không có bất cứ dấu hiệu phát triển của nấm mốc trên môi trường đã nuôi cấy mẫu trong thời gian theo dõi.

6.2.3  Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma

6.2.3.1  Chuẩn bị

- Chuẩn bị các bình nước thịt PPLO bằng cách pha chế môi trường nước thịt PPLO (4.2.6) theo hướng dẫn của nhà sản xuất,

- Chia 100 ml môi trường nước thịt PPLO đã pha chế vào bình thủy tinh (5.5) và hấp vô trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

6.2.3.2  Cách tiến hành

- Dùng pipet (5.1) chuyển từ 1 ml đến 2 ml mẫu (5.1) vào bình nước thịt PPLO (6.2.3.1), ủ các bình trong tủ ấm CO₂ (5.6) và theo dõi trong 14 ngày.

- Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày sau khi cấy mẫu, chuyển canh khuẩn trong bình trên vào 2 đĩa môi trường thạch PPLO (4.2.7), mỗi đĩa 0,1 ml.

- Ủ các đĩa đã được cấy mẫu trong tủ ấm CO₂ (5.6) và theo dõi trong 14 ngày.

6.2.3.2  Đánh giá kết quả

Mẫu đạt yêu cầu kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma khi không xuất hiện khuẩn lạc Mycoplasma trên môi trường nuôi cấy.

6.2.4  Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella

6.2.4.1  Chuẩn bị

- Chuẩn bị môi trường selenite (4.2.13) hoặc môi trường tetrathionat (4.2.14), bằng cách pha chế, phân phối 10 ml vào các ống thủy tinh (5.2) và hấp vô trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

6.2.4.2  Cách tiến hành

- Dùng pipet (5.1) chuyển 1 ml mẫu (6.1) vào một trong các ống môi trường sau: môi trường selenite (4.2.13) hoặc môi trường tetrathionate (4.2.14). Ủ các ống môi trường đã cấy mẫu ở trong tủ ấm (5.3) trong 24 h.

- Dùng pipet chuyển dung dịch từ các ống môi trường đã nuôi cấy mẫu sang các đĩa thạch đã chuẩn bị: môi trường thạch MacConkey (4.2.8), môi trường thạch Salmonella - Shigella (4.2.9), môi trường thạch Brilliant Green (4.2.10), môi trường thạch desoxycholate citrate (4.2.11) hoặc môi trường thạch XLD (4.2.12), mỗi đĩa 0,1 ml. Ủ các đĩa đã cấy mẫu trong tủ ấm (5.3) và theo dõi từ 24 h đến 48 h.

6.2.4.3  Đánh giá kết quả

Mẫu đạt yêu cầu kiểm tra tạp nhiễm Salmonella khi không có sự xuất hiện của khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella trên các môi trường nuôi cấy.

6.3  Kiểm tra tạp nhiễm, vi rút ngoại lai

Tùy theo từng loại vắc xin mà sử dụng 1 trong các phương pháp sau:

6.3.1  Kiểm tra trên trứng

Kiểm tra trên trứng được thực hiện bằng cách tiêm vào màng đệm niệu nang (CAM) hoặc túi xoang niệu (AS) trên trứng gà có phôi (4.3.1). Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

...

...

...

- Dùng bơm tiêm 1 lần (5.9) lấy mẫu kiểm tra tiêm vào màng CAM cho 10 trứng gà có phôi (4.3.1), mỗi trứng được tiêm 10 liều vắc xin đã trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu của vi rút có trong vắc xin. Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở tủ ấm (5.3) đến 120 h sau tiêm. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi. Những phôi chết trước 24 h sau khi gây nhiễm được loại bỏ. Tất cả phôi chết sau 24 h và những phôi còn sống được kiểm tra bệnh tích ở màng CAM và phôi.

- Đánh giá kết quả: lô mẫu đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết khi tất cả phôi sống khỏe từ 24 h đến 120 h sau tiêm và không có bệnh tích trên màng CAM.

6.3.1.2  Tiêm túi xoang niệu

- Dùng bơm tiêm 1 lần (5.9) lấy mẫu tiêm vào túi xoang niệu cho 10 trứng gà có phôi (4.3.1), mỗi trứng được tiêm 10 liều vắc xin đã trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu của vi rút có trong vắc xin. Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở tủ ấm (5.3) đến 120 h sau tiêm. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi. Những phôi chết trước 24 h sau khi gây nhiễm được loại bỏ. Tất cả phôi chết sau 24 h và những phôi còn sống được kiểm tra bệnh tích trên phôi và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch niệu nang.

- Đánh giá kết quả: mẫu đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết khi tất cả phôi sống khỏe từ 24 h đến 120 h sau tiêm và không gây ngưng kết hồng cầu trong dịch niệu nang.

