Chất nền
|
Độ pha loãng
|
Đậu tương
|
1:300
|
Bột đậu tương
|
1:300
|
Bột đậu tương đã tách chất béo a
|
1:300
|
Mẫu protein a
|
1:10
|
a Các chất nền này chưa được đánh giá thử
nghiệm cộng tác. Độ pha loãng được dựa trên kinh nghiệm của nhà sản xuất.
|
Tóm tắt các bước tách chiết được nêu trong
Bảng A.2.
A.6.9.2. Quy trình phản ứng miễn dịch ELISA
A.6.9.2.1. Khái quát
Bộ thử ELISA có thể thực hiện theo nhiều dạng
khác nhau sử dụng bất kỳ số hàng nào trong các hàng 8 giếng. Nên theo cách nạp
giếng ngẫu nhiên, nghĩa là các mẫu thử và mẫu kiểm chứng không phải khi nào
cũng cần phải nạp vào một vị trí cố định để tránh các ảnh hưởng vị trí trên
khay có thể xảy ra, nếu có.
Tất cả các phản ứng phải được chạy tối thiểu
hai lần song song và tính giá trị hấp thụ trung bình. Mỗi lần chạy bao gồm:
phép thử trắng, mẫu trắng và dung dịch chuẩn đối chứng dương.
Khi đã bắt đầu phân tích thì tất cả các bước
phải được hoàn tất mà không bị gián đoạn.
Tóm tắt quy trình ELISA được đưa ra trong
bảng A.3.
A.6.9.2.2. Ủ ấm
Dùng micropipet lấy 100 ml dung dịch mẫu pha loãng và dung dịch
mẫu chuẩn cho vào các giếng thích hợp và tiến hành phép thử trắng. Sử dụng các
tip riêng cho mỗi lần hút pipet để tránh nhiễm bẩn sang các lần tiếp theo. Bọc
khay bằng giấy bóng kính hoặc giấy nhôm (A.5.4) để tránh nhiễm bẩn và bay hơi.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ủ ấm khay vi đĩa ở 37 oC trong 1
giờ.
A.6.9.2.3. Rửa
Rửa 3 lần bằng 300 ml dung dịch đệm rửa (A.6.7) bằng cách
dùng máy trộn (A.5.8).
Rửa thủ công: Đổ hết lượng chứa trong các
giếng bằng cách lật úp xuống các chậu rửa hoặc thùng rác. Dùng chai rửa loại
500 ml chứa dung dịch rửa, làm đầy các giếng, để khoảng 60 giây, sau đó lại đổ
hết như trên. Lặp lại các bước rửa đó ít nhất 3 lần. Loại bỏ dịch lỏng và bọt
khí còn sót lại bằng cách lật úp xuống lớp giấy lau.
Để tránh các hàng giếng bị rơi khỏi giá đỡ,
nên dùng băng dính dán lại.
Rửa tự đồng: Sau khi ủ, dùng máy rửa vi đĩa
hút hết lượng chứa trong các giếng, sau đó đổ đầy các giếng bằng dung dịch đệm
rửa làm việc. Lặp lại thao tác hút rửa giếng ít nhất 3 lần. Cuối cùng, dùng máy
hút khô các giếng rồi vỗ các khay lật úp lên tập giấy lau để loại hết chất lỏng
và bọt khí.
CHÚ THÍCH 1 Không được để các giếng khô hẳn,
vì có thể ảnh hưởng đến việc phân tích.
CHÚ THÍCH 2 Rửa không kỹ sẽ làm sai lệch kết
quả. Dù rửa thủ công hay rửa bằng máy, cũng phải chắc chắn rằng mỗi giếng đều
được rửa như nhau với các thể tích bằng nhau.
A.6.9.2.4. Bổ sung dung dịch kháng thể cộng
hợp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trước khi ủ, lắc nhẹ các khay vi đĩa bằng
cách dùng ngón tay trỏ và ngón cái cầm mép ngắn của khay và đưa nhẹ sang hai
phía.
Ủ các khay vi đĩa ở nhiệt độ 37 oC
trong 1 giờ.
