Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-7:2011 về bệnh động vật - quy trình chẩn đoán

• Số hiệu: TCVN8400-7:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Các tiêu bản	Kết quả huỳnh quang	Kết luận
Bệnh phẩm	Có	Có vi rút gây bênh đậu cừu và đậu dê
Bệnh phẩm	Không	Không có vi rút gây bệnh đậu cừu và dê

5.2.2.4.3 Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp

Chuẩn bị mẫu và cố định tiêu bản: xem 5.2.2.4. Gắn kháng huyết thanh vi rút đậu dê lên tiêu bản.

Nhỏ 0,1 đến 0,2 ml kháng huyết thanh vi rút đậu dê chế trên thỏ lên mỗi tiêu bản đặt trong khay ấm để ở nhiệt độ 37oC trong 30 min (tiêu bản luôn luôn ướt trong suốt quá trình ủ).

Rửa giống như 5.2.2.4.

Lấy tiêu bản ra để khô, nhỏ chất gắn kết (anti-rabbit gamma-globµlin conjugated to FITC) lên các tiêu bản, đặt vào khay ẩm ở 37oC trong 30 min.

Lấy tiêu bản ra rửa và làm tiếp như trên.

Đọc kết quả giống như phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp.

5.2.2.5 Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR hoặc Realtime PCR

5.2.2.5.1 Chiết tách ADN

...

...

...

Chuẩn bị mẫu: đối với mẫu máu, lấy 200 µl cho vào 200 µl EDTA, lắc đều rồi cho vào đông lạnh sau đó lấy ra để tan; đối với mẫu mô (tổ chức bị bệnh, các vảy, mụn đậu), nghiền khoảng 0,5 g mẫu với 1 ml PBS (A.2) sau đó ly tâm lấy dịch nổi; đối với tăm bông dịch tiết, lắc đều dung dịch bảo quản chứa tăm bông dịch tiết trước khi chiết tách.

Cho 200 µl mẫu máu có EDTA hoặc mẫu dịch tiết vào 100 µl dung dịch đệm lysis (A.7) hoặc 200 µl mẫu mô vào 1 ml dung dịch đệm lysis trong ống 1,5 ml.

Cho 1 µl proteinase K vào mẫu máu, dịch tiết hoặc 10 µl vào mẫu mô. Ủ mẫu ở 56 oC trong 2 h.

Nung nóng mẫu ở nhiệt độ 100oC trong 10 min để vô hoạt enzyme Proteinase K.

Cho 1 thể tích mẫu vào 1 thể tích hỗn hợp phenol : cloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1, phần thể tích) (300 µl vào mẫu máu, swab và 1000 µl vào mẫu mô), lắc mẫu bằng máy Vortex, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 min.

Ly tâm 14500g trong 15 min.

Cho 2 thể tích etanol (99,99 %) đã được làm lạnh gần 0 oC vào 1 thể tích mẫu rồi để mẫu vào -20 oC trong 1 h.

Ly tâm mẫu ở 14500g trong 15 min rồi loại bỏ dịch nổi.

Rửa phần cặn bằng 100 µl etanol 70 % đến 75 %.

...

...

...

5.2.2.5.2 Phương pháp PCR

a) Chuẩn bị cặp mồi (primers)

Cặp mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen mã hóa protein bám gắn của vi rút để khuếch đại một sản phẩm có kích thước 191 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:

Mồi

Trình tự

Mồi xuôi (Forward primer)

5’-d TTTCCTGATTTTTCTTACTAT 3’

Mồi ngược (Reverse primer) 

5’-d AAATTATATACGTAAATAAC

...

...

...

b) Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị hỗn hợp mẹ (master) theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Nguyên liệu

Lượng cho 01 phản ứng, µl

Nước không chứa nuclease

9,5

Platinium quantitative PCR superMix-UDG

12,5

...

...

...

1

Mồi ngược (Reverse primer)

1

Tổng lượng

24,0

Tính lượng hỗn hợp mẹ (master) cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một phản ứng nhân với tổng số mẫu và đối chứng.

Sau khi pha hỗn hợp mẹ, chia 24 µl hỗn hợp mẹ vào các ống PCR, sau đó cho 1 µl mẫu/đối chứng ADN dương vào các ống thích hợp, 1 µl nước sạch nuclease vào ống đối chứng âm, ly tâm nhanh, rồi đặt ống PCR vào máy PCR.

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt dựa theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

...

...

...

Chu kỳ 2

Chu kỳ 3

42 oC, 2 min;

40 x (94 oC, 1 min; 50 oC, 30 s; 72 oC,1 min)

72 oC, 1 min

94 oC, 10 min

Giữ ở 4 oC

c) Điện di và hiển thị sản phẩm PCR

...

