|
Bước kiểm chứng
|
Kiểm chứng môi
trườngb
|
Kiểm chứng mẫu
trắng tách chiếtc
|
Kiểm chứng tách
chiết dương tínhd
|
Kiểm chứng ADN
dương tính đíche
|
Kiểm chứng ADN âm
tính đíchf
|
Kiểm chứng thuốc
thử khuyếch đạig
|
Kiểm chứng chất ức
chế phản ứng PCRh
|
|
Đồng hóa
|
Khuyến cáo
|
|
|
|
|
|
|
|
tách chiết axit nucleic
|
¯a
|
một/dãy thử
|
bắt buộc tại các
khoảng định kỳ
|
|
|
|
|
|
Đánh giá chất lượng axit nucleic
|
¯
|
¯
|
¯
|
|
|
|
|
|
Khuyếch đại axit nucleic
|
¯
|
¯
|
¯
|
bắt buộc
|
khuyến cáo
|
bắt buộc
|
khuyến cáo nhưng
bắt buộc trong một số trường hợp
|
|
Đánh giá kết quả khuyếch đại axit nucleic
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
|
Diễn giải
|
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
|
Báo thử nghiệm
|
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
¯
|
|
a Các mũi tên cho thấy việc kiểm chứng này
được áp dụng trong các bước phân tích tiếp theo.
b Sử dụng việc kiểm chứng môi trường giúp
cho phòng thử nghiệm nhận biết được các nguồn nhiễm bẩn ở giai đoạn sớm và
thậm chí có thể được sử dụng để nhận biết được tại khu vực làm việc có sự
nhiễm bẩn.
c Ít nhất một kiểm chứng tách chiết mẫu
trắng phải được thực hiện cho mỗi lần tách chiết ADN từ một hay nhiều mẫu.
Ống nghiệm luôn luôn nằm cuối cùng trong mỗi dãy. Ví dụ, thích hợp là đặt một
ống chiết mẫu trắng trên giá gồm 8 ống hoặc là vi đĩa 96 giếng cho một quá
trình chiết tự động.
d Thường xuyên thực hiện kiểm chứng tách
chiết dương tính khi có mẻ thuốc thử chiết mới được dùng. Việc kiểm chứng này
sẽ cho biết các sai sót về thuốc thử hay là sai sót do quá trình chiết.
e Kiểm chứng ADN dương tính đích để chứng
minh khả năng của qui trình khuyếch đại ADN của axit nucleic để phát hiện mẫu
đại diện axit nucleic của sinh vật biến đổi gen hoặc taxon đích. Việc này có
thể thực hiện được nhờ kiểm chứng tách chiết dương tính thích hợp.
f Kiểm chứng ADN âm tính đích để chứng minh
khả năng của qui trình khuyếch đại axit nucleic để tránh việc khuyếch đại
dương tính giả khi không có mặt axit nucleic của sinh vật biến đổi gen hoặc
của taxon đích.
g Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN để
chứng minh không có sự nhiễm axit nucleic trong các mẻ thuốc thử PCR được sử
dụng. Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN có thể bỏ qua khi đã kiểm chứng
tách chiết mẫu trắng.
h Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR được
sử dụng để chứng minh sự không có mặt của chất ức chế có thể hòa tan. Điều
này có thể được chứng minh qua dãy dung dịch pha loãng axit nucleic làm
khuôn. Tuy nhiên, một số đánh giá về ảnh hưởng của chất ức chế hòa tan đến
các kết quả phân tích mẫu cần phải được tiến hành.
l Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR là
bắt buộc, nếu tất cả các phép thử PCR trên mẫu thử là âm tính và đối với các
loại mẫu mà không thấy có ADN được khuyếch đại.
|
5.3. Tổ chức phòng thử nghiệm
5.3.1. Khái quát
Tuân thủ các yêu cầu về các quy định an toàn
và các khuyến nghị an toàn của nhà sản xuất và cần tuân theo hướng dẫn đã được
đưa ra trong TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/IEC 17025:1999).