A.6.9.2.5. Rửa
Sau giai đoạn ủ, lặp lại các bước rửa như mô
tả ở trên (A.6.9.2.3)
A.6.9.2.6. Bổ sung cơ chất
Dùng micropipet lấy 100 ml cơ chất màu (A.4.2.6) cho vào mỗi
giếng. Lắc nhẹ khay và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Việc bổ sung cơ chất màu phải thực hiện liên
tục, không gián đoạn. Duy trì trình tự và khoảng cách thời gian như nhau trong
quá trình bổ sung dung dịch.
A.6.9.2.7. Bổ sung dung dịch hãm
Sau khi ủ, dùng pipet lấy 100 ml dung dịch hãm (A.4.2.7) cho vào mỗi
giếng, việc bổ sung dung dịch hãm phải theo đúng trình tự như đối với thuốc thử
màu. Lắc nhẹ khay trong 10 giây để ngừng sự hiện màu và phân bố đều dung dịch
hãm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.6.9.2.8. Đọc độ hấp thụ
Dùng máy đọc vi đĩa, có gắn bộ lọc phù hợp để
đọc ở bước sóng 450 nm, đo độ hấp thụ trong từng giếng. Việc đọc phải thực hiện
trong 30 phút sau khi bổ sung dung dịch hãm.
Ghi lại kết quả thu được và tính giá trị hấp
thụ trung bình hoặc dùng chương trình máy tính.
A.7. Sơ đồ
Bảng A.2 – Qui trình
tách chiết
Quy trình
Mô tả
Cân 0,5 g
Cân mẫu phân tích, mẫu trắng, mẫu chuẩn đối
chứng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm dung dịch đệm tách chiết (A.4.2.1)
Trộn
Trộn phần mẫu thử với dung dịch đệm chiết
cho đến đồng nhất, đối với bột chưa tách chất béo thì thời gian trên sẽ nhỏ
hơn 5 phút, còn đối với bột tách chất béo, mẫu protein thì nhiều hơn 15 phút.
Ly tâm ở 5 000 x g
Ly tâm mẫu ở 5 000 x g trong 15
phút, ở 4 oC. Loại bỏ phần nổi phía trên và cho vào một ống sạch.
Độ pha loãng: 1:300 hoặc 1:10 tùy theo loại
nguyên liệu được nghiên cứu
Pha loãng dung dịch mẫu thử tạo thành, phân
tích trắng và các chuẩn đối chứng.
Bảng A.3 – Qui trình
ELISA
Quy trình
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mô tả
Bổ sung
100 ml
Dùng pipet lấy các dung dịch pha loãng,
dung dịch mẫu thử, mẫu trắng và chuẩn đối chứng cho vào các giếng phân tích
thích hợp và trộn.
Ủ
Ủ trong 1 giờ ở 37 oC
Rửa
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bổ sung
100 ml
Phân phối chất kháng thể cộng hợp (A.4.2.4)
vào từng giếng phân tích và trộn.
Ủ
Ủ trong 1 giờ ở 37 oC
Rửa
Rửa 3 lần bằng dung dịch đệm rửa (A.6.7)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
100 ml
Phân phối cơ chất màu (A.4.2.6) vào từng
giếng và trộn.
Ủ
Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bổ sung
100 ml
Phân phối dung dịch hãm (A.4.2.7) vào từng
giếng và trộn.
Đo độ hấp thụ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đo độ hấp thụ của từng giếng phân tích
trong máy đọc đĩa ở 450 nm.
A.8. Đánh giá
Số liệu phải được ghi lại.
Dùng các giá trị chuẩn để xây dựng đường
chuẩn. Các giá trị từ phân tích trắng phải được trừ khỏi tất cả các giá trị của
các dung dịch mẫu thử pha loãng và chuẩn đối chứng. Trung bình của các giá trị
đã chỉnh từ mỗi điểm chuẩn được thực hiện hai lần song song phải được dùng để
xây dựng đường chuẩn. Giá trị trung bình thu được từ mỗi dung dịch mẫu thử được
thực hiện hai lần song song được dùng để suy ra nồng độ từ đường đó.