...

...

Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di.

Pha 2 µl đệm tải mẫu (loading dye) với 4 µl 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel.

Pha 2 µl đệm tải mẫu vơi 8 µl mẫu (đối chứng âm và dương) rồi đưa vào các giếng còn lại của miếng gel.

Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min.

d) Đọc kết quả PCR sau khi điện di

Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương có kích thước 191 bp là dương tính. Đối chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện.

Phân biệt vi rút đậu dê và đậu cừu: Lấy 5 µl sản phẩm PCR (191 bp) trộn với 20 µl đệm có chứa 20 đơn vị enzymEcoRI (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), ủ ở 37 oC trong 3 h. Sau đó điện di sản phẩm như trên trong 2 h và đọc kết quả. Đối với vi rút đậu dê, chỉ xuất hiện 1 vạch sản phẩm duy nhất 191 bp, không bị phân cắt bởi enzym EcoRI. Đối với vi rút đậu cừu, xuất hiện 2 vạch sản phẩm, do sản phẩm 191 bp bị phân cắt bởi enzym EcoRi thành 2 đoạn 129 bp và 62 bp.

5.2.2.5.3 Phương pháp Real-time PCR

a) Chuẩn bị cặp mồi (primers) và mẫu dò (probe)

...

...

...

Mồi và mẫu dò

Trình tự

Mồi xuôi (Forward primer)

5’-GGAATGATGCCRTCTARATTCCTATC-3’

Mồi ngược (Reverse primer)

5’-CCCTGAAACATTAGTATCTGTATTTGTTGC-3’

Mẫu dò (Taqman probe)

5’-Cy5-CATCRCATCTAGGTTCRCAATGGATT-3’-TAMRA

Pha các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 pmol/µl để sử dụng.

...

...

...

Chuẩn bị hỗn hợp mẹ theo hướng dẫn của bộ kit.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Nguyên liệu

Lượng cho 01 phản ứng, µl

Nước không chứa nuclease

5,5

Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG

12,5

Mồi xuôi, 10 µM

...

...

...

Mồi ngược,10 µM

0,5

Mẫu dò, 10 µM

0,5

Platinum Taq ADN Polymerase

0,5

Tổng lượng

20,0

Tính lượng hỗn hợp mẹ cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một phản ứng nhân với tổng số mẫu và đối chứng. Sau khi pha Master mix:

...

...

...

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt dựa theo hướng dẫn của bộ kít.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies.

Chu kỳ 1

Chu kỳ 2 x 40 vòng

50oC, 2 min,

94oC, 15 s; 60o đến 65oC, 30 s đến 45 s

95oC, 10 min

c) Đọc kết quả

...

...

...

5.2.3 Phát hiện kháng thể

5.2.3.1 Khái quát

Kháng thể được phát hiện bằng phương pháp trung hòa huyết thanh. Phương pháp này có thể định tính và định lượng kháng thể bệnh đậu cừu và đậu dê có trong huyết thanh kiểm tra.

Huyết thanh pha loãng kết hợp với một lượng vi rút đậu dê (đậu cừu) nhất định là 100 liều TCID50 sau đó nhiễm lên tế bào tinh hoàn cừu hoặc tế bào thận cừu, theo dõi sự phá hủy của tế bào

5.2.3.2. Chuẩn độ vi rút (xem sơ đồ tại Phụ lục C)

Hoàn nguyên vi rút đông khô bằng 1 ml môi trường DMEM, sau đó tiếp tục pha loãng 1:10.

Nhiễm từ 0,3 ml đến 0,5 ml dung dịch vi rút lên tế bào LT trong chai T75 hoặc T175, ủ 37 oC trong 1 tuần.

Thu hoạch vi rút khi CPE đạt khoảng 90 %, rồi thực hiện quy trình đông (-70oC) và tan 3 lần để giải phóng vi rút khỏi tế bào.

Lắc chai nuôi cấy nhẹ và hút tất cả dung dịch tế bào vào ống ly tâm 30 ml, ly tâm 350g trong 3 min.

...

...

...

Chuẩn bị 8 ống (2 ml) vô trùng có chứa 900 µl môi trường DMEM chứa hepes, 10% FCS và gentamycin (0,05 mg/ml).

Lấy 100 µl dung dịch vi rút cần chuẩn độ cho vào ống thứ nhất có chứa 900 µl môi trường DMEM, trộn đều, rồi bỏ đầu típ pipet đi. Nồng độ vi rút 10-1 được chuẩn bị.

