|
BỘ Y TẾ
-------
|
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ
NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------
|
|
Số: 2643/QĐ-BYT
|
Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2025
|
VỀ
VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ VI SINH -
TẬP 2”
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ Luật Khám
bệnh, chữa bệnh năm 2023;
Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27/02/2025 của Chính phủ quy
định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;
Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT
ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật
trong khám bệnh, chữa bệnh;
Căn cứ Biên bản họp ngày 16 tháng 05 năm 2025
của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu quy trình kỹ thuật về vi sinh và công văn số
4196/BM-KHTH ngày 03/07/2025 của Bệnh viện Bạch Mai gửi Cục QLKCB dự thảo quy
trình kỹ thuật về Vi sinh đã được Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu duyệt dự thảo;
Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám,
chữa bệnh,
QUYẾT ĐỊNH:
Điều 2. Tài
liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Vi sinh - Tập 2” được áp dụng
tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng 07 năm 2026.
Điều 3. Các
ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ, Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh, Cục
trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc
Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng
Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết
định này./.
|
Nơi nhận:
- Như Điều 3;
- Bộ trưởng (để báo cáo);
- Các Thứ trưởng;
- BHXHVN - Bộ Tài chính;
- Cổng thông tin điện tử Bộ Y tế;
- Website Cục QLKCB;
- Lưu: VT, KCB.
|
KT. BỘ
TRƯỞNG
THỨ TRƯỞNG
Trần Văn Thuấn
|
HƯỚNG
DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
VỀ
VI SINH - TẬP 2
(Ban hành kèm theo Quyết
định số 2643/QĐ-BYT ngày 20 tháng 8 năm 2025 của Bộ trưởng
Bộ Y tế)
Chỉ đạo biên soạn, thẩm định
GS.TS. Trần Văn Thuấn
|
Thứ trưởng Bộ Y tế
|
TS. Hà Anh Đức
|
Cục trưởng Cục QLKCB - Bộ
Y tế
|
Chủ biên
|
|
PGS. TS. Đào Xuân Cơ
|
Giám đốc Bệnh viện Bạch
Mai
|
TS. Vương Ánh Dương
|
Phó Cục trưởng Cục QLKCB
|
PGS.TS. Nguyễn Tuấn Tùng
|
Phó Giám đốc Bệnh viện
Bạch Mai
|
TS. Trương Thái Phương
|
Trưởng khoa Vi sinh - Bệnh
viện Bạch Mai
|
BSCKII. Lê Thị Ngân
|
Phó Trưởng khoa Vi sinh -
Bệnh viện Bạch Mai
|
PGS.TS. Đoàn Mai Phương
|
Nguyên Trưởng khoa Vi sinh
- Bệnh viện Bạch Mai
|
Tham gia biên soạn, thẩm định
|
|
PGS.TS. Phạm Hồng Nhung
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Nguyễn Ngọc Điệp
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Phạm Thị Thảo Hương
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
TS. Nguyễn Thị Tuyết Mai
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
BSCKII. Nguyễn Sâm
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
CN. Trần Minh Tuấn
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
TS. Nguyễn Văn An
|
Bệnh viện Quân Y 103
|
ThS. Lê Hoài Cường
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
ThS. Lê Trung Dũng
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Nguyễn Mỹ Hạnh
|
Bệnh viện Bệnh nhiệt đới
Trung ương
|
TS. Phạm Quỳnh Hoa
|
Bệnh viện Da liễu Trung
ương
|
TS. Lê Nguyễn Minh Hoa
|
Bệnh viện Bệnh nhiệt đới
Trung ương
|
BSCKII. Nguyễn Thị Lan Hương
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Vũ Thị Huyền
|
Bệnh viện Nhi Trung ương
|
TS. Nguyễn Trọng Khoa
|
Phó Cục trưởng Cục QLKCB
|
ThS. Nguyễn Tuấn Linh
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Lê Phương Mai
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
ThS. Đỗ Thị Lê Na
|
Bệnh viện Bệnh nhiệt đới
Trung ương
|
TS. Hoàng Thị Bích Ngọc
|
Bệnh viện Nhi Trung ương
|
ThS. Trương Lê Vân Ngọc
|
Cục QLKCB - Bộ Y tế
|
TS. Trương Thiên Phú
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
CKI.XN. Nguyễn Thị Nam
Phương
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
TS. Bùi Tiến Sỹ
|
Bệnh viện Trung ương Quân
đội 108
|
CKI.XN. Nguyễn Văn Thành
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
ThS. Trịnh Hồ Tình
|
Bệnh viện đa khoa tỉnh
Bình Định
|
BSCKII. Lê Quốc Thịnh
|
Bệnh viện Nhi đồng 1
|
PGS.TS. Lê Viết Quỳnh Trâm
|
Bệnh viện Đại học Y Dược
Huế
|
TS. Lê Khánh Trâm
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
TS. Văn Đình Tráng
|
Bệnh viện Bệnh nhiệt đới
Trung ương
|
ThS. Nguyễn Thị Kiều Trinh
|
Bệnh viện Bệnh nhiệt đới
Trung ương
|
TS. Huỳnh Minh Tuấn
|
Bệnh viện Đại học Y Dược
thành phố Hồ Chí Minh
|
TS. Mai Văn Tuấn
|
Bệnh viện Đa khoa Trung
ương Huế
|
CKI.XN. Phan Thanh Tùng
|
Bệnh viện Chợ Rẫy
|
PGS.TS. Vũ Thị Tường Vân
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
Thư ký
|
|
BSCKII. Lê Thị Ngân
|
Phó Trưởng khoa Vi sinh -
Bệnh viện Bạch Mai
|
PGS.TS. Phạm Hồng Nhung
|
Phó Trưởng khoa Vi sinh -
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Trương Lê Vân Ngọc
|
Cục QLKCB
|
ThS. Nguyễn Ngọc Điệp
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
CN. Trần Minh Tuấn
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
ThS. Bùi Thị Giang
|
Bệnh viện Bạch Mai
|
CN. Đỗ Thị Thư
|
Cục QLKCB
|
BS. Vũ Thanh Tùng
|
Bệnh viện E
|
LỜI NÓI ĐẦU
Bộ Y tế đã ban hành Tài
liệu “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh y học” vào các năm 2013
và 2018. Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật này làm căn cứ để các cơ sở khám bệnh,
chữa bệnh, người hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, và nhân viên y tế triển khai
áp dụng và thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh y học.
Nhằm mục đích cập nhật,
bổ sung tiến bộ khoa học kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh và tiếp tục chuẩn
hóa quy trình thực hiện kỹ thuật trong xét nghiệm Vi sinh, Bộ Y tế đã giao một
số bệnh viện làm đầu mối xây dựng và cập nhật Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về
Vi sinh, bao gồm Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Bệnh
nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Da liễu Trung ương, Bệnh viện Trung ương Quân
đội 108, Bệnh viện Quân Y 103, Bệnh viện Đại học Y dược Huế, Bệnh viện đa khoa
tỉnh Bình Định, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí
Minh và Bệnh viện Nhi đồng 1… Trong đó Bệnh viện Bạch Mai được giao làm đầu mối
tổng hợp chung. Các bệnh viện được giao nhiệm vụ đã huy động và phân công các
phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ… về vi sinh để biên soạn Hướng dẫn quy trình kỹ
thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để góp ý, hoàn thiện dự
thảo; thực hiện biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm
thu do Bộ Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định
trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được các thành
viên biên soạn rà soát hướng dẫn hiện có, tham khảo các tài liệu trong nước,
nước ngoài để cập nhật.
Bộ Y tế đã thành lập
Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Vi sinh với sự
tham gia của đại diện một số vụ, cục chức năng của Bộ Y tế, các chuyên gia hàng
đầu về vi sinh. Các thành viên chuyên môn đã làm việc với tinh thần trách
nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng
dẫn quy trình kỹ thuật. “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Vi sinh - Tập 2” được
xây dựng cho các kỹ thuật có trong Phụ lục số 02 và không có trong Phụ lục số
01 (của Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18
tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám
bệnh, chữa bệnh), đã được Hội đồng chuyên môn nghiệm thu và được Bộ Y tế ban
hành với tổng số 29 quy trình kỹ thuật và được áp dụng tại các cơ sở khám
bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng 7 năm 2026.
Bộ Y tế xin trân trọng
cảm ơn sự đóng góp tích cực và hiệu quả của các chuyên gia về Vi sinh, đặc biệt
là tập thể lãnh đạo và nhóm thư ký biên soạn và nghiệm thu của Khoa Vi sinh -
Bệnh viện Bạch Mai.
Trong quá trình biên
tập khó tránh được những sai sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý
kiến từ quý độc giả đồng nghiệp để Tài liệu chuyên môn ngày một hoàn thiện hơn.
Mọi ý kiến góp ý xin gửi về Cục Quản lý Khám, chữa bệnh - Bộ Y tế, 138A Giảng
Võ, phường Giảng Võ, Hà Nội.
Xin trân trọng cảm ơn!
|
|
GS.TS. Trần Văn Thuấn
Thứ trưởng Bộ Y tế
|
NGUYÊN
TẮC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
1. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được xây dựng
và ban hành theo từng chương, chuyên ngành; bao gồm các quy định về chỉ định,
chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị thực hiện kỹ thuật, đến các bước thực hiện
theo trình tự từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện kỹ thuật.
2. Tài liệu chuyên môn Hướng dẫn quy trình kỹ
thuật về Vi sinh - Tập 2 được xây dựng và ban hành cho các kỹ thuật có trong
Phụ lục số 02 và không có trong Phụ lục số 01 Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của
Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh. Tài
liệu chuyên môn này được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01
tháng 7 năm 2026.
3. Quy định về thời gian thực hiện kỹ thuật,
nhân lực (chức danh chuyên môn nghề nghiệp, số lượng nhân lực), thuốc, thiết bị
y tế… trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ Y tế ban hành dựa trên tính phổ
biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Trong thực tế triển
khai, căn cứ diễn biến lâm sàng, tình trạng người bệnh, điều kiện thực tế của
cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, việc triển khai kỹ thuật có thể cần huy động thêm
nhân lực chuyên môn, bổ sung thuốc, thiết bị y tế..., tăng thời gian thực hiện
kỹ thuật…
4. Chỉ sử dụng các thuốc, thiết bị y tế… được
cấp phép lưu hành theo quy định hiện hành.
5. Trong quá trình triển khai áp dụng Hướng dẫn
quy trình kỹ thuật, nếu thấy các bất cập hoặc nhu cầu cần sửa đổi, bổ sung, các
cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ
thuật, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục QLKCB) về việc cập nhật để ban
hành áp dụng trong cả nước.
MỤC
LỤC
LỜI NÓI ĐẦU
NGUYÊN TẮC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
PHỤ LỤC DANH MỤC KỸ
THUẬT DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1. Vi khuẩn kị khí kháng thuốc định
lượng MIC
2. Vi khuẩn vi hiếu khí kháng thuốc định
lượng MIC
3. Vi khuẩn vi hiếu khí kháng thuốc định
tính
4. Vi khuẩn/vi nấm kháng thuốc định
lượng vi pha loãng (MIC - nhiều loại kháng sinh)
5. Vi khuẩn kháng thuốc định lượng -
Colistin vi pha loãng (MIC)
6. Vi nấm định danh giải trình tự gen
7. Vi nấm kháng thuốc giải trình tự gen
8. Vi sinh vật nhiễm khuẩn sinh dục -
tiết niệu Real-time PCR đa tác nhân (cho trên 3 tác nhân, tùy thuộc vào số
lượng tác nhân cần xác định)
9. Xác định gen vi khuẩn kháng kháng
sinh Real-time PCR đa mồi
10. NTM (Nontuberculous mycobacteria)
định danh Real-time PCR hệ thống tự động
11. Xét nghiệm phát hiện trứng giun sán
bằng phương pháp lắng cặn phân
12. Helicobacter pylori kháng
thuốc định lượng
13. Mycoplasma
pneumoniae Ab ngưng kết hạt
14. EHEC miễn dịch tự động
15. HBeAg định lượng
16. HIV Ab ngưng kết hạt
17. Xét nghiệm phân bằng phương pháp
Katokatz
18. Xét nghiệm phát hiện trứng giun sán
trong phân bằng phương pháp Kato
19. Xác định M2BPGi miễn dịch tự động
20. Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp đa
tác nhân (cho ≥ 3 tác nhân, tùy thuộc vào số lượng tác nhân cần xác định cho
từng loại bệnh phẩm) test nhanh
21. Virus/ vi khuẩn nhiễm khuẩn hô hấp
khuếch đại nucleic acid (NAAT) đẳng nhiệt
22. Ký sinh trùng, tế bào soi phân tự
động
23. VDRL định tính, định lượng.
24. Vi sinh vật nhiễm khuẩn huyết digital PCR
đa tác nhân (cho trên 3 tác nhân, tùy thuộc vào số lượng tác nhân cần xác định)
25. Vi khuẩn miễn dịch huỳnh quang
26. Virus miễn dịch huỳnh quang
27. Vi nấm miễn dịch huỳnh quang
28. Dengue-Chikungunia-Zika virus Real-time PCR
29. Beta - D glucan định lượng
PHỤ LỤC
DANH MỤC KỸ THUẬT
|
STT trong QTKT
|
STT kỹ thuật trong Chương
|
Mã liên kết
|
Tên kỹ thuật được quy
định tại Phụ lục 2 Thông tư số 23/2023/TT-BYT
|
|
(Cột 1)
|
(Cột 2)
|
(Cột 3)
|
(Cột 4)
|
|
1
|
53
|
|
Vi khuẩn kỵ khí kháng thuốc định lượng (MIC)
|
|
2
|
54
|
|
Vi khuẩn vi hiếu khí kháng thuốc định lượng
(MIC)
|
|
3
|
55
|
|
Vi khuẩn vi hiếu khí kháng thuốc định tính
|
|
4
|
56
|
|
Vi khuẩn/vi nấm kháng thuốc định lượng vi pha
loãng (MIC - nhiều loại kháng sinh)
|
|
5
|
57
|
|
Vi khuẩn kháng thuốc định lượng - Colistin vi
pha loãng (MIC)
|
|
6
|
87
|
|
Vi nấm định danh giải trình tự gene
|
|
7
|
88
|
|
Vi nấm kháng thuốc giải trình tự gene
|
|
8
|
99
|
|
Vi sinh vật nhiễm khuẩn sinh dục - tiết niệu
Real-time PCR đa tác nhân (cho trên 3 tác nhân, tùy thuộc vào số lượng tác
nhân cần xác định)
|
|
9
|
100
|
|
Xác định gen vi khuẩn kháng kháng sinh
Real-time PCR đa mồi
|
|
10
|
126
|
|
NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh
Real-time PCR hệ thống tự động
|
|
11
|
136
|
|
Xét nghiệm phát hiện trứng giun sán bằng
phương pháp lắng cặn phân
|
|
12
|
198
|
|
Helicobacter pylori kháng thuốc định lượng
|
|
13
|
215
|
|
Mycoplasma pneumoniae Ab ngưng kết hạt
|
|
14
|
249
|
|
EHEC miễn dịch tự động
|
|
15
|
304
|
|
HBeAg định lượng
|
|
16
|
341
|
|
HIV Ab ngưng kết hạt
|
|
17
|
439
|
|
Xét nghiệm phân bằng phương pháp Katokatz
|
|
18
|
440
|
|
Xét nghiệm phát hiện trứng giun sán trong
phân bằng phương pháp Kato
|
|
19
|
506
|
|
Xác định M2BPGi miễn dịch tự động
|
|
20
|
512
|
|
Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp đa tác nhân
(cho ≥ 3 tác nhân, tùy thuộc vào số lượng tác nhân cần xác định cho từng loại
bệnh phẩm) test nhanh
|
|
21
|
522
|
|
Virus/vi khuẩn nhiễm khuẩn hô hấp khuếch đại
nucleic acid (NAAT) đẳng nhiệt
|
|
22
|
527
|
|
Ký sinh trùng, tế bào soi phân tự động
|
|
23
|
528
|
|
VDRL định tính và định lượng
|
|
24
|
530
|
|
Vi sinh vật nhiễm khuẩn huyết digital PCR đa
tác nhân (cho trên 3 tác nhân, tùy thuộc vào số lượng tác nhân cần xác định)
|
|
25
|
532
|
|
Vi khuẩn miễn dịch huỳnh quang
|
|
26
|
533
|
|
Virus miễn dịch huỳnh quang
|
|
27
|
534
|
|
Vi nấm miễn dịch huỳnh quang
|
|
28
|
536
|
|
Dengue-Chikungunia-Zika virus Real-time PCR
|
|
29
|
543
|
|
Beta - D - glucan định lượng
|
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT
TẮT
|
Chữ
viết tắt
|
Tiếng
Anh
|
Tiếng
Việt
|
|
ATSH
|
|
An toàn sinh học
|
|
Ab
|
Antibody
|
Kháng thể
|
|
Ag
|
Antigen
|
Kháng nguyên
|
|
BCĐN
|
|
Bạch cầu đa nhân
|
|
BTS
|
Baterial test standard
|
|
|
CDAB
|
Clostridium difficile toxin A và toxin B
|
|
|
CMIA
|
Chemiluminescent Microparticle ImmunoAssay
|
thử nghiệm miễn dịch điện hóa phát quang
|
|
CLIA
|
Chemiluminescence immunoassay
|
Thử nghiệm miễn dịch hóa phát quang
|
|
CLSI
|
Clinical and laboratory standards institute
|
Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm
|
|
CO
|
Cut off
|
Ngưỡng
|
|
Ct
|
Cycle threshold
|
Chu kỳ ngưỡng
|
|
DNA
|
Deoxyribonucleic acid
|
|
|
ECLIA
|
Electrochemiluminescent ImmunoAssay
|
Thử nghiệm miễn dịch điện hóa phát quang
|
|
ELFA
|
Enzyme immunoassay sandwich method with a
final fluorescent detection
|
Xét nghiệm huỳnh quang liên kết gắn enzyme
|
|
ELISA
|
Enzyme-linked immunosorbant assay
|
Miễn dịch hấp phụ gắn enzym
|
|
EQA
|
External Quality Assessment
|
Ngoại kiểm
|
|
EQC
|
External Quality Control
|
Kiểm soát chất lượng bằng vật liệu bên ngoài
|
|
EUCAST
|
The European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing
|
Ủy ban Châu Âu về thử nghiệm nhạy cảm kháng
sinh
|
|
GDH
|
Glutamate dehydrogenase
|
Kháng nguyên GDH
|
|
HBV
|
Hepatitis B virus
|
Virus viêm gan B
|
|
HCV
|
Hepatitis C virus
|
Virus viêm gan C
|
|
HCCA
|
α-Cyano-4 hydroxycinnamic acid
|
|
|
HIV
|
Human Immunodeficiency Virus - Virus
|
Virus gây suy giảm miễn dịch ở người
|
|
HPC
|
High positive control
|
Chứng dương cao
|
|
HT
|
|
Huyết thanh
|
|
I
|
Intermediate
|
Trung gian
|
|
IQC
|
Internal Quality Control
|
Kiểm soát chất lượng nội bộ
|
|
IU
|
International unit
|
Đơn vị Quốc tế
|
|
KKT
|
|
Kháng kháng thể
|
|
KN-KT
|
|
Kháng nguyên - Kháng thể
|
|
KSĐ
|
|
Kháng sinh đồ
|
|
KST
|
|
Ký sinh trùng
|
|
LPC
|
Low positive control
|
Chứng dương thấp
|
|
MALDI-Tof
|
Matrix-assisted laser desorption/ionization -
time of flight
|
|
|
MEC
|
Minimal effective concentration
|
Nồng độ hiệu quả tối thiểu
|
|
MIC
|
Minimal inhibitory concentration
|
Nồng độ ức chế tối thiểu
|
|
MSDS
|
Material Safety Data Sheet
|
Bảng dữ liệu an toàn hóa chất
|
|
NC
|
Negative control
|
Chứng âm
|
|
non-WT
|
non wild type
|
Biến chủng
|
|
OD
|
Optical density
|
Mật độ quang
|
|
PC
|
Positive control
|
Chứng dương
|
|
PCR
|
Polymerase chain reaction
|
Phản ứng khuếch đại chuỗi
|
|
QC
|
Quality control
|
Kiểm soát chất lượng
|
|
R
|
Resistant
|
Đề kháng
|
|
RFV
|
Relative Fluorescence Value
|
Giá trị huỳnh quang tương đối
|
|
RNA
|
Ribonucleic acid
|
|
|
RT - PCR
|
Reverse transcription polymerase chain
reaction
|
Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược
|
|
S
|
Susceptible
|
Nhạy cảm
|
|
VD
|
|
Ví dụ
|
|
VK
|
|
Vi khuẩn
|
|
VSV
|
|
Vi sinh vật
|
|
WT
|
Wild type
|
Chủng hoang dại
|
1.