5.3.2. Thiết kế phòng thử nghiệm
Sự nhiễm ADN một cách ngẫu nhiên có thể bắt
nguồn từ bụi bẩn và sol khí. Chính vì vậy, việc tổ chức khu vực làm việc trong
phòng thử nghiệm phải dựa vào:
- phân khu một cách hệ thống các bước có liên
quan đến việc tạo ra kết quả và
- theo nguyên tắc “dòng chảy xuôi: đối với
việc xử lý mẫu.
Đối với các phương pháp dựa vào ADN, thiết kế
phòng thử nghiệm được áp dụng như sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) khu vực nghiền và đồng hóa mẫu;
b) khu vực tách chiết axit nucleic từ vật
liệu thử nghiệm;
c) khu vực dành riêng cho thiết bị PCR/các
phản ứng khuyếch đại ADN;
d) khu vực dành cho các quá trình tiếp theo,
bao gồm phân tích và đặc tính hóa của trình tự ADN đã được khuyếch đại, nếu có
thể.
Nếu sử dụng kỹ thuật nghiền mẫu sinh ra các
hạt bụi thì công việc này cần được thực hiện trong khu phụ.
Việc phân chia khu vực làm việc thông qua
việc sử dụng các phòng khác nhau là hiệu quả nhất và là cách tốt nhất đảm bảo
khu vực làm việc riêng biệt, cũng có thể sử dụng các phương pháp khác để tránh
nhiễm bẩn miễn là chúng có hiệu quả tương tự.
5.3.3. Nhân viên
Ở những khu việc làm khác nhau, nhân viên mặc
quần áo khoác khác nhau ví dụ như ở khu vực nghiền hoặc khu vực sau PCR. Nhân
viên cũng phải mang găng tay dùng một lần. Nếu có thể, nên tránh dùng găng tay
có phủ bột phấn khi làm việc với các phản ứng trước PCR, vì bột phấn có thể gây
ứng chế các phản ứng PCR hoặc có thể gây nhiễm khi mà bột đó được làm từ tinh
bột ngô. Găng tay và quần áo khoác phải được thay đổi thường xuyên. Tất cả các
bước tiến hành PCR được thực hiện trong điều kiện không gây nhiễm ở mức có thể.
Tất cả các nhân viên thực hiện qui trình thử
nghiệm cần được đào tạo về các kỹ thuật thích hợp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phòng thử nghiệm cần sử dụng các trang thiết
bị đã được bảo dưỡng một cách hợp lý, phù hợp với các phương pháp sử dụng.
Ngoài các trang thiết bị của phòng thử nghiệm chuẩn, trang thiết bị phụ được mô
tả trong các phụ lục của các tiêu chuẩn cụ thể.
Dụng cụ và thiết bị phải được bảo dưỡng theo
sự chỉ dẫn của nhà sản xuất.
5.3.5. Vật liệu và thuốc thử
Đối với việc phân tích, chỉ sử dụng các loại
thuốc thử phân tích phù hợp với sinh học phân tử, không chứa ADN và ADNaza, trừ
khi có qui định khác. Các thuốc thử và các dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ
phòng, trừ khi có quy định khác. Thuốc thử PCR được bảo quản với các lượng nhỏ
để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn. Nước được sử dụng là nước cất hai lần hoặc có
chất lượng phù hợp. Các dung dịch được chuẩn bị bằng cách hòa tan các thuốc thử
phù hợp trong nước và được hấp áp lực, trừ khi có qui định khác. Có thể sử dụng
thiết bị lọc khử trùng (có cỡ lỗ là 0,22 µm) khi không thể hấp áp lực.
Để tránh nhiễm, kỹ thuật vô trùng cần được
thực hiện trong khu vực để chuẩn bị PCR, cụ thể găng tay không có bột, dụng cụ
bằng nhựa được tiệt trùng, hóa chất được hấp tiệt trùng, dụng cụ bằng nhựa vô
trùng sử dụng một lần, đầu hút pipet được bảo vệ khỏi môi trường không khí.
Vật liệu và tất cả các hộp chứa và dụng cụ
đựng thuốc thử dùng một lần cần được bảo quản khỏi các tác nhân nhiễm bẩn (ví
dụ như bụi bẩn).
Sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng dẫn
của nhà sản xuất. Tiến hành kiểm tra để đánh giá sự nguyên vẹn của thuốc thử và
không có ADNaza.
Cần đảm bảo rứng không có mặt các hoạt tính
của enzym không mong muốn (ví dụ như exonucleaza) vốn gây cản trở phản ứng PCR.
Dung dịch đệm phản ứng phải phù hợp với loại polymeraza sử dụng.
6. Diễn giải và biểu
thị kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đối với phương pháp dịnh lượng, việc tính toán
và biểu thị kết quả được đưa ra trong ISO 21570 và TCVN 7607:2007 (ISO
21572:2004). Khi nghi ngờ thì không được biểu thị kết quả.
6.2. Diễn giải các phép kiểm chứng
Mỗi phép kiểm chứng đều có giá trị hợp lệ,
nếu kết quả quan sát được đối với bất kỳ phép kiểm chứng nào khác với giá trị
hợp lệ thì phải phân tích lại. Kiểm chứng môi trường có thể là dương tính hoặc
âm tính, nhưng khi cho kết quả dương tính thì phải thực hiện các biện pháp để
loại bỏ và ngăn cản sự nhiễm do môi trường phòng thử ngihệm. Nếu kết quả thu
được không hợp lệ đối với bất kỳ một phép kiểm chứng lặp lại nào thì phải thực
hiện các biện pháp là loại bỏ hoặc thay thế những nguồn là nguyên nhân gây ra
sai lỗi rồi sau đó phân tích lại. Kết quả phân tích chỉ có thể được báo cáo khi
tất cả các phép kiểm chứng có kết quả phù hợp. Kết quả phù hợp đối với các phép
kiểm chứng như sau:
- kiểm chứng tách chiết dương tính phải luôn
dương tính;
- kiểm chứng tách chiết mẫu trắng phải luôn
âm tính;
- kiểm chứng ADN dương tính đích phải luôn
dương tính;
- kiểm chứng ADN âm tính đích phải luôn âm
tính;
- kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN phải
luôn âm tính.
Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR phải cho
thấy ảnh hưởng ức chế không đáng kể lên phản ứng (đối với phép phân tích định
tính thì ảnh hưởng của sự ức chế sẽ ít quan trọng hơn đối với phân tích định
lượng).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng 2 - Một số ví dụ
về kết quả phản ứng PCR
Mẫu thử nghiệm
Kiểm chứng tách
chiết dương tính
Kiểm chứng tách
chiết mẫu trắng
Kiểm chứng ADN âm
tính đích
Kiểm chứng ADN
dương tính đích
Kết quả
+a
+
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
-b
+
dương tính
-
+
-
-
+
âm tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+
+
-
+
không kết luận đượcc
-
-
+
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
không kết luận đượcc
-
-
-
-
-
không kết luận đượcc
a Sản phẩm PCR phát hiện được.
b Không có sản phẩm PCR được phát hiện.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d Qui trình được lặp lại sử dụng phương
pháp tách chiết khác hoặc bước tinh sạch tiếp theo (có thể có chất ức chế).
Ghi lại tất cả các bước thử nghiệm và các kết
quả thu được.
6.3. Biểu thị kết quả âm tính
Kết quả âm tính không bao giờ biểu thị
“không” hoặc là “không có mặt sinh vật biến đổi gen”.
Câu sau đây thường được xuất hiện trong báo
cáo thử nghiệm:
“Đối với chất cần phân tích X, không phát
hiện được vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen”
Ngoài ra, báo cáo thử nghiệm bao gồm các
thông tin về:
- LOD của phương pháp phù hợp trên mẫu cụ thể
và
- LOD thực tế đối với mẫu dựa trên kinh nghiệm
của phòng thử nghiệm hoặc trên mẫu được phân tích (hoặc nói rõ rằng chưa biết).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.4. Biểu thị kết quả dương tính
Câu sau đây thường được xuất hiện trong báo
cáo:
“Đối với chất cần phân tích X, đã phát hiện
được sử có mặt của vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen (nêu rõ trình tự đích đặc
hiệu)”.
Có thể nêu sự nhận dạng sinh vật biến đổi
gen, nếu biết.