Sử dụng đầu tip pipet mới hút 100 µl từ ống thứ nhất (có nồng độ vi rút 10-1) sang ống thứ 2, trộn đều, bỏ đầu típ pipet. Nồng độ vi rút 10-2 được chuẩn bị.

Tiếp tục pha loãng như trên để có nồng độ vi rút từ 10-3 đến 10-8.

Sử dụng đầu tip pipet riêng rẽ để hút 200 µl dung dịch vi rút ban đầu và của mỗi nồng độ vi rút để chuyển sang các giếng từ A1 đến A9 trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng. Lặp lại tương tự cho các giếng từ B1 đến B9; từ C1 đến C9 và từ D1 đến D9.

Các giếng đối chứng tế bào: A11, A12, B11, B12, C11, C12, D11, D12, cho 200 µl môi trường DMEM có hepes, 10 % huyết thanh thai bê và kháng sinh.

Cho 80 µl tế bào LT có nồng độ 480 000 tế bào/ml vào tất cả các giếng.

Ủ đĩa chuẩn độ vi rút ở 37oC với 5% CO2 trong 12 ngày hoặc cho đến khi các giếng tế bào bắt đầu thoái hóa.

Tính toán lượng vi rút chuẩn độ bằng công thức Reed và Muench.

...

...

...

Đánh dấu đĩa trung hòa theo sơ đồ tại Phụ lục C.

Xử lý huyết thanh ở 560C trong 30 min.

Pha loãng huyết thanh kiểm tra, đối chứng dương và âm tính thành 1/5 trong môi trường DMEM: 100 µl huyết thanh + 400 µl môi trường DMEM

Nhỏ 100 µl môi trường phát triển (DMEM) bổ sung Hepes, 10 % FCS và kháng sinh vào các giếng từ cột 2 đến cột 12, riêng các giếng ở 2 hàng đối chứng tế bào, cho vào 20 µl môi trường DMEM

Nhỏ 200 µl huyết thanh kiểm tra (pha loãng1/5 trong môi trường DMEM) vào cột 1 trong đĩa, mỗi mẫu 2 giếng.

Dùng pipet đa kênh pha loãng huyết thanh kiểm tra theo cơ số 2 từ hiệu giá 1:10 tới hiệu giá 1:160. Mỗi nồng độ 2 giếng, mỗi giếng 100 µl.

Chuẩn bị dung dịch vi rút 100 TCID50 và 4 độ pha loãng khác của nó từ 10-1 đến 10-4.

Nhỏ 100 µl dung dịch vi rút 100 TCID50 vào các giếng có huyết thanh và đối chứng vi rút, 100 µl của mỗi độ pha loãng vào các giếng kiểm tra chuẩn độ vi rút, mỗi nồng độ 4 giếng Ủ 37 0C với 5 % CO2 trong 1 h.

Thêm 80 µl dịch tế bào, ủ 37 0C với 5 % CO2 tới 12 ngày.

...

...

...

Các giếng đối chứng huyết thanh dương tính

Không có CPE

Các giếng đối chứng huyết thanh âm tính

Đều có CPE

Các mấu huyết thanh được coi là dương tính

Không có CPE

Hiệu giá kháng thể kiểm tra được tính bằng

Độ pha loãng cao nhất của giếng có CPE

Các giếng đối chứng tế bào

...

...

...

Các giếng kiểm tra chuẩn độ vi rút

Để chỉ báo sự phát triển của vi rút trong phản ứng là tối ưu. Một nửa số giếng ở độ pha loãng vi rút 10-2 phải có CPE vào giai đoạn cuối của phản ứng. Tất cả các giếng ở độ pha loãng vi rút thấp hơn có CPE và độ pha loãng cao hơn không có CPE

6. Kết luận

Cừu, dê được xác định mắc bệnh đậu cừu và đậu dê khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh đậu cừu và đậu dê và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phân lập và giám định cho kết quả dương tính.

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính.

- Phản ứng PCR hoặc real-time PCR phát hiện vi rút dương tính. - Phản ứng kháng thể huỳnh quang dương tính.

- Phản ứng trung hòa huyết thanh dương tính đối với dê chưa tiêm phòng vacxin.

...

...

...

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch kháng khuẩn

Penicilin                                                1.000.000 UI

Kanamycin                                            1.000.000 UI

Streptomycin                                        200 mg

Mycostatin                                             250.000 UI

Nước                                                    10 ml

Hòa tan các kháng sinh rồi lọc bằng màng lọc 0,45 µm. Bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh.

...

...

...