Vi khuẩn kị khí kháng thuốc định lượng MIC (cho 1 loại kháng sinh)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm và nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với chủng vi khuẩn gây bệnh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dải giấy kháng sinh có
kích thước 5 x 57 mm được thấm kháng sinh theo bậc nồng độ (μg/mL). Có 15 nồng
độ kháng sinh được pha loãng bậc 2 gắn cố định ở một mặt của dải giấy. Khi dải
giấy kháng sinh được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn, kháng sinh nhanh chóng
khuếch tán trong thạch. Sau khi nuôi cấy qua đêm, sẽ xuất hiện vùng ức chế hình
elip đối xứng qua dải giấy. Giá trị MIC được xác định tại điểm cắt của hình
elip với dải giấy kháng sinh. Giá trị MIC sẽ được phiên giải ra phân loại S (susceptibility
- nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), hoặc R (resistant -
đề kháng) theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật hàng năm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm.
- Kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Dải giấy kháng sinh.
- Canh thang phù hợp
cho vi khuẩn kị khí.
- Thạch nuôi cấy vi
khuẩn kị khí.
- Thạch kháng sinh đồ
cho vi khuẩn kị khí.
- Túi tạo khí trường kị
khí.
- Ống canh thang BHI
15% glycerol.
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh.
- Cồn 70%.
- Dung dịch nước rửa
tay.
- Dung dịch khử trùng.
- Đầu côn 1000 µL tiệt
trùng.
- Đầu côn 200 µL tiệt
trùng.
- Bút viết không xóa.
- Que cấy.
- Ống nghiệm thủy tinh.
- Tăm bông vô trùng.
- Khay đựng bệnh phẩm.
- Hộp nuôi cấy kị khí.
- Panh.
- Bộ độ đục chuẩn
McFarland.
- Micropipette.
- Chủng vi khuẩn chuẩn.
- Giấy thấm.
- Mũ giấy.
- Khẩu trang.
- Găng khám.
- Găng tay xử lý dụng
cụ.
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý.
- Áo choàng phòng xét
nghiệm.
- Khăn lau tay.
- Túi rác các loại.
- Tủ ấm.
- Tủ an toàn sinh học
cấp 2.
- Lò hấp tiệt trùng.
- Tủ sấy.
- Máy đo pH.
- Máy đo độ đục.
- Máy vortex.
- Hệ thống quản lý
phòng xét nghiệm.
- Bộ lưu điện.
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC.
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC.
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl.
- Bàn xét nghiệm.
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn cần
thử nghiệm đã được nuôi cấy thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai
đoạn phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 48 giờ (2
ngày).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Pha huyền dịch vi khuẩn
Dùng que cấy lấy vi
khuẩn 5 (có thể nhiều hơn 5) khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào
ống canh thang Brucella (hoặc canh thang khác), lắc đều trên máy lắc để có
huyền dịch đồng nhất và có độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5. (Không
để đĩa cấy vi khuẩn ra ngoài môi trường quá 30 phút cho đến lúc lấy khuẩn lạc).
- Dàn đều canh khuẩn lên mặt đĩa thạch
Dùng tăm bông vô trùng
nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông
trên thành bên của ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn
đã thấm vào đầu tăm bông. Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa
thạch Fastidious anaerobe agar sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ
bề mặt đĩa thạch.
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt
thạch
Đặt dải giấy kháng sinh
lên mặt thạch sao cho mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo
toàn bộ bề mặt của dải giấy kháng sinh được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch.
Khi đã đặt xong dải giấy kháng sinh không được dịch chuyển dải giấy kháng sinh khỏi
vị trí.
- Ủ ấm
Đĩa thạch trong hộp kín
có chứa túi tạo môi trường kị khí rồi đặt hộp vào tủ ấm 35- 37ºC trong 24 - 48
giờ.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC): Chỉ trả kết quả khi QC đạt yêu cầu.
4.2.2 Đọc kết quả:
- Sau ủ ấm 24 - 48h và
khi thấy rõ vi khuẩn mọc, đọc giá trị MIC ở điểm cắt của hình elip với dải giấy
kháng sinh. Làm tròn giá trị MIC ở điểm giữa hai bậc pha loãng lên giá trị cao
hơn một bậc trước khi phiên giải kết quả.
- Phiên giải kết quả MIC
ra giá trị S, I hoặc R theo tài liệu hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật
hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Vi khuẩn mọc quá dày
hoặc quá thưa.
- Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện
tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Kết quả QC hàng tuần,
mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới, mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa
chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST phiên bản cập nhật
hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù hàng năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm và nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với chủng vi khuẩn gây bệnh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dải giấy kháng sinh có
kích thước 5 x 57 mm được thấm kháng sinh theo bậc nồng độ (μg/mL). Có 15 nồng
độ kháng sinh được pha loãng bậc 2 gắn cố định ở một mặt của dải giấy. Khi dải
giấy kháng sinh được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn, kháng sinh nhanh chóng
khuếch tán trong thạch. Sau khi nuôi cấy qua đêm, sẽ xuất hiện vùng ức chế hình
elip đối xứng qua dải giấy. Giá trị MIC được xác định tại điểm cắt của hình
elip với dải giấy kháng sinh. Giá trị MIC sẽ được phiên giải ra phân loại S (susceptibility
- nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), hoặc R (resistant -
đề kháng) theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật hàng năm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm
- Kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Dải giấy kháng sinh
- Canh thang Brucella
- Thạch máu có chất dinh
dưỡng bổ sung
- Thạch Muller-Hinton F
(MHF)
- Túi tạo khí trường vi
hiếu khí
- Túi tạo khí trường kị
khí (nếu thử nghiệm metronidazol)
- Ống canh thang BHI 15%
glycerol
- Dung dịch sát khuẩn tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 1000 µL tiệt trùng
- Đầu côn 200 µL tiệt trùng
- Bút viết không xóa
- Que cấy
- Ống nghiệm thủy tinh
- Tăm bông vô trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp nuôi cấy kị khí
- Panh
- Bộ độ đục chuẩn McFarland
- Micropipette
- Chủng vi khuẩn chuẩn
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ lý
- Áo choàng phòng xét nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Tủ ấm
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Lò hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Máy đo pH
- Máy đo độ đục
- Máy vortex
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn cần thử
nghiệm đã được nuôi cấy thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai đoạn
phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 72 giờ (3
ngày).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Pha huyền dịch vi khuẩn
Dùng que cấy lấy vi khuẩn
5 (có thể nhiều hơn 5) khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống
canh thang Brucella (hoặc canh thang khác), lắc đều trên máy lắc để có huyền
dịch đồng nhất và có độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5 hay lớn hơn
tuỳ theo yêu cầu của từng loài vi khuẩn. (Không để đĩa cấy vi khuẩn ra ngoài
môi trường quá 30 phút cho đến lúc lấy khuẩn lạc).
- Dàn đều canh khuẩn lên mặt đĩa thạch
Dùng tăm bông vô trùng
nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông
trên thành bên của ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn
đã thấm vào đầu tăm bông. Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa
thạch MHF sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch.
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt
thạch
Đặt dải giấy kháng sinh
lên mặt thạch sao cho mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo
toàn bộ bề mặt của dải giấy kháng sinh được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch.
Khi đã đặt xong dải giấy kháng sinh không được dịch chuyển dải giấy kháng sinh
khỏi vị trí.
- Ủ ấm
Đĩa thạch trong hộp kín
có chứa túi tạo môi trường vi hiếu khí (hoặc môi trường kị khí nếu thử nghiệm
metronidazole 1 ngày sau đó chuyển sang môi trường vi hiếu khí) rồi đặt hộp vào
tủ ấm 35-37ºC trong 48 -72 giờ tuỳ từng loài vi khuẩn.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
- Chỉ đọc kết quả kháng
sinh đồ chủng bệnh nhân khi kết quả QC đạt.
4.2.2. Đọc kết quả:
- 48 - 72 giờ tuỳ từng
loài vi khuẩn và khi thấy rõ vi khuẩn mọc, đọc giá trị MIC ở điểm cắt của hình
elip với dải giấy kháng sinh. Làm tròn giá trị MIC ở điểm giữa hai bậc pha
loãng lên giá trị cao hơn một bậc trước khi phiên giải kết quả.
- Phiên giải kết quả MIC
ra giá trị S, I hoặc R theo tài liệu hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật
hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử..
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Vi khuẩn mọc quá dày
hoặc quá thưa.
- Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Kết quả QC hàng tuần,
mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới, mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa
chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST phiên bản cập nhật
hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù hàng năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm của kháng sinh với chủng vi khuẩn gây bệnh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Mức độ nhạy cảm với
kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được đánh giá dựa vào vùng ức chế
tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh. Khi đặt khoanh giấy kháng sinh
trên bề mặt thạch, kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch; càng xa khoanh
giấy, nồng độ kháng sinh càng giảm. Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi
kháng sinh đạt đến một nồng độ nhất định. Đường kính vùng ức chế tỷ lệ thuận
với mức độ nhạy cảm được phiên giải ra các phân loại S (susceptibility -
nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), hoặc R (resistant - đề
kháng) khi so sánh với bảng chuẩn CSLI cập nhật.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm
- Kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Khoanh giấy kháng
sinh
- Môi trường thử nghiệm
kháng sinh cho vi khuẩn vi hiếu khí
- Môi trường lưu giữ
chủng
- Nước muối sinh lý
- Túi tạo môi trường vi hiếu khí
- Thạch cấy chủng
- Cồn 70%
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Ống canh thang BHI 15% glycerol
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 1000 µL tiệt trùng
- Đầu côn 200 µL tiệt trùng
- Bút viết không xóa
- Que cấy
- Tăm bông vô trùng
- Ống nghiệm thủy tinh
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp nuôi cấy vi hiếu khí
- Panh
- Bộ độ đục chuẩn McFarland
- Micropipette
- Chủng vi khuẩn chuẩn
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Tủ ấm
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Lò hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Máy đo pH
- Máy đo độ đục
- Máy vortex
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn cần thử
nghiệm đã được nuôi cấy thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai đoạn
phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm, mã bệnh phẩm, loài vi khuẩn yêu cầu làm kháng sinh đồ.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 24 - 48 giờ.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Pha huyền dịch vi khuẩn
Dùng que cấy chấm vài
đầu khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống canh thang
Muller-Hinton (hoặc nước muối sinh lý), lắc đều trên máy lắc để có huyền dịch
đồng nhất và có độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5 hay lớn hơn tuỳ
theo yêu cầu của từng loài vi khuẩn. (Không để đĩa cấy vi khuẩn ra ngoài môi
trường quá 30 phút cho đến lúc lấy khuẩn lạc).
- Dàn đều canh khuẩn lên mặt đĩa thạch
Dùng tăm bông vô trùng
nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn đã pha ở trên, ép nhẹ và xoay tròn tăm bông
trên thành bên của ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn
đã thấm vào đầu tăm bông. Sau đó, ria đều que tăm bông trên toàn bộ mặt đĩa
thạch MHF sao cho vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch.
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch
Đặt khoanh giấy kháng
sinh lên mặt thạch và ấn xuống để phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của khoanh giấy
kháng sinh được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Khi đã đặt xong khoanh giấy
kháng sinh không được dịch khỏi vị trí đã đặt.
- Ủ ấm
Đĩa thạch trong hộp kín
có chứa túi tạo môi trường vi hiếu khí (hoặc môi trường kị khí nếu thử nghiệm
metronidazole 1 ngày sau đó chuyển sang môi trường vi hiếu khí) rồi đặt hộp vào
tủ ấm ở nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn thử nghiệm trong 24 - 48 giờ tuỳ từng loài
vi khuẩn.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
- Chỉ đọc kết quả kháng
sinh đồ chủng bệnh nhân khi kết quả QC đạt.
4.2.2. Đọc kết quả:
- Sau thời gian ủ ấm phù
hợp, khi thấy rõ vi khuẩn mọc, Đo đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính
của khoanh giấy kháng sinh) tính theo mm. Phiên giải đường kính vùng ức chế ra
kết quả S, I, R theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Vi khuẩn mọc quá dày
hoặc quá thưa.
- Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Kết quả QC hàng tuần,
mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới, mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa
chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST phiên bản cập nhật
hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù hàng năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and
Michael A. Pfaller. Manual of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC.
2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm và nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với chủng vi khuẩn/vi nấm gây
bệnh bằng kỹ thuật vi pha loãng.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kháng sinh đông khô có
nồng độ cố định, giảm dần theo bậc hai được chuẩn bị sẵn trong các giếng. Huyền
dịch chủng vi khuẩn/vi nấm trong canh thang sẽ được nuôi cấy trong các giếng này.
Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ kháng sinh thấp nhất có tác dụng ức chế
hoàn toàn vi khuẩn/vi nấm được đưa vào các giếng. Giá trị MIC/MEC sẽ được phiên
giải ra phân loại S (susceptibility - nhạy cảm), I (intermediate -
trung gian), hoặc R (resistant - đề kháng), WT (wild type) hoặc non-WT
(non wild type) theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST cập nhật hàng năm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm
- Kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Khay kháng sinh/kháng
nấm đông khô
- Nước pha canh khuẩn
- Canh thang kháng sinh
đồ/kháng nấm đồ
- Thạch dinh dưỡng
- Ống canh thang BHI 15%
glycerol
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 100 µL tiệt
trùng
- Đầu côn 200 µL tiệt
trùng
- Bút viết không xóa
- Que cấy
- Ống nghiệm thủy tinh
- Tăm bông vô trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Bộ độ đục chuẩn
McFarland
- Micropipette đa kênh
- Chủng chủng vi khuẩn
chuẩn
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Tủ ấm
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Lò hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Máy đo pH
- Máy đo độ đục
- Máy vortex
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn/vi nấm
được xác định là căn nguyên gây bệnh, thuần được nuôi cấy trong điều kiện tối
ưu và đang ở giai đoạn phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm, mã bệnh phẩm, loài vi khuẩn yêu cầu làm kháng sinh đồ.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 48 - 72 giờ (2
- 3 ngày) tùy theo loài vi khuẩn/vi nấm.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật
- Pha huyền dịch vi khuẩn
Dùng que cấy lấy khuẩn
lạc vi khuẩn nghiền đều vào ống nước pha canh khuẩn, lắc đều trên máy lắc để có
huyền dịch đồng nhất. Điều chỉnh để có độ đục tương ứng với McFarland 0,5.