6.3.2  Kiểm tra trên gà

- Sử dụng 10 gà (4.3.2), mỗi gà được tiêm dưới da hoặc tiêm bắp hoặc nhỏ mắt 10 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Theo dõi gà thí nghiệm trong 21 ngày. Sau đỏ gà thí nghiệm được lấy máu, chắt huyết thanh để làm phản ứng huyết thanh học tương ứng với kháng nguyên Newcastle, Viêm phế quản truyền nhiễm, Marek, Hội chứng giảm đẻ 76, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae và Salmonella pullorum.

- Đánh giá kết quả: mẫu đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết khi tất cả gà khỏe mạnh, âm tính với các kháng nguyên nêu trên.

...

...

...

- Mẫu được trung hòa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu, sau đó gây nhiễm mẫu đã được trung hòa vào ít nhất một loại tế bào sơ cấp 1 lớp hoặc tế bào dòng thích hợp. Hấp phụ mẫu đã trung hòa ở tủ ấm (5.3) trong 1 h, bổ sung môi trường nuôi cấy và nuôi cấy tiếp tế bào ở tủ ấm (5.3). Theo dõi sự phát triển của tế bào trong 1 tuần. Nếu không phát hiện thấy bệnh tích tế bào tiến hành phản ứng hấp phụ hồng cầu, sử dụng hồng cầu chuột lanq hoặc hồng cầu các loài động vật mà vắc xin dự định sử dụng, để phát hiện các tác nhân gây hấp phụ hồng cầu.

- Đánh giá kết quả: mẫu đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết nếu không phát hiện được tác nhân gây hấp phụ hồng cầu.

6.3.4  Phương pháp nhuộm Gram

- Các bước thực hiện của phương pháp nhuộm Gram được quy định tại phụ lục A.

- Đánh giá kết quả: mẫu đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết khi nhuộm Gram chỉ phát hiện hình thái vi khuẩn tương ứng với vắc xin.

6.4  Kiểm tra sự có mặt của formaldehyde trong vắc xin: phương pháp sắt (III) clorua

- Pha loãng mẫu ở nồng độ 1:200 (phần thể tích) (nếu mẫu ở dạng nhũ dầu thì pha loãng ở nồng độ 1:20 (phần thể tích)). Dùng pipet (5.1) lấy 0,5 ml mẫu đã pha loãng cho vào ống nghiệm thủy tinh (5.2), thêm 0,5 ml formaldehyde chuẩn (4.1.4) đã pha loãng theo tỷ lệ 1:200 (phần thể tích) và 0,5 ml methylbenzothiazole hydrazone hydrocloride (4.1.5). Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ bằng máy lắc (5.7) và để đứng ống nghiệm trong 60 min ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 1 ml sắt (III) clorua (FeCI₃) trong axit sulfamic (NH₂SO₃H) (4.1.6) và để đứng ống nghiệm trong 15 min ở nhiệt độ phòng.

- Đo độ hấp phụ của mẫu và chất chuẩn bằng máy đo quang phổ (5.8) tại bước sóng 628 nm.

- Mẫu được xem là đạt nếu độ hấp phụ đo được nhỏ hơn 0,74.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(quy định)

...

...

...

A.1  Thuốc thử

A.1.1  Dung dịch tím gentians, sản phẩm thương mại.

A.1.2  Dung dịch lugol, sản phẩm thương mại.

A.1.3  Dung dịch alcohol 90 %.

A.1.4  Dung dịch fuchsin kiềm, sản phẩm thương mại.

A.2  Thiết bị và dụng cụ

A.2.1  Phiến kính sạch.

A.2.2  Que cấy vô trùng.

A.2.3  Đèn cồn.

...

...

...

Bước 1: Dùng pipet (4.1) nhỏ 10 μl vắc xin lên phiến kính (A.2.1) rồi dùng que cấy (A.2.2) dàn đều.

Bước 2: Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn (A.2.3) từ 2 lần đến 3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.

A.4  Cách tiến hành

Bước 1: Dùng pipet (4.1) nhỏ một lượng dung dịch tím gentians (A. 1.1) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 2: Dùng pipet (4.1) nhỏ một lượng dung dịch lugol (A.1.2) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để 1 min, sau đỏ rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 3: Dùng pipet (4.1) nhỏ một lượng dung dịch alcohol (A.1.3) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 4: Dùng pipet (4.1) nhỏ một lượng dung dịch fuchsin sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để 1 min, sau đó rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 5: Xem tiêu bản dưới kính hiển vi (4.12) ở vật kính dầu 100 X.

...

...

...

[1] ASEAN, (2012). ASEAN standards for animal vaccines. Appendix 2 - Guidelines for sterility testing of veterinary vaccines. 2nd edition, p99 -101.

[2] ASEAN, (2012). ASEAN standards for animal vaccines. Appendix 3 - Guidelines for testing for extraneous viruses in veterinary vaccines. 2nd edition, p102 - 104.

[3] VICH GL25 (2020). Biologicals: Formaldehyde Testing of Residual Formaldehyde.

[4] American Society for Microbiology © 2016: Gram stain Protocols