6.5. Biểu thị kết quả nghi ngờ
Các kết quả của tất cả các phần thử nghiệm
phải thống nhất. Khi ít nhất một phần thử nghiệm cho kết quả dương tính và ít
nhất một phần thử nghiệm cho kết quả âm tính, thì phải phân tích lại.
Nếu ít nhất hai lần lặp lại cách tiến hành
(bắt đầu bằng tách chiết axit nucleic) cho kết quả nghi ngờ, chẳng hạn như một
kết quả dương tính và một kết quả âm tính, thì báo cáo phải nêu rõ rằng mẫu là
âm tính ở giới hạn phát hiện được biểu thị theo TCVN 7605:2007 (ISO
21569:2005) và ISO 21570.
6.6. Yêu cầu đảm bảo chất lượng
Các khía cạnh về đảm bảo chất lượng được nêu
trong TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/EIC 17025:1999).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm ít nhất bao gồm các thông
tin sau:
a) mọi các thông tin cần thiết để nhận dạng
mẫu thử;
b) bất kỳ thông tin đặc biệt nào liên quan
đến mẫu thử nghiệm (chẳng hạn: kích cỡ không phù hợp, trạng thái bị phân giải);
c) viện dẫn tiêu chuẩn này và các phụ lục
tương ứng;
d) ghi ngày và phương pháp xử lý mẫu được sử
dụng;
e) ngày nhận mẫu;
f) điều kiện bảo quản, nếu có;
g) ngày bắt đầu/kết thúc phân tích, nếu có;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
i) cỡ mẫu phòng thử nghiệm và cỡ mẫu thử;
j) các kết quả theo yêu cầu của phương pháp
cụ thể và các đơn vị được sử dụng để báo cáo kết quả, các thiết bị hiệu chuẩn
và phương pháp tính toán được sử dụng;
k) quan sát bất thường trong khi thử nghiệm;
l) bất kỳ sự sai lệch nào, thêm vào, hay bớt
đi so với quy định thử nghiệm;
m) các yêu cầu theo quy định trong báo cáo
thử nghiệm của TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005) hoặc ISO 21570;
n) mọi yêu cầu quy định trong điều 6.
Thông tin phải được ghi cùng với đơn vị đo.
Khi có yêu cầu, sự không chắc chắn và mức độ
tin cậy của phép đo sẽ được cung cấp cho người sử dụng kết quả.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] Codex Alimentarius Commission, Procedural
Manual, Twelfth Edition for Principles for the Establishment of Codex Methods
of Analysis, Guidelines on the Application of the Criteria Approach, 2001, p.
64 (see CX!MAX 01/4)
[2] HORWITZ, W. Protocol for the design,
conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Applied
Chemistry, 67, 1995, pp. 331-343
[3] Codex Committee on Methods of Analysis
and Sampling, In House method validation. In House validated methods and their
role in methods of analysis for Codex purposes. Codex Alimentarius Commission.
(CX!MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998
[4] INHORN, S.L.Quality Assurance Practices
for Health Laboratories. APHA, Washington DC, 1978, p. 588
[5] httD://www.eurachem.ul.Dt/audies/mval.htm,
ISBN 0-948926-12-0
[6] THOMPSON, M., ELLISON, S.L. and WOOD, R.
Harmonised guidelinesf-r single laboratory validation of methods of analysis.
Pure Appl. Chem., 47, No.5, 2002, pp. 835-855
[7] ARUMUGANATHAN, K. and EARLE, E.D. Nuclear
content of some important plant species. Plant Mol. Bioi. Rep., 9(3), 1991, pp.
208-218
[8] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and
precision) of measurement methods and results -Part 2: Basic method for the
determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement
method
[9] ISO 7002:1986, Agricultural food
products-Layout for a standard method of sampling from a lot
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[11] ISO Guide 30:1992, Terms and definitions
used in connection with reference materials
[12] ISOITS 21098, Foodstuffs - Nucleic acid
based methods of analysis of genetically modified organisms and derived
products - Information to be supplied and procedure for the addition of methods
to ISO 21569, ISO 21570 or ISO 21571.