NaCl                                                      80 g

KCl                                                        2 g

Na2HPO4                                             11,5 g

KH2PO4                                               2 g

Nước                                                    1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1 N và dung dịch HCl 1 N. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 40C đến 80C.

A.3 Dung dịch PBST (PBS 0,03 M, 1 % Tween 20, pH 7,4)

Lấy 300 ml PBS 0,1 M pha với 700 ml nước, sau đó bổ sung 1 % Tween 20.

A.4 Dung dịch đệm ngăn chặn (PBS 0,15 M, 1 % Tween 20, 2 % BSA, pH 7,4)

...

...

...

KCl                                                        3 g

Na2HPO4                                              17,25 g

KH2PO4                                                3 g

Nước                                                     1000 ml

Bổ sung 1 % Tween 20, 2 % BSA, chỉnh pH đến 7,4. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 0C đến 8 0C.

A.5 Dung dịch đệm phủ, pH 9,6

NaHCO3                                                                          2,93 g/l

Na2CO3                                                                           1,59 g/l

Pha loãng dung dịch đệm phủ 0,05 M năm lần để được dung dịch 0,01 M.

...

...

...

Orthophenylen diamin [C6H4(NH2)2]                                  30 mg

Nước                                                                                    75 ml

Bổ sung 0,05 % hydro peroxit (H2O2).

A.7 Dung dịch đệm lysis (lysis buffer)

Guanidin thiocyanat                                                 60 g

KCl                                                                           0,378 g

Tris (1 M, pH 8)                                                        1 ml

Tween 20                                                                 0,5 ml

Nước vừa đủ                                                            100 ml

...

...

...

A.8 Dung dịch đệm glyxerin pH 8,3

NaHCO3                                                                   0,0715 g

Na2CO3                                                                   0,0016 g

Nước                                                                        10 ml

Glyxerin vừa đủ                                                        100 ml

Bảo quản ở nhiệt độ 4 oC, dùng khi đọc huỳnh quang.

A.9 Dung dịch PBS- không có Ca++ và Mg++

NaCl                                                      8,0 g

KCl                                                        0,2 g

...

...

...

KH2PO4                                               0,2 g

Nước vừa đủ                                        1000 ml

Chỉnh pH 7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.10 Dung dịch PBS+ có Ca++ và Mg++

NaCl                                                      8,0 g

KCl                                                        0,2 g

Na2HPO4                                              1,15 g

KH2PO4                                                0,2 g

CaCl2                                                    0,1 g

...

...

...

Nước vừa đủ                                        1000 ml

Chỉnh pH 7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

CHUẨN BỊ TẾ BÀO TINH HOÀN CỪU SƠ CẤP

B.1. Chuẩn bị tế bào tinh hoàn cừu sơ cấp

Thực hiện các bước trong điều kiện vô trùng như sau:

Cắt tinh hoàn cừu vào chai có chứa dung dịch đệm PBS+ (A.10) để vận chuyển.

...

...

...

Dùng pank và kéo để giữ các tinh hoàn và cắt bỏ những phần mô liên kết và mỡ và màng tinh hoàn. Sau đó cắt tinh hoàn thành miếng nhỏ.

Chuyển những mẩu tinh hoàn vào ống ly tâm 50 ml và cho thêm 40 ml PBS- (A.9). Lắc nhẹ, đều ống ly tâm và ly tâm ở 2000g trong 10 min. Tuỳ thuộc vào lượng tinh hoàn để sử dụng nhiều ống ly tâm hơn.

Sau khi ly tâm, hút bỏ dịch nổi. Thêm 40 ml PBS- (A.9) vào ống ly tâm, lắc đều và ly tâm như trên. Lặp lại bước này thêm 2 lần.

Sau lần ly tâm cuối, thu phần tế bào lắng cặn bên dưới để hoà với 30 ml Dispase 0,3% ấm (có nhiệt độ từ 35oC đến 39oC). (Chuẩn bị Dispase 0,3% như sau: hoà 1 g Dispase với 330 ml PBS- (A.9) và tiệt trùng bằng lọc qua màng lọc 0,2 µm). Lắc nhẹ ống để làm tơi phần tế bào lắng cặn.

Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào vào các chai nuôi cấy thích hợp. Thêm 70 ml Dispase 0,3 % và lắc đều trong vòng 1 h trên máy khuấy từ.

Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào vào 2 ống ly tâm 50 ml và ly tâm ở 2000g trong 10 min.

Hút bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn với môi trường duy trì tế bào (môi trường Glasgow Eagle’s) không có huyết thanh và lắc đều để làm tơi phần tế bào lắng cặn.