- Phân bố canh khuẩn vào các giếng
Chuyển một lượng huyền
dịch sang ống canh thang để có nồng độ vi khuẩn/vi nấm cần đạt được theo yêu
cầu của nhà sản xuất. Dùng piptte đa kênh chuyển vào mỗi giếng của plate 100 µl
canh khuẩn đã pha. Dán toàn bộ bề mặt plate bằng tấm băng dính. Huyền dịch vi
khuẩn/vi nấm sau khi pha phải được sử dụng ngay trong vòng 15 phút.
- Ủ ấm
Ủ khay trong tủ ấm
trong khoảng thời gian theo hướng dẫn của nhà sản xuất và tùy loài vi khuẩn/vi
nấm.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
Chỉ đọc kết quả kháng
sinh đồ chủng bệnh nhân khi kết quả QC đạt.
4.2.2. Đọc kết quả
Kiểm tra giếng chứng vi
khuẩn phải có sự phát triển của vi khuẩn.
- Giá trị MIC/MEC được
xác định tại giếng có nồng độ kháng sinh nhỏ nhất mà ức chế được vi khuẩn trong
giếng.
- Phiên giải kết quả MIC
ra giá trị S, I hoặc R; WT hoặc non WT theo tài liệu của CLSI hoặc EUCAST cập
nhật hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Giếng chứng vi khuẩn
không mọc tốt
- Hiện tượng skip nhiều
giếng
Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Kết quả QC hàng tuần,
mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới, mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa
chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST phiên bản cập nhật
hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù hàng năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm và nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh colistin với chủng vi khuẩn Gram
âm gây bệnh bằng Kỹ thuật vi pha loãng.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kháng sinh colistin
đông khô có nồng độ cố định, giảm dần theo bậc hai được chuẩn bị sẵn trong các
giếng. Huyền dịch chủng vi khuẩn trong canh thang sẽ được nuôi cấy trong các
giếng này. Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ kháng sinh thấp nhất có tác dụng
ức chế hoàn toàn vi khuẩn được đưa vào các giếng. Giá trị MIC sẽ được phiên
giải ra phân loại S (susceptibility - nhạy cảm), I (intermediate -
trung gian), hoặc R (resistant - đề kháng) theo hướng dẫn của CLSI hoặc
EUCAST cập nhật hàng năm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm
- Kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Khay kháng sinh/kháng
nấm đông khô
- Nước pha canh khuẩn
- Canh thang MH
- Thạch dinh dưỡng
- Ống canh thang BHI 15%
glycerol
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 100 µL tiệt
trùng
- Đầu côn 200 µL tiệt
trùng
- Bút viết không xóa
- Que cấy
- Ống nghiệm thủy tinh
- Tăm bông vô trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Bộ độ đục chuẩn
McFarland
- Micropipette đa kênh
- Chủng chủng vi khuẩn
chuẩn
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Tủ ấm
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Lò hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Máy đo pH
- Máy đo độ đục
- Máy vortex
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn Gram âm
được xác định là căn nguyên gây bệnh, thuần được nuôi cấy trong điều kiện tối
ưu và đang ở giai đoạn phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường
bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm, mã bệnh phẩm, loài vi khuẩn yêu cầu làm kháng sinh đồ.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 24 giờ.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật
- Pha huyền dịch vi khuẩn
Dùng que cấy lấy khuẩn
lạc vi khuẩn nghiền đều vào ống nước pha canh khuẩn, lắc đều trên máy lắc để có
huyền dịch đồng nhất. Điều chỉnh để có độ đục tương ứng với McFarland 0,5.
- Phân bố canh khuẩn vào các giếng
Chuyển 50 uL huyền dịch
sang ống canh thang 11.5 mL để có nồng độ vi khuẩn cần đạt được theo yêu cầu
của nhà sản xuất. Dùng piptte đa kênh chuyển vào mỗi giếng của plate 100 µl
canh khuẩn đã pha. Dán toàn bộ bề mặt plate bằng tấm băng dính. Huyền dịch vi
khuẩn/ sau khi pha phải được sử dụng ngay trong vòng 15 phút.
- Ủ ấm
Ủ khay trong tủ ấm 18 -
24 giờ.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC)
Chỉ đọc kết quả kháng
sinh đồ chủng bệnh nhân khi kết quả QC đạt.
4.2.2. Đọc kết quả
Kiểm tra giếng chứng vi
khuẩn phải có sự phát triển của vi khuẩn.
- Giá trị MIC được xác
định tại giếng có nồng độ kháng sinh nhỏ nhất mà ức chế được vi khuẩn trong
giếng.
- Phiên giải kết quả MIC
ra giá trị S, I hoặc R theo tài liệu của CLSI hoặc EUCAST cập nhật hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Giếng chứng vi khuẩn
không mọc tốt
- Hiện tượng skip nhiều
giếng
Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Kết quả QC hàng tuần,
mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới, mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa
chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của CLSI hoặc EUCAST phiên bản cập nhật
hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù hàng năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định căn nguyên vi
nấm có mặt trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bằng kỹ thuật giải trình tự
nucleotide (sequencing).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Đoạn ADN đặc trưng của
vi nấm được nhân dòng bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Trình tự
nucleotide của đoạn ADN được xác định bằng kỹ thuật sequencing, sau đó so sánh
trình tự nucleotide này trong ngân hàng dữ liệu GeneBank để xác định chủng vi
nấm tương đồng.
Định nghĩa
- ADN (Axit
Deoxyribonucleic): Là vật chất di truyền cơ bản của hầu hết vi sinh vật, bao
gồm vi sinh vật gây bệnh
- PCR (Polymerase Chain
Reaction): Phản ứng enzyme chuỗi trùng hợp, dùng nhân bản ADN
- Sequencing: Là một kỹ
thuật trong phòng thí nghiệm, được sử dụng để xác định trình tự của các loại
bazơ (A, C, T và G) trong phân tử ADN
- An toàn sinh học
(ATSH): Là một thuật ngữ dùng để mô tả những nguyên tắc, kỹ thuật và thực hành
cần thiết giúp ngăn chặn và loại trừ nguy cơ phơi nhiễm đối với nhân viên phòng
xét nghiệm, cộng đồng và môi trường từ các tác nhân gây bệnh và độc tố.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Các hóa chất cần
thiết tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Các vật tư cần thiết
tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1
thanh)
- Nắp strip (bằng số
tuýp 0.1 ml)
- Tuýp 1.5 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.5
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý (4 bộ/ người/năm)
- Áo choàng phòng xét
nghiệm (1 cái/ người/năm)
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm spindown
- Máy Vortex
- Máy ủ nhiệt
- Máy tách chiết ADN
- Máy PCR
- Máy điện di sản phẩm
PCR
- Máy giải trình tự
nucleotide
- Tủ an toàn sinh học
cấp 2
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -80ºC
- Pipette các loại từ
2.5 µl - 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: chủng
vi nấm đã được nuôi cấy thuần
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm và đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Trên phiếu chỉ định xét
nghiệm phải bao gồm loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có)
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 5 ngày.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm sinh
học phân tử
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất và quy định của chuyên ngành vi sinh
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất
a. Tách chiết ADN
- Chứng âm NC (Negative
Control): dùng nước cất đã được khử trùng. Tiến hành tách chiết chứng âm đồng
thời với các bệnh phẩm khác.
- Chứng dương PC
(Positive Control): dùng mẫu vi nấm chuẩn hoặc mẫu vi nấm đã được định danh,
tiến hành tách chiết chứng dương đồng thời với các bệnh phẩm khác.
- Thực hiện tách chiết
bằng máy tự động hoặc bằng phương pháp thủ công
b. Thực hiện phản ứng PCR
- Chuẩn bị sinh phẩm
(Master mix) cho phản ứng PCR
- Số lượng ống PCR cần
cho một lần xét nghiệm theo công thức sau:
Số lượng ống = Số bệnh
phẩm + 3
Chú ý: Một lần thực hiện PCR
cần tiến hành đồng thời 3 loại chứng bao gồm: Chứng dương để đảm bảo quá trình
thực hiện PCR; Chứng âm để đảm bảo quá trình tách chiết ADN không bị nhiễm;
Chứng NTC (None Template Control) để đảm bảo Master mix của phản ứng PCR không
bị nhiễm.
- Tiến hành tan đá các
ống trong kit Taq PCR Master Mix và các ống primer, sau đó giữ ở nhiệt độ 4 ºC
trên khay đá.
- Lấy 1 ống eppendof 1.5
ml vô trùng, không chứa DNase và để trên khay đá, sau đó trộn các thành phần
Master mix theo công thức sau:
|
TT
|
Thành phần
|
Thể tích (µl)
|
|
1
|
PCR Master Mix
|
25.0
|
|
2
|
MgCl2
|
1.0
|
|
3
|
Mồi xuôi
|
1.0
|
|
4
|
Mồi ngược
|
1.0
|
|
5
|
H2O
|
17.0
|
|
6
|
ADN khuôn
|
5.0
|
|
7
|
Tổng thể tích
|
50
|
- Chia mỗi ống phản ứng
PCR 50 µl của hỗn hợp trên
Quy trình PCR
- Chuyển 5 µl sản phẩm
tách chiết DNA cùng các chứng dương và âm vào các ống PCR tương ứng.
- Ly tâm nhanh các ống
PCR có chứa Mix và sản phẩm DNA tách chiết.
- Chuyển các ống PCR vào
máy luân nhiệt và cài đặt theo chu trình nhiệt sau
|
TT
|
Nhiệt độ
|
Thời gian
|
Số chu kỳ
|
|
1
|
95 ºC
|
5 phút
|
1 chu kỳ
|
|
2
|
95 ºC
|
20 giây
|
35 chu kỳ
|
|
56 ºC
|
30 giây
|
|
72 ºC
|
1 phút
|
|
3
|
72 ºC
|
15 phút
|
1 chu kỳ
|
|
4
|
10 ºC
|
Bảo quản
|
c. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị Agarose 1,2%
- Đun nóng chảy agarose
bằng lò vi sóng (2-3 phút), để nguội đến 55-60 oC và đổ vào khuôn đã cài sẵn lược.
- Để gel đông sau khoảng
20 phút, đặt bản gel vào bể điện di đã bổ sung buffer TAE 1x và sau đo tiến
hành điện di.
- Thành phần 1 giếng điện
di như sau: 5 µl sản phẩm PCR + 1.5 µl Loading Dye. Trộn đều và tra lần lượt
mẫu vào các giếng trên bản gel
- Điện di với cường độ
dòng điện 100 V trong 30 phút
- Đọc và phân tích kết
quả điện di trên máy chup gel
d. Tinh sạch sản phẩm PCR
- Tinh sạch bằng phương
pháp cột lọc hoặc bằng phương pháp enzyme
e. Thực hiện phản ứng PCR sequencing
- Thành phần phản ứng PCR
sequencing:
|
STT
|
Thành phần
|
Thể tích (µl)
|
|
1
|
Master mix
|
2.0
|
|
2
|
Đệm (Buffer)
|
4.0
|
|
3
|
Mồi (Primer)
|
1.0
|
|
4
|
ADN khuôn
|
1.0
|
|
5
|
H2O
|
12.0
|
|
6
|
Tổng thể tích
|
20.0
|
- Chu trình nhiệt phản
ứng PCR sequencing:
|
TT
|
Nhiệt độ
|
Thời gian
|
Số chu kỳ
|
|
1
|
96 ºC
|
1 phút
|
1 chu kỳ
|
|
2
|
96 ºC
|
10 giây
|
25 chu kỳ
|
|
50 ºC
|
5 giây
|
|
60 ºC
|
4 phút
|
f. Tinh sạch sản phẩm PCR sequening
- Tinh sạch bằng phương
pháp hạt bead hoặc phương pháp cột lọc
g. Thực hiện đọc trình tự nucleotide
- Hút 20µL sản phẩm PCR
sequencing đã tinh sạch vào plate.
- Đặt plate vào vị trí
đọc trên máy giải trình tự.
- Thực hiện giải trình tự
nucleotide tren máy sequencing theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Lưu dữ liệu chứa trình
tự nucleotide của mẫu xét nghiệm vào máy tính. Chọn ổ đĩa cứng hoặc di động để
tránh làm mất hoặc hỏng dữ liệu.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
các chứng
- Chỉ phân tích kết quả
của mẫu xét nghiệm khi các chứng NC, NTC, PC đạt yêu cầu.
4.2.2. Đọc kết quả
- Trình tự của mẫu thu
nhận được từ máy sequencing được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng để loại bỏ các
sai số.
- Đưa trình tự nucleotide
lên ngân hàng dữ liệu gen (http://ncbi.nlm.gov/blast).
- Bấm Search để tiến hành
so sánh với các database có sẵn trong ngân hàng dữ liệu.
- Các trình tự có mức độ
tương đồng ≥ 99% thì được coi là chủng vi nấm tương đồng cao
Chú ý:
- Trong trường hợp trình
tự tương đồng < 99 %, thì kiểm tra tỷ lệ các chủng vi nấm, nếu chủng nào
chiếm tỷ lệ cao (>2/3) thì có thể kết luận mẫu tương đồng với chủng đó.
- Kết quả Blast Search có
tỷ lệ tương đồng thấp (< 90 %) và không có chủng nào chiếm tỷ lệ quá 2/3 thì
kết quả đó “Không có giá trị” và cần lặp lại xét nghiệm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét và đánh giá lại
toàn bộ các bước trước, trong và sau xét nghiệm để loại bỏ các yếu tố sai sót
trước khi trả kết quả xét nghiệm. Trong trường hợp phát hiện ra sai sót cần hủy
kết quả xét nghiệm.
- Trả kết quả xét nghiệm
theo quy định bằng bản cứng hoặc bản điện tử
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng và bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh: nếu mẫu bệnh
phẩm không đạt yêu cầu về chất lượng hoặc bảo quản, vận chuyển không đúng cách.
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Nếu không lấy lại được bệnh phẩm
thì phòng xét nghiệm sẽ vẫn thực hiện và ghi chú về khả năng sai lệch kết quả
do chất lượng của mẫu bệnh phẩm không được đảm bảo.
- Máy móc, sinh phẩm: máy
móc cần được bảo trì, bảo dưỡng định kỳ theo quy định. Sinh phẩm được nhập, bảo
quản theo đúng quy định và hướng dẫn của nhà sản xuất. Nếu phát hiện các sai sót
về bảo trì bảo dưỡng máy móc và bảo quản sinh phẩm thì cần phải dừng xét
nghiệm.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Không tách chiết được
ADN: kiểm tra thông qua hiệu quả tách của mẫu chứng dương (PC). Nếu PC âm tính
cần kiểm tra lại thuốc thử của bộ kit và phương pháp tách chiết theo khuyến cáo
của nhà sản xuất.
- Mẻ PCR bị nhiễm: kiểm
tra thông qua chứng âm (NC) và chứng NTC. Trong trường hợp chứng NC dương tính
và NTC âm tính thì khâu tách chiết bị nhiễm, xem xét lại quá trình tách chiết.
Trong trường hợp chứng NC âm tính và NTC dương tính thì khâu pha mix bị nhiễm,
xem xét lại khâu pha mix. Nếu cả NC và NTC dương tính thì cần xem xét lại cả quá
trình tách chiết, pha mix và PCR.
- Kết quả sequencing
không tốt: kiểm tra thông qua các tín hiệu nucleotide (ATGC). Nếu tín hiệu các
nucleotide không rõ ràng cần kiểm tra lại thiết bị giải trình tự theo khuyến
cáo của nhà sản xuất.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc và phiên giải kết
quả tương đồng giữa trình tự nucleotide phải chính xác, có sự kiểm tra chéo để
tránh nhầm lẫn. Cần đảm bảo đọc kết quả theo đúng quy định đã đề cập trong mục 4.2.2.
- Các kết quả chưa rõ
ràng cần phải lặp lại xét nghiệm hoặc xin ý kiến chuyên gia.
- Kết quả của mẫu cần
phải được đối chiếu cẩn thận với các thông tin trên phiếu chỉ định để tránh
nhầm lẫn
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Cần thực hiện kiểm tra
chất lượng xét nghiệm theo quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện ngoại kiểm
hoặc so sánh liên phòng để đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm
- Các xét nghiệm có kết
quả bất thường hoặc nghi ngờ cần phải thực hiện lại hoặc gửi đến các phòng xét
nghiệm tham chiếu/cơ sở y tế đã được chứng nhận về chất lượng để khẳng định
lại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định đột biến ở các
gen liên quan đến kháng thuốc của vi nấm bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide
(sequencing).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý
Đoạn ADN của các gen
liên quan đến kháng thuốc của vi nấm được nhân dòng bằng kỹ thuật PCR, trình tự
nucleotide được xác định bằng kỹ thuật sequencing. Trình tự này sau đó được
phân tích và so sánh với các chủng vi nấm dạng hoang dã (Wild type) để xác định
các đột biến có liên quan đến kháng thuốc của vi nấm.