A.9. Tiêu chí chấp nhận/loại bỏ
Mỗi vận hành phải đáp ứng được các tiêu chí
chấp nhận/loại bỏ trong quy trình để có giá trị như liệt kê trong Bảng A.4. Một
vận hành gồm: phân tích trắng, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm và mẫu
chưa biết. Tất cả các dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn và phân tích trắng
phải được chạy hai lần song song. Nếu vận hành không đạt các tiêu chí chấp nhận
thì phải lặp lại toàn bộ qui trình. Các dung dịch mẫu thử không đạt được các
tiêu chí chấp nhận trong bất kỳ lần vận hành nào thì phải tiến hành lần hai.
Bảng A.4 – Tiêu chí
chấp nhận hoặc loại bỏ kết quả
Phân tích trắng dung dịch đệm
A 450 nm < 0,30
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A 450 nm < 0,30
2,5 % chuẩn đối chứng
A 450 nm ³ 0,8
Tất cả các chuẩn đối chứng dương, OD
CV (OD) của các bản sao £ 15 %
Dung dịch mẫu không biết
CV (OD) của các bản sao £ 20 %
A.10. Tình trạng
Phương pháp này đã được thử nghiệm trong một
nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên mẫu chuẩn CRM 410 theo TCVN 6910 (ISO
5725) do Trung tâm Nghiên cứu Phối hợp của Ủy ban châu Âu tại Ispra, Italia
thực hiện, xem [3].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Không rây,
- Không nói rõ sử dụng của các thuốc thử,
- Không nói rõ việc chuẩn bị mẫu,
- Phương pháp chỉ áp dụng trên mẫu chuẩn chứa
0,1 %, 0,5 % và 2 % CRM 410,
- Các chuẩn đối chứng không được phân tích
hai lần song song,
- Lượng mẫu không đủ để lặp lại phân tích và
để áp dụng các tiêu chí chấp nhận/loại bỏ.
Các kết quả thử liên phòng thử nghiệm được
liệt kê trong Bảng A.5
Bảng A.5 – Dữ liệu về
độ chụm
Phầm trăm mẫu sinh
vật biến đổi gen trong bột đậu tương
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1 %
2 %
Năm thử liên phòng thử nghiệm
1999
1999
1999
Số lượng phòng thử nghiệm
37
37
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ
ngoại lệ
37
33
35
Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)
0
4
2
Số kết quả được chấp nhận
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
33
35
Giá trị trung bình ,
% sinh vật biến đổi gen
0,440
0,952
1,902
% của giá trị thực
88,1
95,2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Độ lệch chuẩn lặp lại sra
0,062
0,092
0,146
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr
% b
12,4
9,2
7,3
Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 .
sr]a
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,260
0,414
Độ lệch chuẩn tái lập sRa
0,083
0,123
0,186
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR,
%b
16,6
12,3
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giới hạn tái lập [R = 2,8 . sR]a
0,238
0,349
0,527
a sr, sR,
r, và R được biểu thị bằng đơn vị % sinh vật biến đổi gen.
b RSDr và RSDR
được biểu thị như phần trăm của giá trị thực.
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
ISO 5725 (all Parts), Accuracy (trueness and
precision) of measurement methods and results.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1] Codex Committee on Methods of Analysis
and Sampling: In House method validation. In House validated methods and their
role in methods of analysis for codex purposes. Codex Alimentarius Commission.
(CX/MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998
[2] Horwitz W.: Protocol for the design,
conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Applied
Chemistry, 1995, 67: 331-343.
[3] Lipp, M., Anklam, E., and Stave, J.,
2000. Validation of an Immunoassay for Detection and Quantitation of a Genetically
Modified Soybean in Food and Food Fractions Using Reference Materials:
Interlaboratory Study. Journal of AOAC International. Vol 83, No.4, pp.919-927.
[4] GMO Food Ingredient Testing, Soya kit
User’s Guide, (1999) Strategic Diagnostics Inc., Rev. 052099, Vers.1.8.