Chuẩn bị môi trường tế bào có bổ sung các yếu tố tăng trưởng và kháng sinh (môi trường DMEM + Hepes + 10 % huyết thanh thai bê + kháng sinh penicilin và streptomycin). Sau đó chia 70 ml môi trường tăng trưởng vào mỗi chai nuôi cấy (175 cm2).

Dùng pipet trộn đều tế bào đã được hoà với môi trường duy trì trong ống ly tâm 50 ml ở trên rồi chuyển một lượng bằng nhau vào các chai nuôi cấy có môi trường tăng trưởng. Tuỳ thuộc vào Lượng tế bào trong mỗi ống ly tâm có thể chia ra cho từ 5 chai đến 15 chai nuôi cấy (175 cm2).

...

...

...

Đặt các chai nuôi cấy vào tủ ấm ở 35oC đến 39oC. Theo dõi sự phát triển của tế bào và kiểm tra tạp khuẩn hàng ngày.

Tỷ lệ phát triển của tế bào như sau:

- Sau 24 h: từ 30 % đến 40 % diện tích nuôi cấy được bao phủ.

- Sau 48 h: từ 60 % đến 80 % diện tích nuôi cấy được bao phủ.

- Sau 72 h: 100 % diện tích nuôi cấy được bao phủ.

Sau khi tế bào đạt 100% diện tích nuôi cấy, có thể cấy chuyển đời tế bào sang môi trường mới, đông lạnh. Nếu không thay môi trường, có thể duy trì được trong thời gian 10 ngày ở 37oC hoặc lâu hơn nếu để ở 28oC đến 33oC hoặc nếu giảm nồng độ huyết thanh từ 5% xuống 1%.

B.2. Chuyển đời tế bào

Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS- (A.9) vào để rửa lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch đệm PBS.

Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào và ủ ở 37oC trong 2 min đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ chai nuôi cấy để tế bào bong ra.

...

...

...

Hút bỏ phần dịch nổi. Hoà phần tế bào lắng cặn với môi trường tăng trưởng (10 ml). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.

Chia đều dung dịch tế bào sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường tăng trưởng mới. Ủ ở 37 OC, từ 5 ngày đến 7 ngày. Theo dói tế bào phát triển hàng ngày và kiểm tra tạp khuẩn.

Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lương tế bào từ một chai (175 cm2) đạt 100 % diện tích nuôi cấy, có thể chuyển đời sang 5 chai (175 cm2) khác.

Nếu tế bào phát triển kém, hút bỏ môi trường cũ, rửa thảm tế bào bằng PBS+ (A.10), rồi đưa môi trường tăng trưởng mới vào.

B.3. Đông lạnh tế bào

Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS - (A.9) vào để rửa lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch PBS- (A.9).

Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào và ủ ở 37OC trong 2-5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ chai nuôi cấy để tế bào bong ra.

Hút toàn bộ dung dịch tế bào sang ống ly tâm thích hợp. Ly tâm ở 2000g trong 5 min.

Bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn trong 1 ml môi trường không có huyết thanh (Glasgow Eagle’s) và dùng pipet trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống.

...

...

...

Chuyển 4 ml dung dịch tế bào vào ống đông lạnh (4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông hoặc giấy vệ sinh để làm chậm quá trình đông lạnh. Đặt ống đông lạnh vào nhiệt độ -50oC đến - 90oC qua đêm, sau đó chuyển vào giữ ở nitơ lỏng.

B.4. Khôi phục tế bào

Lấy ống tế bào được đông lạnh trong nitơ lỏng ra và đặt vào nước ấm 35oC đến 39oC cho đến khi rã đông hoàn toàn.

Trong khi tế bào rã đông, chuẩn bị chai nuôi cấy với môi trường tăng trưởng (DMEM Modified + Hepes + 10% huyết thanh thai bê + kháng sinh).

Đảo ngược ống đông lạnh từ 2 lần đến 3 lần, dùng pipet hút dung dịch tế bào sang một ống thích hợp và trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống để tránh bọt.

Chuyển tế bào vào chai nuôi cấy có môi trường tăng trưởng, ủ ở 35oC đến 39oC qua đêm.

Vào buổi sáng ngày hôm sau, thay môi trường tăng trưởng để loại bỏ DMSO: rửa lớp tế bào bằng PBS+ (A.10), rồi cho môi trường tăng trưởng mới vào, ủ ở 35oC đến 39oC để tế bào phát triển.

PHỤ LỤC C

...

...

...

SƠ ĐỒ ĐĨA CHUẨN ĐỘ VI RÚT VÀ ĐÁNH DẤU ĐĨA LÀM PHẢN ỨNG TRUNG HÒA HUYẾT THANH