Định nghĩa
- ADN (Axit
Deoxyribonucleic): Là vật chất di truyền cơ bản của hầu hết vi sinh vật, bao
gồm vi sinh vật gây bệnh
- PCR (Polymerase Chain
Reaction): Phản ứng enzyme chuỗi trùng hợp, dùng nhân bản ADN
- Sequencing: Là một kỹ
thuật trong phòng thí nghiệm, được sử dụng để xác định trình tự của các loại
bazơ (A, C, T và G) trong phân tử ADN
- An toàn sinh học
(ATSH): Là một thuật ngữ dùng để mô tả những nguyên tắc, kỹ thuật và thực hành
cần thiết giúp ngăn chặn và loại trừ nguy cơ phơi nhiễm đối với nhân viên phòng
xét nghiệm, cộng đồng và môi trường từ các tác nhân gây bệnh và độc tố.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Các hóa chất cần
thiết tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Các vật tư cần thiết
tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1
thanh)
- Nắp strip (bằng số
tuýp 0.1 ml)
- Tuýp 1.5 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.5
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm spindown
- Máy Vortex
- Máy ủ nhiệt
- Máy tách chiết ADN
- Máy PCR
- Máy điện di sản phẩm
PCR
- Máy giải trình tự nucleotide
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -80ºC
- Pipette các loại từ 2.5
µl - 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: chủng
vi nấm đã được nuôi cấy thuần.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm và đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Trên phiếu chỉ định xét
nghiệm phải bao gồm loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 5 ngày.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm sinh
học phân tử
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất và quy định của chuyên ngành vi sinh
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất
a. Tách chiết ADN
- Chứng âm NC (Negative
Control): dùng nước cất đã được khử trùng. Tiến hành tách chiết chứng âm đồng
thời với các bệnh phẩm khác.
- Chứng dương PC
(Positive Control): dùng mẫu vi nấm chuẩn hoặc mẫu vi nấm có chứa đột biến gen
kháng thuốc đã được định danh, tiến hành tách chiết chứng dương đồng thời với
các bệnh phẩm khác.
- Thực hiện tách chiết
bằng máy tự động hoặc bằng phương pháp thủ công
b. Thực hiện phản ứng PCR
- Chuẩn bị sinh phẩm
(Master mix) cho phản ứng PCR
- Số lượng ống PCR cần
cho một lần xét nghiệm theo công thức sau:
Số lượng ống = Số bệnh
phẩm + 3
Chú ý: Một lần thực hiện PCR
cần tiến hành đồng thời 3 loại chứng bao gồm: Chứng dương để đảm bảo quá trình
thực hiện PCR; Chứng âm để đảm bảo quá trình tách chiết ADN không bị nhiễm;
Chứng NTC (None Template Control) để đảm bảo Master mix của phản ứng PCR không
bị nhiễm.
- Tiến hành tan đá các
ống trong kit Taq PCR Master Mix và các ống primer, sau đó giữ ở nhiệt độ 4 oC
trên khay đá.
- Lấy 1 ống eppendof 1.5
ml vô trùng, không chứa DNase và để trên khay đá, sau đó trộn các thành phần
Master mix theo công thức sau:
|
TT
|
Thành phần
|
Thể tích (µl)
|
|
1
|
PCR Master Mix
|
25.0
|
|
2
|
MgCl2
|
1.0
|
|
3
|
Mồi xuôi
|
1.0
|
|
4
|
Mồi ngược
|
1.0
|
|
5
|
H2O
|
17.0
|
|
6
|
ADN khuôn
|
5.0
|
|
7
|
Tổng thể tích
|
50
|
- Chia mỗi ống phản ứng
PCR 50 µl của hỗn hợp trên.
Quy trình PCR
- Chuyển 5 µl sản phẩm
tách chiết DNA cùng các chứng dương và âm vào các ống PCR tương ứng.
- Ly tâm nhanh các ống
PCR có chứa Mix và sản phẩm DNA tách chiết.
- Chuyển các ống PCR vào
máy luân nhiệt và cài đặt theo chu trình nhiệt sau:
|
TT
|
Nhiệt độ
|
Thời gian
|
Số chu kỳ
|
|
1
|
95 ºC
|
5 phút
|
1 chu kỳ
|
|
2
|
95 ºC
|
20 giây
|
35 chu kỳ
|
|
58 ºC
|
30 giây
|
|
72 ºC
|
1 phút
|
|
3
|
72 ºC
|
15 phút
|
1 chu kỳ
|
|
4
|
4 ºC
|
Bảo quản
|
c. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị Agarose 1,2 %
- Đun nóng chảy agarose
bằng lò vi sóng (2-3 phút), để nguội đến 55-60 oC và đổ vào khuôn đã cài sẵn
lược.
- Để gel đông sau khoảng
20 phút, đặt bản gel vào bể điện di đã bổ sung buffer TAE 1x và sau đo tiến
hành điện di.
- Thành phần 1 giếng điện
di như sau: 5 µl sản phẩm PCR + 1.5 µl Loading Dye. Trộn đều và tra lần lượt
mẫu vào các giếng trên bản gel
- Điện di với cường độ
dòng điện 100 V trong 30 phút
- Đọc và phân tích kết
quả điện di trên máy chup gel
d. Tinh sạch sản phẩm PCR
- Tinh sạch bằng phương
pháp cột lọc hoặc bằng phương pháp enzyme
Thực hiện phản ứng PCR sequencing
- Thành phần phản ứng PCR
sequencing:
|
STT
|
Thành phần
|
Thể tích (µl)
|
|
1
|
Master mix
|
2.0
|
|
2
|
Đệm (Buffer)
|
4.0
|
|
3
|
Mồi (Primer)
|
1.0
|
|
4
|
ADN khuôn
|
1.0
|
|
5
|
H2O
|
12.0
|
|
6
|
Tổng thể tích
|
20.0
|
- Chu trình nhiệt phản
ứng PCR sequencing:
|
TT
|
Nhiệt độ
|
Thời gian
|
Số chu kỳ
|
|
1
|
96 ºC
|
1 phút
|
1 chu kỳ
|
|
2
|
96 ºC
|
10 giây
|
25 chu kỳ
|
|
50 ºC
|
5 giây
|
|
60 ºC
|
4 phút
|
e. Tinh sạch sản phẩm PCR sequening
- Tinh sạch bằng phương
pháp hạt bead hoặc phương pháp cột lọc
f. Thực hiện đọc trình tự nucleotide
- Hút 20µL sản phẩm PCR
sequencing đã tinh sạch vào plate.
- Đặt plate vào vị trí
đọc trên máy giải trình tự.
- Thực hiện giải trình tự
nucleotide tren máy sequencing theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Lưu dữ liệu chứa trình
tự nucleotide của mẫu xét nghiệm vào máy tính. Chọn ổ đĩa cứng hoặc di động để
tránh làm mất hoặc hỏng dữ liệu.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
các chứng
- Chỉ phân tích kết quả
của mẫu xét nghiệm khi các chứng NC, NTC, PC đạt yêu cầu
4.2.2. Đọc kết quả
- Trình tự của mẫu thu
nhận được từ máy sequencing được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng để loại bỏ các
sai số.
- Đưa trình tự nucleotide
lên ngân hàng dữ liệu gen (http://ncbi.nlm.gov/blast).
- Bấm Search để tiến hành
so sánh với các database trong ngân hàng dữ liệu về kháng thuốc của vi nấm.
- Kết quả so sánh hiển
thị không có hoặc có các điểm đột biến liên quan đến kháng và mức độ đề kháng
các loại thuốc đang sử dụng trong điều trị nấm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét và đánh giá lại
toàn bộ các bước trước, trong và sau xét nghiệm để loại bỏ các yếu tố sai sót
trước khi trả kết quả xét nghiệm. Trong trường hợp phát hiện ra sai sót cần hủy
kết quả xét nghiệm.
- Trả kết quả xét nghiệm
theo quy định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng và bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Mẫu bệnh: nếu mẫu bệnh
phẩm không đạt yêu cầu về chất lượng hoặc bảo quản, vận chuyển không đúng cách.
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Nếu không lấy lại được bệnh phẩm
thì phòng xét nghiệm sẽ vẫn thực hiện và ghi chú về khả năng sai lệch kết quả
do chất lượng của mẫu bệnh phẩm không được đảm bảo.
- Máy móc, sinh phẩm: máy
móc cần được bảo trì, bảo dưỡng định kỳ theo quy định. Sinh phẩm được nhập, bảo
quản theo đúng quy định và hướng dẫn của nhà sản xuất. Nếu phát hiện các sai
sót về bảo trì bảo dưỡng máy móc và bảo quản sinh phẩm thì cần phải dừng xét
nghiệm.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Không tách chiết được
ADN: kiểm tra thông qua hiệu quả tách của mẫu chứng dương (PC). Nếu PC âm tính
cần kiểm tra lại thuốc thử của bộ kit và phương pháp tách chiết theo khuyến cáo
của nhà sản xuất.
- Mẻ PCR bị nhiễm: kiểm
tra thông qua chứng âm (NC) và chứng NTC. Trong trường hợp chứng NC dương tính
và NTC âm tính thì khâu tách chiết bị nhiễm, xem xét lại quá trình tách chiết.
Trong trường hợp chứng NC âm tính và NTC dương tính thì khâu pha mix bị nhiễm,
xem xét lại khâu pha mix. Nếu cả NC và NTC dương tính thì cần xem xét lại cả quá
trình tách chiết, pha mix và PCR.
- Kết quả sequencing
không tốt: kiểm tra thông qua các tín hiệu nucleotide (ATGC). Nếu tín hiệu các
nucleotide không rõ ràng cần kiểm tra lại thiết bị giải trình tự theo khuyến
cáo của nhà sản xuất.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc và phiên giải kết
quả tương đồng giữa trình tự nucleotide phải chính xác, có sự kiểm tra chéo để
tránh nhầm lẫn. Cần đảm bảo đọc kết quả theo đúng quy định đã đề cập trong mục 4.2.2.
- Các kết quả chưa rõ
ràng cần phải lặp lại xét nghiệm hoặc xin ý kiến chuyên gia.
- Kết quả của mẫu cần
phải được đối chiếu cẩn thận với các thông tin trên phiếu chỉ định để tránh
nhầm lẫn
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Cần thực hiện kiểm tra
chất lượng xét nghiệm theo quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện ngoại kiểm
hoặc so sánh liên phòng để đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm
- Các xét nghiệm có kết
quả bất thường hoặc nghi ngờ cần phải thực hiện lại hoặc gửi đến các phòng xét
nghiệm tham chiếu/cơ sở y tế đã được chứng nhận về chất lượng để khẳng định
lại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
8. Vi sinh vật nhiễm
khuẩn sinh dục - tiết niệu Real-time PCR đa tác nhân (cho trên 3 tác nhân, tùy
thuộc vào số lượng tác nhân cần xác định)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện DNA đặc trưng của các vi sinh vật C.trachomatis
(CT), N.gonorrhoea (NG), M.genitalium (MG), M.hominis (MH),
U.urealyticum (UU), U.parvum (UP) và T.vaginalis (TV)
trong mẫu bệnh phẩm của người.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xác định vi sinh vật
gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm dựa trên công nghệ MuDTTM (Công nghệ phát hiện đa
đích) và nguyên lý RT-PCR một bước, đa mồi để khuyếch đại và phát hiện nhiều
acid nucleic đích từ mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1
thanh)
- Nắp strip (bằng số
tuýp 0.1 ml)
- Tuýp 1.5 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.5
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm thường
- Tủ an toàn sinh học
cấp II
- Hệ thống tách chiết
tự động
- Hệ thống máy
Real-time PCR và máy vi tính có cài đặt phần mềm
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt kèm lắc
rung
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm:
+ Nước tiểu: Bệnh nhân
nhịn tiểu ít nhất 2 giờ trước khi lấy bệnh phẩm. Lấy 10 - 30 ml nước tiểu đầu
đựng vào lọ vô trùng.
+ Tăm bông dịch sinh dục:
Sử dụng tăm bông đựng trong 1-3 ml môi trường vận chuyển.
+ Dịch tế bào: Sử dụng
môi trường bảo quản .
+ Bệnh phẩm cần chuyển
đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 giờ.
+ Bảo quản bệnh phẩm: 2 -
8ºC/1 tuần; 2 - 8ºC/6 tuần khi bảo quản trong môi trường ThinPrep, 2 - 8ºC/2
tuần khi bảo quản trong môi trường Sure Path.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 300 phút (5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất và quy trình của phòng xét nghiệm.
- Nước tiểu: Để bệnh phẩm
cân bằng ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 ml nước tiểu ly tâm 15000 x g (13000 rpm)
trong 15 phút. Loại bỏ nước nổi, thu cặn và hòa tan trong nước muối bằng cách
lắc trộn trên máy vortex.
- Dịch ống cổ tử cung: Để
bệnh phẩm cân bằng ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 ml dịch tế bào ly tâm 15000 x g
(13000 rpm) trong 15 phút. Loại bỏ nước nổi, thu cặn và hòa tan trong nước muối
bằng cách lắc trộn trên máy vortex.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
a. Tách chiết acid nucleic
- Sử dụng chứng nội nội
sinh cho các loại bệnh phẩm, trừ nước tiểu.
- Trong bộ kit có chứng
nội ASTI
- Thực hiện tách chiết
bằng máy hoặc tách chiết thủ công.
b. Thực hiện phản ứng real-time PCR
* Chuẩn bị sinh phẩm (Master mix) cho phản ứng
Realtime PCR
- Số lượng ống PCR cần
cho một lần xét nghiệm theo công thức sau:
Số lượng ống (N) = Số
bệnh phẩm + số chứng + 2
Chú ý: Một lần chạy Realtime
PCR cần tiến hành đồng thời 2 loại chứng bao gồm: Chứng dương để đảm bảo các
sinh phẩm và phản ứng PCR đã tiến hành đúng; chứng âm để đảm bảo quá trình tách
chiết DNA không bị nhiễm và tiến hành đúng.
|
1 pư
|
N pư
|
Thành phần
|
|
5 µL
|
N * 5
|
4X STI-EA MOM
|
|
5 µL
|
N * 5
|
EM1
|
|
5 µL
|
N * 5
|
RNAse-free water
|
|
15 µL
|
N * 15
|
Tổng thể tích Mastermix
|
- Hút 15 µl Master mix
vào từng ống PCR bao gồm cả ống cho bệnh phẩm, chứng dương, chứng âm. Đặt các
ống PCR đã chứa master mix vào dụng cụ làm lạnh hoặc khay đá trong lúc tiến
hành tách trộn mẫu.
* Real-time PCR: Vận hành theo hướng dẫn
sử dụng máy Real-time PCR.
- Cho vào mỗi ống PCR 5µl
DNA mẫu bệnh phẩm đã tách chiết, chứng dương và chứng âm.
- Ly tâm nhẹ các ống PCR
có chứa MasterMix và sản phẩm DNA tách chiết.
- Chuyển các ống PCR vào
máy luân nhiệt và cài đặt chu trình nhiệt, màu huỳnh quang theo hướng dẫn của
nhà sản xuất.
- Lưu file dữ liệu vào
máy tính. Nên chọn lưu ở phân vùng ổ cứng không cài hệ điều hành.
- Cho máy real-time PCR
chạy chương trình.
Chú ý: Đối với các tác nhân
có cùng chương trình PCR thì có thể thực hiện chung 1 lần. Nếu màu dùng để phát
hiện các tác nhân là khác nhau thì cứ mỗi tác nhân sẽ chọn màu tương ứng cho
nó.
4.2. Nhận định kết quả
Khi quá trình Real
time-PCR kết thúc, xuất kết quả vào thư mục đích. Phân tích kết
quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
- Đánh giá NC và PC: Đánh
giá kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chỉ trả kết quả khi QC đạt.
- Đánh giá IC: Nếu kết
quả không lên IC thì phải lặp lại xét nghiệm từ bước tách chiết.
4.2.2 Đọc kết quả: Theo
quy trình của phòng xét nghiệm và hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Tín hiệu của IC yếu hoặc không có:
lặp lại xét nghiệm
● Phản ứng PCR bị ức chế:
Kiểm tra phương pháp
tách chiết DNA theo khuyến cáo.
● Điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn 
Kiểm tra điều kiện bảo quản.
● Điều kiện PCR không
đúng theo hướng dẫn Kiểm
tra điều kiện PCR và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC trong quy trình.
● Không thêm IC vào các
mẫu trong khi hút thuốc thử Thêm IC trong quá trình tách chiết DNA/RNA.
5.2.2. Tín hiệu của mẫu
yếu: lặp lại xét nghiệm.
5.2.3. Chứng âm xuất
hiện tín hiệu dương tính:
● Nhiễm trong quá trình
tách chiết. Kết quả tất cả các mẫu không hợp lệ:
Khử trùng tất cả bề mặt và dụng cụ
với sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA đặc trưng.
Chỉ sử dụng tip có đầu lọc trong
quá trình tách chiết. Thay đổi đầu tip giữa các ống.
Lặp lại bước tách chiết DNA với bộ
thuốc thử mới.
Thực hiện lại bước chuẩn bị PCR
với bộ thuốc thử mới.
5.2.4. Không có tín
hiệu dương của chứng dương: thực hiện lại một lần nữa phản ứng PCR.
● Có thể chương trình
khuếch đại không chính xác hoặc các lỗi khác xảy ra trong quá trình khuếch đại
PCR 
Kiểm tra điều
kiện PCR và kênh huỳnh quang cho phát hiện ICchứng dương trong quy trình .
● Chứng dương bị hỏng 
Có thể điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn 
Kiểm tra điều kiện bảo quản.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Để phát hiện DNA của vi
khuẩn kháng kháng sinh trong mẫu bệnh phẩm của người bằng kỹ thuật Real-time
PCR đa mồi.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xác định vi sinh vật
gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm dựa trên công nghệ phát hiện đa đích và nguyên lý
RT-PCR một bước, đa mồi để khuyếch đại và phát hiện nhiều acid nucleic đích từ
mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1
thanh)
- Nắp strip (bằng số
tuýp 0.1 ml)
- Tuýp 1.5 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.5
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm thường
- Tủ an toàn sinh học
cấp II
- Hệ thống tách chiết
tự động
- Hệ thống máy
Real-time PCR và máy vi tính có cài đặt phần mềm
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt kèm lắc
rung
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm:
+ Đờm: lấy ít nhất 1 ml
đờm vào lọ vô trùng.
