Phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010?

Nội dung chính

• Phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010?
• Các thiết bị và chuẩn bị mẫu thử phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) quy định như thế nào?
• Quá trình khuếch đại khi thực hiện định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) như thế nào?

Phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010?

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010 về thủy sản và sản phẩm thủy sản - Phát hiện Salmonella bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010 quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR)

Khi thực hiện phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) cần lưu ý những nguyên tắc sau:

Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA) có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm.

Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.

Lưu ý: Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI-1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen inv.

Phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010? (Hình từ Internet)

Các thiết bị và chuẩn bị mẫu thử phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) quy định như thế nào?

Theo Mục 4 và Mục 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010 quy định như sau:

[1] Thiết bị, dụng cụ

- Tủ ấm, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 0C.

- Máy luân nhiệt.

- Máy ly tâm, loại dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.

- Máy lắc ống nghiệm.

- Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di, có điện thế hoạt động từ 80 V đến 150 V.

- Hộp đèn soi UV, có kính lọc 302 mm.

CẢNH BÁO – Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.

- Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

- Ống Eppendorf, 0,2; 0,5 và 1,5 ml, loại chuyên dùng cho PCR.

[2] Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử không quy định trong Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010. Nên lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.

Quá trình khuếch đại khi thực hiện định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) như thế nào?

Theo Tiểu mục 6.4 Mục 6 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8342:2010 quy định về quy trinhg khuếch đại khi tiến hành định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR) như sau:

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

CẢNH BÁO

- Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.

- Phòng thử nghiệm phải được bố trí tách khỏi khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.

[1] Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR dung tích 0,2 ml hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng dung tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

Đối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.

Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước.

[2] Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:

Duy trì nhiệt độ 95 độ C trong 5 min để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95 độ C/60s; 54 độ C/45s và 72 độ C/60s. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72 độ C trong 10 min, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20 độ C cho đến khi điện di.

Trân trọng!