+ Nước tiểu: Lấy nước
tiểu đầu vào buổi sáng sau khi ngủ dậy, lấy khoảng 20 ml - 30 ml vào lọ vô
trùng.
+ Tăm bông
+ Bệnh phẩm cạo từ đường
hô hấp, đường tiêu hóa, sinh dục tiết niệu.
+ Dịch hút, dịch tiết.
+ Nuôi cấy vi khuẩn thu
được bằng cách cấy mẫu bệnh phẩm lâm sàng trong môi trường canh thang hoặc môi
trường thạch.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 300 phút (5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
a. Tách chiết acid nucleic
- Trước khi tách chiết
cho 10 µl chứng nội (IC) vào từng giếng nhỏ bệnh phẩm. Thực hiện tách chiết
bằng máy hoặc tách chiết thủ công.
- Thực hiện tách chiết
bằng máy hoặc tách chiết thủ công.
b. Thực hiện phản ứng real-time PCR
* Chuẩn bị sinh phẩm (Master mix) cho phản ứng
Realtime PCR
- Số lượng ống PCR cần
cho một lần xét nghiệm theo công thức sau:
Số lượng ống (N) = Số
bệnh phẩm + số chứng + 2
Chú ý: Một lần chạy Realtime
PCR cần tiến hành đồng thời 2 loại chứng bao gồm: Chứng dương để đảm bảo các
sinh phẩm và phản ứng PCR đã tiến hành đúng; chứng âm để đảm bảo quá trình tách
chiết DNA không bị nhiễm và tiến hành đúng.
- Chuẩn bị ống Master Mix
với tỷ lệ các thành phần như dưới đây:
|
Thành phần
|
Cho 1 phản ứng
|
Cho n phản ứng
|
|
PCR-Reaction Mix - 1 (20 µl/ống)
|
1 thanh 8 ống
|
1 x n
|
|
Taq Polymerase
|
10 µl
|
10 x n
|
- Đảo trộn ống nhẹ nhàng khoảng
5 lần hoặc vortex sau đó ly tâm spindown.
- Đặt các ống PCR đã chứa
master mix vào dụng cụ làm lạnh hoặc khay đá trong lúc tiến hành tách trộn mẫu.
* Real-time PCR: Vận hành theo hướng dẫn
sử dụng máy Real-time PCR.
- Cho vào mỗi ống PCR 5
µl DNA mẫu bệnh phẩm đã tách chiết, 5 µl chứng dương và 5 µl chứng âm. Thể tích
cuối cùng là 25 µl.
- Ly tâm nhẹ các ống PCR
có chứa MasterMix và sản phẩm DNA tách chiết.
- Chuyển các ống PCR vào
máy luân nhiệt và cài đặt chu trình nhiệt, màu huỳnh quang theo hướng dẫn của
nhà sản xuất.
- Lưu file dữ liệu vào
máy tính. Nên chọn lưu ở phân vùng ổ cứng không cài hệ điều hành.
- Cho máy real-time PCR
chạy chương trình.
Chú ý: Đối với các tác nhân có
cùng chương trình PCR thì có thể thực hiện chung 1 lần. Nếu màu dùng để phát hiện
các tác nhân là khác nhau thì cứ mỗi tác nhân sẽ chọn màu tương ứng cho nó.
4.2. Nhận định kết quả
- Khi quá trình Real time
-PCR kết thúc, xuất kết quả vào thư mục đích. Phân tích kết quả
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
- Đánh giá NC và PC: Đánh
giá kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chỉ trả kết quả khi QC đạt.
- Đánh giá IC: Nếu kết
quả không lên IC thì phải lặp lại xét nghiệm từ bước tách chiết.
4.2.2 Đọc kết quả:
Theo quy trình của phòng xét nghiệm và hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Tín hiệu của IC
yếu hoặc không có: lặp lại xét nghiệm
● Phản ứng PCR bị ức chế:
Kiểm tra phương pháp
tách chiết DNA theo khuyến cáo.
● Điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo quản.
● Điều kiện PCR không
đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC trong quy trình.
● Không thêm IC vào các
mẫu trong khi hút thuốc thử Thêm IC trong quá trình
tách chiết DNA/RNA.
5.2.2. Tín hiệu của mẫu
yếu: lặp lại xét nghiệm.
5.2.3. Chứng âm xuất
hiện tín hiệu dương tính:
● Nhiễm trong quá trình
tách chiết. Kết quả tất cả các mẫu không hợp lệ:
Khử trùng tất cả bề mặt và dụng cụ với
sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA đặc trưng.
Chỉ sử dụng tip có đầu lọc trong quá
trình tách chiết. Thay đổi đầu tip giữa các ống.
Lặp lại bước tách chiết DNA với bộ thuốc
thử mới.
Thực hiện lại bước chuẩn bị PCR với bộ
thuốc thử mới.
5.2.4. Không có tín
hiệu dương của chứng dương: thực hiện lại một lần nữa phản ứng PCR.
● Có thể chương trình
khuếch đại không chính xác hoặc các lỗi khác xảy ra trong quá trình khuếch đại
PCR Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện ICchứng dương trong quy trình .
● Chứng dương bị hỏng Có thể điều kiện bảo quản thuốc thử
không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo
quản.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định DNA đặc trưng của NTM (Nontuberculous
mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm của người bằng kỹ thuật Real-time PCR.
1.2. Định nghĩa, Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của
kỹ thuật Real-time PCR là phản ứng PCR trong đó kết quả khuếch đại DNA đích
được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
Bộ sinh phẩm MTB/NTMe
Real-time detection.
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
Các vật tư cần thiết
tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1
thanh)
- Nắp strip (bằng số
tuýp 0.1 ml)
- Tuýp 1.5 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.5
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Bơm kim tiêm vô trùng
5-10ml
- Bông tiêm
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay không bột
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm thường
- Tủ an toàn sinh học
cấp II
- Hệ thống tách chiết
tự động
- Hệ thống máy
Real-time PCR tự động và máy vi tính có cài đặt phần mềm
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt kèm lắc
rung
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Đờm,
các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não tủy, nước tiểu, phân...), dịch nuôi
cấy, mảnh sinh thiết...
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 300 phút (5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
a) Đờm:
Xử lý đờm bằng dung dịch EZ:
Thêm thể tích tương
đương của Dung dịch EZ (Cat.No. K-4418-4) vào mẫu đờm và lắc trộn mạnh bằng máy
vortex trong 3 phút. Sau đó ủ mẫu trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.
Lưu ý: Nếu mẫu quá nhớt, thêm gấp đôi thể
tích Dung dịch EZ hoặc kéo dài thời gian ủ lên đến 30 phút.
b) Dịch phế quản (BAL):
- Trộn mẫu vừa đủ bằng
máy vortex trong 1 phút. Chuyển 1 ml sang tube eppendorf 1,5 ml vô trùng
Lưu ý: Nếu mẫu nhớt, thêm NaOH 200 ㎕ 10 N và ủ ở nhiệt độ
phòng (25ºC) trong 15 phút.
- Ly tâm ở tốc độ 9.000
vòng / phút trong 5 phút và loại bỏ phần nước nổi phía trên.
- Thêm 1 ml 1x PBS hoặc
nước muối thông thường, xoáy trong 30 giây, ly tâm mẫu ở tốc độ 9.000 vòng /
phút trong 5 phút, và loại bỏ phần nổi phía trên. Lặp lại bước giặt này 3 lần.
Lưu ý: Nếu lớp trắng hình thành phía trên
viên tế bào, hãy loại bỏ lớp có phần nổi phía trên và để lại viên tế bào
- Phần cặn còn lại được
sử dụng để tách chiết DNA.
c) Nước tiểu:
- Chuyển 5 ~ 10 ml mẫu
nước tiểu vào ống hình nón
- Ly tâm ở tốc độ 3.000
vòng / phút trong 20 phút và loại bỏ phần nước nổi phía trên.
- Phần cặn còn lại được
sử dụng để tách chiết DNA.
d) Mảnh sinh thiết
- Cắt hoặc nghiền mẫu mô
trong bình vô trùng.
- Hòa tan trong 1 mL dung
dịch PBS 1X.
- Ly tâm ở 15.000 x g
(13.000 vòng / phút) trong 5 phút và loại bỏ phần nổi phía trên bằng pipette.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật
a. Tách chiết acid nucleic
- Thực hiện tách chiết
bằng máy PCR tự động.
b. Thực hiện phản ứng real-time PCR
Vận hành theo hướng dẫn
sử dụng máy
- Số lượng các ống đối
chứng (PC, IPC) và axit nucleic đã tách (nếu để đông lạnh) nên được rã đông ở
nhiệt độ phòng ít nhất 10 phút trước khi sử dụng. Ít nhất 4 ống premix (2 NTC,
2 PC) cần cho đối chứng thí nghiệm, vì thế số ống premix cần là:
- 4 (Đối chứng thí
nghiệm) + số ống mẫu
- Vortex hơn 10 giây và
ly tâm nhanh tất cả thuốc thử đối chứng và mẫu bệnh phẩm trước khi dùng.
- Mỗi phản ứng, trộn 44 ㎕ of DEPC DW với 1 ㎕ of IPC. Chuẩn bị nhiều
hơn 1 ống so với số lượng cần để tránh trường hợp mất dung dịch do dính ống.
Vortex và spin-down các ống 10 giây trước khi dùng. Bảng dưới đây là một ví dụ
chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
- Nhỏ 45 
hỗn hợp phản ứng đã pha trộn vào tất cả
các ống premix.
- Nhỏ 5 
DEPC DW vào các giếng NTC ở vị trí A1. Đậy
các ống để tránh nhiễm chéo trong quá trình chuẩn bị
- Chuyển tất cả các ống
đến một khu vực riêng trước khi chạy PCR để tránh nhiễm chéo. Nhỏ 5 
PC vào các ống sẽ được đặt ở vị trí C1
và D1.
- Nhỏ 5 dịch chiết axit nucleic acid vào các
giếng còn lại, ghi chú là mẫu nào tương ứng với mẫu bệnh phẩm gốc nào.
- Dùng kéo cắt Optical Film
với kích thước phù hợp và dùng Optical Film Applicator để gắn chặt lên các ống
nghiệm.
Chú ý: Để tránh lây chéo và
cho kết quả sai lệch, hãy gắn thật cẩn thận.
- Để hòa tan các hạt
premix, và khuấy trộn premix với mẫu DNA, hãy dùng ExiSpin™ (Cat. no.:
A-7040) và thực hiện 20 chu kỳ, tốc độ 2500 rpm, theo chu kỳ: spin-down 5 giây/lắc
mạnh: 20 giây.
Chú ý: PCR premix có sẵn các
thuốc thử PCR đông khô. Khuấy trộn premix không hiệu quả có thể cho kết quả PCR
không chính xác, vì thế hãy khuấy trộn premix thật kỹ trước khi dùng.
- Khởi động máy PCR.
- Khi máy tách kết thúc,
chuyển các ống phản ứng sang máy khuếch đại ngay.
Nhấn nút Standby Power Switch. Đèn LED sẽ đỏ
- Nhấn giữ nút Power 2
giây, sau khi máy tự kiểm tra, đèn LED sẽ lên màu xanh sau một tiếng “bíp”
ngắn.
- Nhấn giữ nút Door 2
giây, cửa mở, đưa các ống phản ứng vào các vị trí định sẵn: NTC ở vị trí A1,
B1; các ống PC ở vị trí C1, D1. Sau đó nhấn nút Door 2 giây để đóng cửa.
Chú ý: Nếu chạy ít hơn 6 hàng
PCR, đưa các ống trống vào vị trí đối diện ở hàng thứ 12 để cân bằng áp lực của
nắp nhiệt.
Dùng chương trình tạo định dạng file ‘*.xls’ để
tạo bản đồ chạy mẫu
- Lưu file ở định dạng
‘*.xls’ ở vị trí dễ tìm.
- Nhấn chuột đúp vào
biểu tượng ‘Run’ để khởi động chương trình, nếu như có thông báo ‘Máy chưa sẵn
sàng-Device is Not ready’, đóng chương trình và khởi động lại. Nếu xuất hiện
‘Hệ thống sẵn sàng-System is ready’, máy tính đã kết nối thành công với thiết
bị.
- Để lập chương trình
chạy, nhấp ‘File - Design Experiment’ trên thanh Menu.
- Khi cửa sổ ‘Select
Diagnostics Kit’ mở ra, chọn ‘MTB & NTM Real-Time PCR Kit’.
- Tiếp đó, tìm Bản đồ
mẫu đã lưu ở bước 13, nhấp ‘Open’ .
- Khi cửa sổ ‘Sample
Assign View’ mở ra, hãy xác nhận các vị trí vật lý nơi đặt các dãy ống PCR
trong máy phù hợp với Bản đồ mẫu rồi nhấn ‘OK’ .
Chú ý: Nếu cần thay đổi cách
hiện thị đĩa, nhấp “Edit” và thực hiện các thay đổi cần thiết. Hoàn thành, nhấp
“Update”, phần mềm sẽ hỏi ‘Do you save your changes to Excel File?’, nếu
muốn thay đổi vĩnh viễn, chọn ‘Yes(Y)’ và tiếp tục chọn đĩa ‘*.xls’
gốc. Chọn ‘Yes(Y)’ khi phần mềm hỏi bạn có muốn thay thế file ban đầu.
- Khi cửa sổ ‘Quick
Start…’ mở ra, xác nhận những thông tin về quy trình PCR (trên ‘Protocol’ tab)
và hiển thị mẫu (trên ‘Plate’ tab) và nhấp ‘OK’ nếu mọi thông tin chính xác.
- Để thực hiện phản ứng,
nhấp vào nút ‘►‘button trên thanh công cụ.
Chú ý: File kết quả (.ex3) sẽ
được lưu tự động theo ngày trên máy.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm (QC)
Chỉ trả kết quả khi QC
đạt yêu cầu.
+ Kết quả mẫu chứng:
Nếu giá trị MTB và NTM Ct của mỗi chứng nằm trong phạm vi được chỉ định của nó,
thì nó được gắn cờ 'Valid'. Nếu kết quả chứng được gắn cờ "Invalid",
hãy thực hiện lại xét nghiệm
4.2.2. Đọc kết quả
● Mở chương trình
‘Analysis’ có biểu tượng trên màn hình.
● Chọn File>Open, chọn
tiếp file (.ex3), file kết quả được lưu trữ trong thư mục.
● Rất nhiều tab sẽ hiển
thị như dưới đây. ‘MTB & NTM Real-Time PCR Kit’ tab được hiển thị như đã
xuất hiện lúc đầu.
● Tab ‘MTB & NTM
Real-Time PCR Kit’ sẽ hiện thị giá trị Ct được phân tích.
- Well: Vị trí các giếng
đối chứng (PC, IPC) và mẫu trên khối nhiệt 96 giếng.
- Sample ID: NTC (chứng
âm), PC (chứng dương) và tên mẫu đã đưa vào trong Bản đồ mẫu.
- IPC Result: Hiệu lực
IPC (chứng nội) tính theo giá trị Ct IPC của từng giếng. Nếu giá trị trong khoảng
(cho sẵn) sẽ được gắn cờ ‘Valid’, nếu ngoài khoảng sẽ gắn cờ ‘Invalid’.
- Target Ct: Giá trị Ct
MTB & NTM từng giếng, nếu xét nghiệm có giá trị, NTC sẽ được gắn cờ
‘Undetermined’ và giá trị Ct PC sẽ ở trong khoảng.
- Kết quả cuối cùng:
Trình bày kết quả cuối cùng của các đối chứng và mẫu.
+ Kết quả mẫu chứng:
Nếu giá trị MTB và NTM Ct của mỗi chứng nằm trong phạm vi được chỉ định của nó,
thì nó được gắn cờ 'Valid'. Nếu kết quả chứng được gắn cờ "Invalid",
hãy thực hiện lại xét nghiệm.
+ Kết quả mẫu bệnh
phẩm: Kết quả mẫu được gắn cờ “Detected” hoặc “Non- Detected” theo giá trị
Ct của MTB và NTM.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Tín hiệu của IC
yếu hoặc không có: lặp lại xét nghiệm
● Phản ứng PCR bị ức chế:
Kiểm tra phương pháp
tách chiết DNA theo khuyến cáo.
● Điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo quản.
● Điều kiện PCR không
đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC trong quy trình.
● Không thêm IC vào các
mẫu trong khi hút thuốc thử Thêm IC trong quá trình
tách chiết DNA/RNA.
5.2.2. Tín hiệu của mẫu
yếu (Ct > 36): lặp lại xét nghiệm.
5.2.3. Chứng âm xuất
hiện tín hiệu dương tính:
● Nhiễm trong quá trình
tách chiết. Kết quả tất cả các mẫu không hợp lệ:
Khử trùng tất cả bề mặt và dụng cụ với
sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA đặc trưng.
Chỉ sử dụng tip có đầu lọc trong quá
trình tách chiết. Thay đổi đầu tip giữa các ống.
Lặp lại bước tách chiết DNA với bộ thuốc
thử mới.
Thực hiện lại bước chuẩn bị PCR với bộ
thuốc thử mới.
5.2.4. Không có tín
hiệu dương của chứng dương: thực hiện lại một lần nữa phản ứng PCR.
● Có thể chương trình
khuếch đại không chính xác hoặc các lỗi khác xảy ra trong quá trình khuếch đại
PCR Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện ICchứng dương trong quy trình.
● Chứng dương bị hỏng Có thể điều kiện bảo quản thuốc thử
không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo
quản.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện trứng giun
sán trong mẫu phân bệnh nhân bằng kỹ thuật lắng cặn.
1.2. Nguyên lý
Mẫu phân được hòa tan
với nước và để lắng tự nhiên. Trong cặn lắng có chứa các ký sinh trùng có trong
phân. Phương pháp này cho phép phát hiện các loại đơn bào, trứng giun, ấu trùng
và trứng sán.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Nước pha glycerin 0,5%
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm
- Que gỗ xử lý bệnh phẩm
- Tăm bông xử lý bệnh
phẩm
- Lam kính
- Lamen
- Ly có chân
- hay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Panh
- Cốc đựng rác thải y tế
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Kính hiển vi quang học
- Đồng hồ bấm giờ
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Mẫu
phân được lấy vào lọ đựng mẫu sạch, đóng kín.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Lấy mẫu phân vào ly, cho thêm lượng nước hoặc
nước có pha glycerin 0,5% gấp 10 lần lượng mẫu.
|
|
2
|
Khuấy đều phân trong ly có chân, để lắng 1
giờ.
|
|
3
|
Đổ bỏ phần nước nổi bên trên.
|
|
4
|
Thêm nước, khuấy đều, để lắng 1 giờ, gạn bỏ phần
nước nổi.
|
|
5
|
Lập lại nhiều lần cho đến khi nước bên trên
trong hẳn.
|
|
6
|
Bỏ phần nước nổi.
|
|
7
|
Khuấy đều phần cặn, lấy 1 hoặc 2 giọt cặn
quan sát dưới kính hiển vi.
|
4.2. Nhận định kết quả
- Âm tính: Không thấy
trứng giun sán.
- Dương tính: Trả kết quả
theo loại trứng giun, sán.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả.
Không trả kết quả khi
phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy định
bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử..
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Đối với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th edition.
12. Helicobacter
pylori kháng thuốc định lượng
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định mức độ nhạy
cảm và nồng độ ức chế tối thiểu của 6 loại kháng sinh (amoxicillin,
clarithromycin, levofloxacin, metronidazole, tetracycline và rifampicin) với
chủng Helicobacter pylori.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dải giấy kháng sinh có
kích thước 5 x 57 mm được thấm kháng sinh theo bậc nồng độ (μg/mL). Có 15 nồng
độ kháng sinh được pha loãng bậc 2 gắn cố định ở một mặt của dải giấy. Khi dải
giấy kháng sinh được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn, kháng sinh nhanh chóng
khuếch tán trong thạch. Sau khi nuôi cấy qua đêm, sẽ xuất hiện vùng ức chế hình
elip đối xứng qua dải giấy. Giá trị MIC được xác định tại điểm cắt của hình
elip với dải giấy kháng sinh. Giá trị MIC sẽ được phiên giải ra phân loại S (susceptibility
- nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), hoặc R (resistant -
đề kháng) theo hướng dẫn của EUCAST cập nhật hàng năm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm
- Kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Dải giấy kháng sinh (6
loại kháng sinh)
- Canh thang Brucella
- Thạch máu có chất dinh
dưỡng bổ sung
- Thạch Muller-Hinton F
(MHF)
- Túi tạo khí trường vi
hiếu khí
- Túi tạo khí trường kị
khí (cho thử nghiệm metronidazol)
- Ống canh thang BHI 15%
glycerol
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 1000 µL tiệt
trùng
- Đầu côn 200 µL tiệt
trùng
- Bút viết không xóa
- Que cấy
- Ống nghiệm thủy tinh
- Tăm bông vô trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp nuôi cấy vi hiếu
khí
- Panh
- Bộ độ đục chuẩn
McFarland
- Micropipette
- Chủng vi khuẩn chuẩn
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Tủ ấm
- Tủ an toàn sinh học cấp
2
- Lò hấp tiệt trùng
- Tủ sấy
- Máy đo pH
- Máy đo độ đục
- Máy vortex
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chủng vi khuẩn H.
pylori cần thử nghiệm đã được nuôi cấy thuần nhất trong điều kiện tối ưu và
đang ở giai đoạn phát triển mạnh trên môi trường không có chất chọn lọc.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có), mã bệnh phẩm, loài vi khuẩn
yêu cầu làm kháng sinh đồ.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 96 giờ (4
ngày).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
- Pha huyền dịch vi
khuẩn: Dùng
que cấy lấy khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống canh
thang Brucella (hoặc canh thang khác tương đương), lắc đều trên máy lắc để có
huyền dịch đồng nhất và có độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 3,0. (Không
để đĩa cấy vi khuẩn ra ngoài môi trường quá 30 phút cho đến lúc lấy khuẩn lạc).
- Dàn đều canh khuẩn lên
mặt đĩa thạch: Nhỏ
100 µl huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch MHF, dùng tăm bông vô ria đều huyền
dịch vi khuẩn trên toàn bộ mặt đĩa thạch MHF sao cho vi khuẩn được dàn đều lên
trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch.
- Đặt các khoanh giấy
kháng sinh lên mặt thạch: Đặt dải giấy kháng sinh lên mặt thạch sao cho mặt có ghi
dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của dải giấy kháng
sinh được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch (mỗi đĩa thạch đặt không quá 2 dải
giấy). Khi đã đặt xong dải giấy kháng sinh không được dịch chuyển dải giấy
kháng sinh khỏi vị trí.
- Ủ ấm: Đĩa thạch trong hộp kín
có chứa túi tạo môi trường vi hiếu khí rồi đặt hộp vào tủ ấm 35-37ºC trong 72
giờ. Đĩa thử nghiệm metronidazole được đặt trong hộp kín có chứa túi tạo môi
trường kị khí nếu 1 ngày sau đó chuyển sang môi trường vi hiếu khí.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm
- Chỉ đọc kết quả kháng
sinh đồ chủng bệnh nhân khi kết quả QC đạt.
4.2.2 Đọc và nhận định
kết quả
- Sau 72 giờ thấy rõ vi
khuẩn mọc, đọc giá trị MIC ở điểm cắt của hình elip với dải giấy kháng sinh.
Làm tròn giá trị MIC ở điểm giữa hai bậc pha loãng lên giá trị cao hơn một bậc
trước khi phiên giải kết quả.
- Phiên giải kết quả MIC
ra giá trị S, I hoặc R theo tài liệu hướng dẫn của EUCAST cập nhật hàng năm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Lẫn hai hay nhiều chủng
vi khuẩn.
- Vi khuẩn mọc quá dày
hoặc quá thưa.
- Phải tiến hành làm lại
khi thấy các hiện tượng như trên.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện nội
kiểm chất lượng hàng tuần, mỗi khi nhận lô kháng sinh mới, lô môi trường mới,
mỗi lần nhận sinh phẩm, hóa chất phải đạt yêu cầu theo hướng dẫn của EUCAST
phiên bản cập nhật hàng năm.
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
13. Mycoplasma
pneumoniae Ab ngưng kết hạt
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm miễn dịch phát hiện các kháng thể
kháng Mycoplasma pneumoniae trong huyết thanh người bệnh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Dựa trên nguyên lý của
kỹ thuật ngưng kết kháng nguyên-kháng thể. Sử dụng hạt nhân tạo có ái lực với
các thành phần của màng tế bào Mycoplasma pneumoniae. Các hạt bị ngưng
kết khi có mặt của các kháng thể kháng Mycoplasma pneumoniae trong huyết
thanh người và lắng xuống bề mặt của giếng phản ứng tạo thành các vòng tròn rộng
và có thể phát hiện được bằng mắt thường.
- Nồng độ kháng thể của
mẫu dương tính tiếp tục được xác định bằng phương pháp pha loãng bán định
lượng.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Bộ sinh phẩm hoá chất
phát hiện kháng thể kháng Mycoplasma pneumoniae ngưng kết hạt bao gồm:
dung dịch pha loãng mẫu: sử dụng để pha loãng mẫu và hoàn nguyên các hạt có ái
lực và hạt không có ái lực với kháng nguyên; lọ chứa hạt có ái lực (dạng đông khô):
các hạt nhạy cảm với kháng nguyên của mycoplasma pneumoniae; lọ chứa hạt
không có ái lực (dạng đông khô): các hạt không nhạy cảm với kháng nguyên của mycoplasma
pneumoniae; chứng dương (dạng dung dịch): huyết thanh dương tính với kháng
thể kháng mycoplasma pneumoniae; ống nhỏ giọt để lấy sinh phẩm
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70% hoặc dung
dịch khử trùng khác
- Dung dịch rửa tay
- Phiến nhựa có giếng
thực hiện phản ứng
- Đầu côn (tip) 10 µl -
100 µl tiệt trùng
- Tiêu hao vật tư cho
chạy chứng kiểm tra chất lượng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng tay cao su y tế
không bột
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/ kỹ
thuật y
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy li tâm tốc độ
3000-5000 vòng/phút để xử lý mẫu
- Máy lắc/rung phiến nhựa
tự động để tối ưu hóa phản ứng kháng nguyên -kháng thể
- Pipette 10 µl -100 µl
với đầu côn phù hợp để thực hiện xét nghiệm
- Đồng hồ tính phút (đồng
hồ bấm giây)
- Tủ lạnh/ tủ bảo quản
sinh phẩm 2ºC - 8ºC bảo quản sinh phẩm và lưu mẫu
- Nhiệt kế kiểm soát
nhiệt độ tủ lạnh
- Nhiệt ẩm kế kiểm soát
nhiệt độ, độ ẩm môi trường
- Nồi hấp tiệt trùng bằng
hơi nước xử lý mẫu bệnh phẩm sau xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Nhận mẫu theo quy trình
nhận mẫu tại đơn vị.
- Loại mẫu bệnh phẩm:
huyết thanh của người bệnh
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh
phẩm:
+ Mẫu máu chứa trong ống
nghiệm (tube) nhựa 2ml có hạt mịn tách huyết thanh. Thể tích mẫu tối thiểu 1
ml.
+ Mẫu không bị nhiễm bẩn,
vỡ hồng cầu, mỡ máu cao
- Xử lý bệnh phẩm: tham
khảo hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm và quy trình của phòng xét nghiệm.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 180 phút (3
giờ)
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Khoa xét nghiệm vi
sinh/ Phòng xét nghiệm vi sinh.
3. AN TOÀN
- Thực hiện an toàn sinh
học phù hợp tác nhân gây bệnh theo thông tư 41/2016/TT-
BYT
- Sử dụng hoá chất sinh
phẩm an toàn theo khuyến cáo của nhà sản xuất (tham khảo MSDS).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Tiến hành kỹ
thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Hoàn nguyên lọ chứa hạt có ái lực, hạt không
có ái lực bằng dung dịch pha loãng mẫu theo thể tích đã quy định trên nhãn lọ
trước khi thực hiện phản ứng
|
|
2
|
Tiến hành xét nghiệm định tính
|
|
2.1
|
Ghi mã bệnh phẩm vào ô vị trí thực hiện phản
ứng trên phiến nhựa, mỗi xét nghiệm cần 3 giếng.
|
|
2.1
|
Sử dụng pipette hút các thể tích dung dịch
pha loãng mẫu nhỏ vào các giếng theo hướng dẫn của nhà sản xuất
|
|
2.2
|
Thêm thể tích mẫu huyết thanh vào giếng số 1,
trộn đều.
|
|
2.3
|
Hút thể tích huyết thanh đã được pha loãng ở
giếng số 1 thêm vào giếng số 2, trộn đều. Tiếp tục hút thể tích huyết thanh
đã pha loãng ở giếng số 2 thêm vào giếng số 3, trộn đều và hút bỏ thể tích
thừa ở giếng số 3.
|
|
2.4
|
Sử dụng ống nhỏ giọt được cung cấp cùng bộ
hóa chất hút dung dịch hạt không có ái lực nhỏ 1 giọt vào giếng thứ 2 để tạo
giếng chứng âm.
Sử dụng ống nhỏ giọt khác hút dung dịch hạt có
ái lực nhỏ 1 giọt vào giếng thứ 3.
|
|
2.5
|
Hút trộn cho mỗi giếng bằng Pipette với đầu
côn riêng biệt
|
|
2.6
|
Phủ khay giếng phản ứng bằng tấm nhựa và ủ ở khoảng
nhiệt độ và thời gian theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
|
|
3
|
Tiến hành xét nghiệm bán định lượng (khi phản
ứng dương tính)
|
|
3.1
|
Ghi mã bệnh phẩm vào ô vị trí thực hiện phản
ứng trên phiến nhựa. Mỗi xét nghiệm cần 8 giếng hoặc hơn (nếu ở giếng số 8
vẫn có hiện tượng ngưng kết)
|
|
3.2
|
Sử dụng pipette hút các thể tích dung dịch
pha loãng mẫu nhỏ vào các giếng theo hướng dẫn của nhà sản xuất
|
|
3.3
|
Thêm thể tích mẫu huyết thanh vào giếng số 1,
trộn đều.
|
|
3.4
|
Hút thể tích huyết thanh đã được pha loãng ở
giếng số 1 thêm vào giếng số 2, trộn đều. Thực hiện tương tự đến giếng số 8
và hút bỏ thể tích thừa ở giếng số 8.
|
|
3.5
|
Sử dụng ống nhỏ giọt được cung cấp cùng bộ
hóa chất hút dung dịch hạt không có ái lực nhỏ 1 giọt vào giếng thứ 2 để tạo
giếng chứng âm.
Sử dụng ống nhỏ giọt khác hút dung dịch hạt
có ái lực nhỏ 1 giọt vào giếng thứ 8.
|
|
3.6
|
Hút trộn cho mỗi giếng bằng pipette với đầu
côn riêng biệt
|
|
3.7
|
Phủ khay giếng phản ứng bằng tấm nhựa và ủ ở khoảng
nhiệt độ và thời gian theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
|
|
4
|
Thực hiện nội kiểm song song cho mỗi lần xét
nghiệm
|
|
|
Thực hiện 2 giếng chứng kiểm soát:
- Chứng âm: sử dụng dung dịch pha loãng với
hạt không có ái lực
- Chứng dương: thực hiện kỹ thuật với mẫu
chứng dương cung cấp theo bộ sinh phẩm tương tự như mẫu người bệnh
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Đọc kết quả mẫu
chứng
Kết qủa người bệnh được
chấp nhận khi thực hiện phản ứng với mẫu chứng âm và chứng dương đều đạt yêu
cầu:
- Chứng âm: Không có hiện
tượng ngưng kết trên nền giếng phản ứng, nút cô đặc rõ rệt ở tâm giếng với viền
tròn ngoài trơn nhẵn.
- Chứng dương: Có hiện
tượng ngưng kết trên nền giếng phản ứng, các hạt ngưng kết lắng đọng tạo thành
các vòng tròn rộng rõ rệt
4.2.2. Đọc kết quả và
nhận định kết quả
- Không có hiện tượng ngưng kết ở giếng phản ứng
số 3: Không có kháng thể kháng Mycoplasma pneumoniae
- Có hiện tượng ngưng kết
ở giếng số 3 trên nền giếng phản ứng (hạt ngưng kết lắng đọng tạo thành vòng
tròn rộng rõ rệt/ trải rộng bao phủ toàn bộ nền giếng): Có kháng thể kháng
Mycoplasma pneumoniae (nồng độ kháng thể tương ứng với bậc pha loãng ở
giếng có phản ứng ngưng kết xảy ra)
- Hiện tượng ngưng kết
trên nền giếng không rõ ràng ở giếng phản ứng số 3 (hạt ngưng kết lắng đọng tạo
thành vòng tròn nhỏ với viền ngoài vòng tròn trơn nhẵn): thực hiện lại xét
nghiệm bằng phương pháp khác hoặc với một mẫu bệnh phẩm mới.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả bằng bản
điện tử và/hoặc bản giấy theo quy trình trả kết quả và lưu hồ sơ theo quy định
của đơn vị.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT
|
XỬ TRÍ
|
|
Lấy mẫu bệnh phẩm, vận chuyển mẫu bệnh phẩm
và bảo quản mẫu không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù phản
ứng được thực hiện đúng.
|
- Tùy từng trường hợp cụ thể, có thể lấy lại
mẫu bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm nếu cần.
|
|
- Thực hiện sai các bước trong quy trình
hướng dẫn.
- Độ nhạy của kết quả giảm nếu sinh phẩm hóa
chất không được thực hiện ở nhiệt độ quy định
- Sinh phẩm hoá chất bị hư hỏng, hết hạn.
|
- Thực hiện lại xét nghiệm và tuân thủ đúng
các bước theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Đảm bảo độ ổn định hoá chất xét nghiệm theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Khuyến cáo hóa chất được đưa về nhiệt độ phòng
xét nghiệm trước khi sử dụng.
- Thực hiện lại xét nghiệm với hóa chất sinh
phẩm còn hạn sử dụng và đảm bảo chất lượng.
|
|
- Đọc và nhận định kết quả phản ứng sau thời
gian khuyến cáo, kết quả bán định lượng có thể không chính xác
- Phiên giải, báo cáo và trả kết quả có thể
xảy ra nhầm lẫn.
|
- Đọc kết quả trong khoảng thời gian khuyến
cáo của nhà sản xuất sinh phẩm
- Thông báo tới Bác sĩ lâm sàng để trả kết
quả đúng cho người bệnh và phải có hành động phòng ngừa phù hợp
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện đánh giá chất
lượng sinh phẩm hóa chất mới đưa vào sử dụng (xác nhận/thẩm định phương pháp)
theo mục 8.16 của quyết định 2429/QĐ-BYT
năm 2016.
- Thực hiện nội kiểm định
kỳ trên mẫu nội kiểm theo quy định tại mục 8.10 của quyết định 2429/QĐ-BYT.
- Thực hiện ngoại kiểm
theo mục 8.15 của quyết định 2429/QĐ-BYT.
- Để khẳng định kết quả
xét nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần chuyển gửi đến phòng xét nghiệm tương
đương hoặc phòng xét nghiệm tham chiếu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện sự có mặt của
kháng nguyên vi khuẩn Escherichia coli sinh độc tố trong mẫu bệnh phẩm huyết
thanh/huyết tương người bằng kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Kháng nguyên vi khuẩn
Escherichia coli kết hợp với thuốc thử chứa kháng thể kháng Escherichia coli
được gắn với một số chất hóa học tạo thành hỗn hợp thuốc mang phức hợp miễn
dịch. Hỗn hợp này được đưa vào ngăn đếm, tại đây chúng được kích thích phát
sáng bằng điện áp. Sự có mặt của kháng nguyên vi khuẩn Escherichia coli được
đánh giá qua cường độ ánh sáng phát ra.
Định nghĩa
- Calibrators: Mẫu chuẩn.
- Controls: Mẫu chứng
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chuẩn
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Controls
- Calibrators
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Vật tư cần thiết khác
tùy theo từng loại thiết bị và sinh phẩm
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Bơm kim tiêm vô trùng
5-10ml
- Bông tiêm
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Bàn xét nghiệm
- Máy ly tâm
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Hệ thống máy miễn dịch
tự động và máy tính có cài đặt phần mềm
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện.
- Máy lắc trộn Vortex
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 10 µl đến 1000 µl
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh hoặc huyết tương.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 60 phút đến 90
phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bước 1: chuẩn bị
- Kiểm tra số lượng
tests đã được nạp vào máy. Chuẩn bị các hóa chất kèm theo.
- Kiểm tra hiệu chuẩn
máy
- Chạy các chứng chuẩn
- Ly tâm ống máu 3000
vòng/10 phút
Bước 2: chạy mẫu
Chạy mẫu không dùng barcode
- Đánh số sample cup
theo mã số bệnh phẩm.
- Hút huyết thanh/huyết
tương vào cốc đựng mẫu tương ứng.
- Vào màn hình thao tác
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Nhập mã bệnh phẩm,
tên bệnh nhân và ngày thực hiện xét nghiệm.
- Chọn test CAMPYLO.
- Nhập số rack và vị
trí mẫu.
- Đặt mẫu huyết thanh
bệnh nhân cần xét nghiệm (hoặc cốc chứa mẫu bệnh phẩm) lên Rack đúng vị trí đã
order và đưa vào khu nạp giá mẫu.
- Tiếp tục chạy mẫu
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chạy mẫu có dùng barcode
- Nhập chỉ định định
xét nghiệm trên máy tính bằng phần mềm Quản lý thông tin xét nghiệm.
- Đặt ống máu đã được
dán barcode vào rack quy định, quay mặt barcode ra phía ngoài rồi đưa vào khu
nạp giá mẫu.
- Tiếp tục chạy mẫu
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.2. Nhận định kết quả
- Khi đã kết thúc quá
trình thử nghiệm, kết quả được lưu lại vào một tập tin và hiển thị lên màn
hình. Có thể in ra một phần hoặc toàn bộ kết quả.
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm (QC):
- Đánh giá NC và PC: Đánh
giá kết quả theo hướng dẫn theo dõi QC.
4.2.2. Đọc kết quả:
- Đọc kết quả và nhận
định kết quả: Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Sai sót có thể do
lấy, đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định.
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy
lại được bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không
chính xác của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể gặp khi:
- Hóa chất bị hư hỏng,
hết hạn. Tiến hành làm lại xét nghiệm với hóa chất mới đảm bảo chất lượng.
- Trang thiết bị không
được vệ sinh hàng ngày, bảo trì, bảo dưỡng định kỳ.
Xử trí:
- Tuân thủ đúng các
bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất
xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.
- Với mục đích chẩn
đoán, kết quả luôn cần được đánh giá phối hợp tiền sử, lâm sàng và nhiều bằng
chứng khác trên bệnh nhân.
- Kiểm tra, bảo dưỡng,
vệ sinh máy định kỳ và đúng quy trình khi thực hiện xét nghiệm.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất, có hiện tượng phản ứng chéo.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện
kiểm tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện kháng nguyên
và định lượng kháng nguyên HBeAg của virus viêm gan B (HBV) trong huyết thanh
(huyết tương) người.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Dựa trên nguyên lý của
kỹ thuật CLIA- miễn dịch hóa phát quang.
Định nghĩa
- RLU: Relative Light
Unit- đơn vị ánh sáng tương đối
- CLIA:
Chemiluminescent Immuno Assay- kỹ thuật hóa phát quang
- HBeAg: Kháng nguyên
HBeAg của virus viêm gan B
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm xét nghiệm
phát hiện và định lượng HBeAg bằng kỹ thuật CLIA
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Dung dịch rửa dùng
cho phản ứng
- Dung dịch chứa hóa
chất phát quang, hóa chất huỳnh quang
- Dung dịch rửa kim đo
và/hoặc các kim hút khác (kim hút mẫu, kim hút hóa chất…)
- Dung dịch rửa máy
- Tube đựng bệnh phẩm
- Pipet hút bệnh phẩm
- Đầu côn sử dụng cho
máy và hoặc cup sử dụng cho máy
- Túi/hộp/khay đựng rác
thải cho máy
- Cup hút mẫu sử dụng
cho máy
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Panh
- Dây garo
- Bông
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Dàn máy miễn dịch tự
động.
- Máy ly tâm thường
- Tủ âm sâu (-20ºC)
(nếu có).
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Micropipette vi lượng
100, 1000 µl.
- Giá đựng ống máu
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh hoặc huyết tương người
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
- Từ chối mẫu trong
trường hợp mẫu không đủ tiêu chuẩn quy định
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh. Yêu cầu tối thiểu phù hợp loại kỹ thuật xét nghiệm: phòng ATSH cấp độ 2.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
Kỹ thuật thực hiện theo
hướng dẫn sử dụng máy miễn dịch tự động của từng nhà sản xuất và quy trình chạy
mẫu của từng PXN.
|
Các bước
|
Xét nghiệm định lượng
Alinity i HBeAg
|
|
1
|
Vào Reagent để kiểm tra số lượng tests đã
được nạp vào máy, ước lượng xem số test đó đã đủ dùng chưa. Nạp thêm thuốc
thử để cho đủ số lượng chạy trong ngày.
Chuẩn bị thuốc thử trước khi đưa vào theo
hướng dẫn của nhà sản xuất
|
|
2
|
Vào Reagent để kiểm tra xem có cần chạy hiệu
chuẩn không. Những trường hợp sau cần phải chạy chuẩn:
+ Nếu tại vị trí có ô HBeAg hiển thị dòng chữ
no cal có nghĩa đó là lô thuốc thử mới cần phải hiệu chuẩn.
+ Khi cần thiết như khi chạy chứng HBeAg thấy
kết quả vượt ra ngoài dải giới hạn cho phép.
|
|
3
|
Sau khi kiểm tra và hoàn tất các bước trên
thì tiến hành chạy chứng HBeAg control bao gồm 2 mức: HBeAg control L và
HBeAg control M và HBeAg control H
Đánh giá kết quả QC đạt, tiến hành chạy mẫu
bệnh phẩm
|
|
5
|
Chạy mẫu theo các bước sau:
|
|
6
|
Chuẩn bị bệnh phẩm: Ly tâm máu bệnh nhân 3000
vòng trong 10 phút.
|
|
Nếu chạy mẫu không dùng barcode thì
tuân theo các bước từ 7-11:
|
|
7
|
Đánh số sample cup theo mã số bệnh phẩm. Hút
200 μl huyết thanh/huyết tương vào sample cup tương ứng.
|
|
8
|
Vào màn hình ORDERS →CREATE ORDERS →
SINGLE SPECIMEN.
|
|
9
|
Nhập
+ R/P: vị trí mẫu trên khay
+ SID: mã số bệnh nhân
- Chọn xét nghiệm / panel là HBeAg Quant
- Nhấn ADD ORDER.
|
|
10
|
Đưa khay mẫu vào khu nạp giá mẫu ở vị trí
chạy mẫu bệnh nhân thường quy.
|
|
11
|
- Chuyển máy sang chế độ RUNNING nếu
máy đang ở IDLE.
|
|
Nếu chạy mẫu có barcode thì tuân theo
các bước từ 12-14:
|
|
12
|
Nhập chỉ định định xét nghiệm trên máy tính
bằng phần mềm Quản lý thông tin xét nghiệm
|
|
13
|
Đặt ống máu đã được dán barcode vào rack màu
trắng, quay mặt barcode ra phía ngoài rồi đưa vào khu nạp giá mẫu
|
|
14
|
Nhấn RUN (F8)
|
4.2. Nhận định kết quả
Nhận định kết quả dựa
trên đánh giá tiêu chuẩn của nhà sản xuất, tiêu chuẩn quản lý chất lượng của
từng PXN và hướng dẫn cách biện luận kết quả của nhà sản xuất và các hướng dẫn
chẩn đoán, điều trị liên quan của Bộ Y tế.
Nhận định kết quả xét
nghiệm HBeAg bằng bộ sinh phẩm Alinity i HBeAg
- Đánh giá theo tiêu
chuẩn nhà sản xuất
+ Chạy kiểm tra chứng
HBeAg control L, HBeAg control M, HBeAg control H trên tất cả các điện cực dùng
để chạy xét nghiệm.
+ Giá trị chứng đạt
được phải nằm trong khoảng giới hạn xác định của nhà sản xuất.
- Đánh giá theo tiêu
chuẩn phòng xét nghiệm
+ Chứng nội kiểm, ngoại
kiểm(nếu có) đạt theo yêu cầu quản lý chất lượng của phòng xét nghiệm.
- Kết quả và báo cáo
+ Máy sẽ tự động tính
toán giá trị định lượng HBeAg dựa vào tín hiệu RLU của mẫu, đường cal để xác
định nồng độ HBeAg trong mẫu theo đơn vị PEI U/mL (IU/mL).
+ Khoảng đo của xét nghiệm
Alinity i HBeAg là từ 0.59 đến 700.00 PEI U/mL (IU/mL).
Kết quả được diễn giải
như sau:
+ Nếu nồng độ đo của
mẫu < 0.59 PEI U/mL : mẫu nên được chạy lại với xét nghiệm HBeAg định tính
và biện luận kết quả theo xét nghiệm định tính HBeAg.
+ Nếu COI ≥ 0.59 PEI U/mL
và ≤ 700.00 PEI U/mL: trả kết quả theo nồng độ đã được đo trên máy VD: nồng độ
HBeAg là 550 PEI U/mL hoặc 550 IU/mL
+ Nếu nồng độ đo của
mẫu > 700.00 PEI U/mL cần tiến hành pha loãng mẫu tự động hoặc bằng tay bằng
với dung dịch pha loãng Alinity i Multi-Assay Manual Diluent. Pha loãng tự
động, máy tự động tính toán theo tỷ lệ pha loãng. Pha loãng bằng tay người vận
hành phải nhập hệ số pha loãng vào màn hình đặt lệnh (Create Order) Mẫu bệnh
phẩm (Specimens) hay Mẫu chứng (Control). Hệ thống sẽ sử dụng hệ số pha loãng này
để tự động tính nồng độ mẫu và báo cáo kết quả.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
- Sử dụng các ống mẫu
không đúng theo yêu cầu của nhà sản xuất (VD các ống mẫu không phù hợp kích
thước chạy máy, các ống mẫu chứa chất chống đông không có trong khuyến cáo của
nhà sản xuất)
- Xử trí: Thực hành theo
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu hoặc quy trình lấy mẫu của PXN
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Sử dụng thuốc thử đã
quá hạn sử dụng bao gồm hạn sử dụng ghi trên bao bì và hạn sử dụng sau khi mở
nắp.
- Các thao tác chuẩn bị
hóa chất chưa đúng làm tạo bọt ở lọ thuốc thử và các loại mẫu (bệnh phẩm,chất
chuẩn và chứng).
- Bảo quản hóa chất và
vật tư không đúng điều kiện yêu cầu của nhà sản xuất
- Tần suất thực hiện nội
kiểm không đúng theo khuyến cáo nhà sản xuất hoặc không thực hiện nội kiểm
- Bỏ sót các lưu ý,
khuyến cáo trong sử dụng máy, hóa chất sinh phẩm của nhà sản xuất
- Xử trí: đọc kỹ và tuân
thủ hướng dẫn, lưu ý, khuyến cáo của nhà sản xuất
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt.
- Khi kết quả nội kiểm
không đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp xét nghiệm
sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm tra
chất lượng (IQC và/hoặc EQA theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Đối với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện định tính,
bán định lượng kháng thể kháng HIV-1 và/hoặc HIV-2 trong huyết thanh hoặc huyết
tương người bằng kỹ thuật kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Nguyên lý của kỹ thuật
kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng. Kháng thể kháng HIV-1 và/hoặc HIV-2 nếu có
trong mẫu bệnh phẩm sẽ kết hợp với kháng nguyên tái tổ hợp HIV-1 (HIV-1/gp41 và
HIV-1/p24) và HIV-2 (HIV-2/gp36) được gắn trên hạt gelatin tạo hiện tượng ngưng
kết.
Định nghĩa: HIV: Human
Immunodeficiency Virus: Virus gây suy giảm miễn dịch ở người.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Bộ sinh phẩm Serodia
HIV 1/2 Mix (VD hoặc tương đương)
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Nước cất
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn 1000 µL tiệt
trùng
- Đầu côn 1-200 µL tiệt
trùng
- Đầu côn 1-20 µL tiệt
trùng
- Phiến nhựa đáy chữ U
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Bơm kim tiêm vô trùng
- Bông vô trùng
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy ly tâm thường
- Máy ủ
- Bộ lưu điện
- Máy lắc tròn
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu - 20ºC
- Tủ lạnh âm sâu - 70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bộ pipetman 8 kênh
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh hoặc huyết tương.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 240 phút (4
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Ví dụ: Bộ sinh phẩm
Serodia HIV 1/2 Mix (VD hoặc tương đương
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
Xét nghiệm định tính HIV
|
|
1
|
Để sinh phẩm cần dùng ở nhiệt độ phòng 30
phút trước khi làm xét nghiệm
|
|
2
|
Hồi chỉnh thuốc thử
Cho 0,6ml dung dịch ở lọ A vào lọ có gắn
kháng nguyên HIV ( Lọ C)
Cho 1ml dung dịch ở lọ A vào lọ không gắn
kháng nguyên HIV ( Lọ D)
Trộn đều bằng cách lắc nhẹ và xoay ngược
chiều trước khi sử dụng.
|
|
3
|
Đánh số (dán)code, sắp xếp bệnh phẩm và viết
sơ đồ theo thứ tự.
|
|
4
|
Chuẩn bị phiến nhựa và đánh số phiến
|
|
5
|
Nhỏ 75μl dung dịch pha loãng mẫu vào giếng số
1 và 25μl dung dịch này vào các giếng số 2 và số 3.
Đối với chứng dương cho tiếp 25μl dung dịch
pha loãng vào giếng 4 và 5.
Đối với xét nghiệm chất thử chứng, cho 25μl
dung dịch pha loãng vào giếng số 1 và 2
|
|
6
|
Nhỏ 25μl bệnh phẩm huyết thanh vào giếng số
1. Trộn đều bằng cách hút nhỏ lên xuống từ 5-6 lần. Hút chuyển 25μl dung dịch
đã pha loãng từ giếng 1 sang giếng 2. Trộn chất thử của giếng 2 theo cách như
mô tả ở trên và chuyển 25μl vào giếng số 3. Làm quy trình giống như trên,
trộn chất thử của giếng 3 và loại bỏ 25μl dung dịch sau khi trộn.
Đối với chứng dương, tiến hành tương tự cho
tới giếng thứ 5
Không cho huyết thanh vào giếng đối với xét
nghiệm chất thử chứng
|
|
7
|
Sử dụng ống nhỏ giọt màu đỏ, nhỏ 25μl (1
giọt) dung dịch treo có hạt không gắn KN (hạt chứng) vào giếng số 2. Dùng ống
nhỏ giọt xanh nhỏ 25μl (1 giọt) dung dịch treo có hạt gắn KN (hạt nhạy)vào
giếng 3.
Đối với chứng dương, nhỏ 25μl (1 giọt) dung
dịch treo có hạt không gắn KN vào giếng số 2 và 25μl (1 giọt) dung dịch treo
có hạt gắn KN vào giếng 3, 4, 5.
Đối với xét nghiệm chứng thử, nhỏ 25μl (1
giọt) dung dịch treo có hạt không gắn KN vào giếng số 1 và nhỏ 25μl (1 giọt)
dung dịch treo có hạt gắn KN vào giếng 2
|
|
8
|
Lắc đều các thành phần trong giếng (bằng máy
lắc rung tự động) hoặc bằng cách dùng ngón tay gõ vào 4 góc phiến nhựa từ 5-6
lần.
|
|
9
|
Đậy phiến nhựa lại và đặt lên 1 bề mặt không
rung ở nhiệt độ phòng (15-30ºC) trong thời gian 2 giờ và đọc kết quả.
Trường hợp đọc kết quả có ngưng kết ở cả
giếng nhỏ dung dịch treo có hạt gắn và không gắn KN, thực hiện phản ứng hấp
phụ theo các bước tiến hành phản ứng hấp phụ
|
|
Phản ứng hấp phụ
|
|
10
|
Cho 0.35ml dung dịch treo không gắn KN (các
hạt chứng) đã hồi chỉnh vào ống xét nghiệm nhỏ.
|
|
11
|
Cho tiếp 50μl huyết thanh vào ống và trộn
thật đều bằng máy trộn quay tròn. Ủ ở nhiệt độ phòng (15-30ºC) ít nhất là 20
phút.
|
|
12
|
Ly tâm trong vòng 5 phút với tốc độ 200 vòng/
phút. Sau đó hút ra 50μl phần nổi (pha loãng mẫu huyết thanh đã hấp thụ ở
1:8) và nhỏ vào giếng số 2.
|
|
13
|
Sau đó hút 25μl mẫu phẩm đã hấp thụ từ giếng
2 nhỏ vào giếng 3 và trộn đều theo hướng dẫn cho xét nghiệm định tính.
|
|
14
|
Tiếp tục thực hiện như các bước 7; 8 và 9.
|
Bảng 1: Xét nghiệm định tính.
Bảng 2: Xét nghiệm đối với chứng dương
Bảng 3 - Phương pháp thực hiện xét nghiệm chất
thử chứng.
|
Giếng số….
|
1
|
2
|
|
Dung môi pha loãng mẫu (μl)
|
25
|
25
|
|
Các hạt chứng (μl)
|
25
|
|
|
Các hạt gắn nhạy (μl)
|
|
25
|
|
Trộn bằng máy trộn
khay (máy lắc rung tự động), đậy khay lại và ủ trong vòng 2 giờ
|
|
Giải thích kết quả
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm
Chỉ đọc kết quả khi QC
đạt yêu cầu.
4.2.2. Đọc và nhận định
kết quả
Đọc và nhận định độ ngưng kết:
Độ ngưng kết có thể đọc
bằng mắt thường hoặc bằng cách cẩn thận đặt khay lên máy đọc khay phù hợp,
tránh ánh sáng trực tiếp và so sánh với phần ngưng kết của chất thử chứng.
Bảng 4: Đọc và nhận
định kết quả.
|
Hình thành các mô
hình hạt
|
Đọc
|
Nhận định
|
|
Các hạt tập trung lại với nhau thành hình nút
ở giữa giếng và có 1 đường viền mỏng nhẹ ở xung quanh
|
(-)
|
Âm tính
|
|
Các hạt tập trung lại với nhau thành hình
nhẫn kết đặc và có 1 đường viền mỏng nhẹ ở xung quanh
|
(±)
|
Không xác định (xem
ghi chú ở dưới)
|
|
Các hạt tạo thành hình nhẫn lớn có đường viền
cứng nhiều hình dạng xung quanh. Phần kết dính xuất hiện ở ngoại vi.
|
(+)
|
Dương tính
|
|
Các hạt kết dính bám chặt và trải rộng lên
toàn bộ các đáy giếng
|
(++)
|
Dương tính
|
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Có thể xảy ra hiện
tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:
- Thực hiện sai các bước
trong quy trình hướng dẫn.
- Chứng âm và những mẫu
bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/ huyết tương có nồng độ kháng
thể cao.
Xử trí: Tuân thủ đúng
các bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa
chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng..
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất (Ví dụ: hemoglobin, lipid máu, bilirubin máu, một số loại thuốc…) hoặc có
phản ứng chéo.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện
kiểm tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện
ngoại kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định số lượng trứng
giun sán trong phân bằng kỹ thuật Xét nghiệm phân bằng phương pháp Kato - Katz.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Trứng giun sán được tập
trung bằng phương pháp làm dầy tiêu bản phân với giấy Cellophan và soi đếm trên
kính hiển vi không dầu. Từ đó tính ra số lượng trứng giun sán trong 1 gram phân.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Giấy Cellophan
- Dung dịch xanh
malachit 3%
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm
- Lam kính
- Que xét nghiệm
- Lưới lọc
- Miếng bìa hình chữ
nhật kích thước 30x40 x1,37mm, ở giữa có lỗ trong 6mm
- Giấy lọc
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Nút cao su
- Kẹp
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Kính hiển vi quang
học
- Tủ ấm 35⁰C - 37⁰C
- Hệ thống quản lý
phòng xét nghiệm
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: phân
được lấy vào lọ đựng mẫu sạch, nắp kín, được dán nhãn ghi đầy đủ thông tin theo
quy định.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định, đúng với các thông tin dán
trên lọ đựng mẫu bệnh phẩm.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 120 phút (2
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
- Lấy mẫu phân xét
nghiệm đặt trên giấy lọc. Đậy miếng lưới lọc lên mẫu phân, dùng que ép miệng
lưới lọc để phân lọt qua lưới lọc.
- Miếng bìa hình chữ
nhật được đặt trên phiến kính có nhãn.
- Dùng que gạt phần
phân đã lọc lưới đưa sang lỗ của miếng bìa hình chữ nhật sao cho phân đầy lỗ.
- Nhấc nhẹ miếng bìa ra
khỏi phiến kính như vậy còn lại khối phân trên phiến kính.
- Đậy miếng giấy
Cellophan đã nhuộm màu lên mẫu phân.
- Dùng một nút cao su
ép nhẹ lên mặt giấy để dàn phân đều, sao cho mặt giấy tương đối phẳng nhẵn.
- Để tiêu bản trong
phòng thí nghiệm 30 phút hoặc trong tủ ấm 370C trong 15-20 phút.
- Sau đó đem soi dưới
kính hiển vi.
4.2. Nhận định kết quả
- Dương tính: thấy hình
ảnh trứng giun sán (mẫu phân trong, trứng giun gián không bị trong sẽ thấy rõ
trên nền xanh).
o Tính số lượng trứng
trong 1 gam phân: biết rằng số lượng phân chứa trong lỗ tròn tương đương
43.7mg. Như vậy số trứng trong 1 gam phân chính là số trứng đếm được trên tiêu
bản nhân 23.
o Đánh giá cường độ nhiễm
giun đũa, giun tóc, giun móc/mỏ theo số lượng giun ký sinh và số trứng tính
được trong 1 gam phân theo qui ước của Tổ chức Y tế Thế giới.
- Âm tính: không thấy
trứng giun sán
4.3. Trả kết quả và lưu hồ sơ
- Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Sai sót có thể do
lấy, đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định.
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm.
- Trong trường hợp
không thể lấy lại được bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về
tính không chính xác của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất
lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Cho giấy Cellophan
ngâm vào dung dịch nhuộm trên 24 giờ trước khi dùng, không nên nhúng sẵn trước
thời gian sử dụng quá lâu.
- Soi lam kính theo
hình zíc zắc, tránh bỏ sót vi trường.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện
kiểm tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện trứng giun
sán (giun đũa, giun móc/mỏ, giun tóc) trong bệnh phẩm phân bằng phương pháp
Kato.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Trứng giun sán được tập
trung bằng phương pháp làm dầy tiêu bản phân với giấy Cellophan và soi đếm trên
kính hiển vi không dầu.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Giấy cellophan
- Dung dịch xanh
malachit 3%
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm
- Lam kính
- Que xét nghiệm
- Lưới lọc
- Miếng bìa hình chữ
nhật kích thước 30x40 x1,37mm, ở giữa có lỗ trong 6mm
- Giấy lọc
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Nút cao su
- Kẹp
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Kính hiển vi quang
học
- Tủ ấm 35 - 37⁰C
- Hệ thống quản lý
phòng xét nghiệm
- Tủ lạnh 2 - 8⁰C
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: phân
được lấy vào lọ đựng mẫu sạch, nắp kín, được dán nhãn ghi đầy đủ thông tin theo
quy định.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định, đúng với các thông tin dán
trên lọ đựng mẫu bệnh phẩm.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 90 phút (1,5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
- Lấy một lượng phân khoảng
50-60mg (khoảng bằng hạt ngô) đặt lên lam kính đã có nhãn ghi tên, tuổi bệnh
nhân.
- Đậy miếng giấy
Cellophan đã nhuộm màu lên mẫu phân.
- Dùng một nút cao su
ép nhẹ lên mặt giấy để dàn phân đều, sao cho mặt giấy tương đối phẳng nhẵn.
- Để tiêu bản trong
phòng thí nghiệm 30 phút hoặc trong tủ ấm 370C trong 15-20 phút.
- Sau đó đem soi dưới
kính hiển vi (vật kính 10X-40X)
4.2. Nhận định kết quả
- Dương tính: thấy hình
ảnh trứng giun sán (mẫu phân trong, trứng giun gián không bị trong sẽ thấy rõ
trên nền xanh). Đánh giá sơ bộ mức độ nhiễm giun sán dựa vào mật độ của trứng
giun sán trong toàn bộ vi trường theo 4 nhóm sau:
|
+
|
Từ 1-9 trứng
|
: +
|
|
+
|
Từ 10-99 trứng
|
: ++
|
|
+
|
Từ 100-999 trứng
|
: +++
|
|
+
|
Trên 1000 trứng
|
: ++++
|
- Âm tính: không thấy
trứng giun sán
4.3. Trả kết quả và lưu hồ sơ
- Trả kết quả theo quy
trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét
nghiệm.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Sai sót có thể do
lấy, đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định.
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm.
- Trong trường hợp
không thể lấy lại được bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về
tính không chính xác của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất
lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
- Cho giấy Cellophan
ngâm vào dung dịch nhuộm trên 24 giờ trước khi dùng, không nên nhúng sẵn trước
thời gian sử dụng quá lâu.
- Soi lam kính theo
hình zíc zắc, tránh bỏ sót vi trường.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện
kiểm tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét
nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi
đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng
để khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định sự có mặt và
đo lượng đồng phân glycosyl hóa của Mac-2 binding protein (M2BPGi) trong huyết
thanh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đo lượng đồng phân
glycosyl hóa của Mac-2 binding protein dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn
dịch enzyme hóa phát quang với cơ chất hóa phát quang CDP-Star™
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Khấu hao sinh phẩm cho
chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Dung dịch xà phòng rửa
tay
- Môi trường vận chuyển
mẫu
- Đầu côn 10 µl có lọc
- Đầu côn 30 µl
- Đầu côn 200 µl có lọc
- Đầu côn 1 ml có lọc
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Bông tiêm
- Bơm tiêm vô trùng
- Panh
- Giấy thấm không bụi
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay không bột
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Hệ thống máy xét nghiệm
miễn dịch tự động (VD hoặc hệ thống tương đương)
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ âm sâu (-20 ºC hoặc
-70 ºC)
- Micropipette
- Bàn xét nghiệm
- Máy vi tính
- Máy in
- Máy in mã vạch
- Phần mềm quản lý xét
nghiệm
- Máy hút ẩm
- Bồn rửa mắt và tắm khẩn
cấp
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 120 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Vi
sinh
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Nhỏ 10 µL mẫu và 50 µL thuốc thử vào cóng
phản ứng, sau đó ủ 2 phút ở 42°C.
|
|
2
|
Nhỏ 30 µL thuốc thử R2 vào cóng phản ứng, ủ
trong 1 phút ở 42°C và tách riêng phần hạt từ (cho nam châm tiếp xúc với cóng
phản ứng, và hút phần chất lỏng).
|
|
3
|
Nhỏ tiếp 100-700 µL dung dịch rửa, sau đó
tách riêng phần hạt từ. Lặp lại quy trình này 3 lần.
|
|
4
|
Nhỏ 100 µL thuốc thử R3 vào cóng phản ứng, ủ
trong 2.5 phút ở 42°C, sau đó tách riêng phần hạt từ (cho nam châm tiếp xúc
với cóng phản ứng, và hút phần chất lỏng).
|
|
5
|
Nhỏ tiếp 100-700 µL dung dịch rửa, sau đó
tách riêng phần hạt từ. Lặp lại quy trình này 3 lần.
|
|
6
|
Nhỏ thêm 50 µL thuốc thử R4 vào trộn đều, cho
100 µL thuốc thử R5 vào trộn đều, ủ trong 5 phút ở 42°C, sau đó đo cường độ
ánh sáng.
|
|
7
|
Thiết lập giá trị cut-off:
• Nhẹ nhàng trộn M2BPGi NC và M2BPGi PC tránh
tạo bọt. Đặt chúng vào vị trí trên máy xét nghiệm theo tài liệu hướng dẫn sử
dụng.
• Thực hiện quy trình theo “quy trình xét nghiệm
chuẩn” và đo cường độ ánh sáng.
• Thiết lập giá trị cut-off dựa vào cường độ
ánh sáng của M2BPGi PC: Giá trị cut-off = (P) với P là cường độ ánh sáng của
M2BPGi PC.
|
4.2. Nhận định kết quả
Đo mẫu, kiểm soát chất
lượng
- Đặt mẫu vào vị trí theo
tài liệu hướng dẫn sử dụng máy xét nghiệm.
- Tiến hành theo “quy
trình xét nghiệm chuẩn” và đo cường độ ánh sáng.
- Tính toán Chỉ số
cut-off (C.O.I.) của mẫu.
* Chỉ số cut-off
(C.O.I) = (S-N)/(C-N)
Với: + S là cường độ
ánh sáng trong mẫu
+ C là giá trị cut-off
+ N là cường độ ánh
sáng trong M2BPGi NC.
* Máy xét nghiệm sẽ tự
động thực hiện quy trình này.
- Mẫu được đánh giá như
sau:
+ Dương tính (1+) khi
cường độ ánh sáng cao hơn giá trị cut-off (1.00 ≤ C.O.I. < 3.00);
+ Dương tính (2+) khi
cường độ ánh sáng cao hơn giá trị cut-off (C.O.I. ≥ 3.00);
+ Âm tính (-) khi cường
độ ánh sáng thấp hơn giá trị cut-off (C.O.I. < 1.00).
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Thu thập mẫu, xử lý và
lưu trữ huyết thanh người:
- Nếu phải lưu trữ mẫu,
nên cấp đông ở -20°C hoặc thấp hơn. Không lặp lại việc đông và rã đông mẫu bởi
có khả năng hình thành hạt nhỏ và cho kết quả không chính xác.
- Mẫu có chứa cục đông
Fibrin nên ly tâm ở 2,000xg trong 10 phút để loại bỏ đi những chất không tan.
- Tách huyết thanh không
để tán huyết.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện chương trình
ngoại kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định các tác nhân
vi sinh vật gây nhiễm khuẩn hô hấp như vi rút Cúm A, Cúm B, virus hợp bào đường
hô hấp RSV, SARS CoV 2… trong bệnh phẩm dịch đường hô hấp.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Dựa trên nguyên lý bắt
cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể của kỹ thuật sắc ký miễn dịch.
- Bệnh phẩm hô hấp được
hòa tan vào dung dịch để giải phóng kháng nguyên vi sinh vật. Kháng nguyên vi
sinh vật (nếu có) sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng đặc hiệu gắn trên màng
nitrocellulose và kết hợp với cộng hợp vàng tạo phức hợp kháng nguyên - kháng
thể. Phức hợp hiển thị bằng vạch màu đặc trưng trên vùng tương ứng của dải
giấy.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Bộ sinh phẩm hóa chất
thử nghiệm miễn dịch sắc ký
- Sinh phẩm phát hiện các
tác nhân hô hấp bao gồm: Khay thử nghiệm được bảo quản trong túi kín, có gói
chất chống ẩm, Dung dịch hòa tan mẫu chứa trong các ống được phân phối với thể
tích nhất định và có kèm nắp đậy nhỏ giọt, Mẫu chứng âm, chứng dương
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70% hoặc dung dịch
khử trùng khác
- Dung dịch nước rửa tay
- Đầu côn (tip) 10 µl -
100µl
- Giá để ống
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng tay cao su y tế không
bột
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/ kỹ
thuật y (3 bộ/ người/ năm)
- Áo choàng phòng xét
nghiệm (2 cái/ người/ năm)
- Khăn lau tay
- Tủ an toàn sinh học để
thực hiện kỹ thuật
- Đồng hồ tính phút (đồng
hồ bấm giây)
- Nhiệt ẩm kế kiểm soát
nhiệt độ, độ ẩm môi trường
- Nồi hấp tiệt trùng bằng
hơi nước xử lý mẫu bệnh phẩm sau xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Nhận mẫu và xử lý mẫu
theo quy định tại đơn vị
- Loại mẫu bệnh phẩm:
Dịch hô hấp trên
- Tiêu chuẩn :
+ Dịch rửa tỵ hầu hoặc tăm
bông dịch tỵ hầu được lấy và bảo quản trong ống vô trùng/ bao gói theo hướng
dẫn lấy mẫu bệnh phẩm của từng đơn vị.
+ Vận chuyển mẫu đến khoa
xét nghiệm càng sớm càng tốt và không quá 2 giờ từ thời điểm lấy mẫu.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định.
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 30 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Khoa xét nghiệm vi sinh/
phòng xét nghiệm vi sinh.
3. AN TOÀN
- Thực hiện an toàn sinh
học phù hợp tác nhân gây bệnh theo thông tư 41/2016/TT-
BYT
- Sử dụng hoá chất sinh
phẩm an toàn theo khuyến cáo của nhà sản xuất (tham khảo MSDS).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Tiến hành kỹ
thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Mở nắp của ống chứa dung dịch pha loãng mẫu,
đặt ống lên giá đựng ống.
|
|
2
|
Nhúng đầu que tăm bông chứa bệnh phẩm vào ống
dung dịch pha loãng mẫu, xoay tăm bông vài lần để mẫu được hòa tan trong dung
dịch, sau đó lấy tăm bông ra khỏi ống dung dịch.
Hoặc sử dụng pippet vô trùng hút một lượng
thể tích dịch rửa tỵ hầu vào ống chứa dung dịch pha loãng mẫu theo tỉ lệ quy
định của nhà sản xuất
|
|
3
|
Lấy khay thử nghiệm ra khỏi túi bảo quản và
ghi thông tin mẫu lên phần quy định của khay thử
|
|
4
|
Đóng nắp ống dung dịch mẫu và nhỏ lượng thể
tích vào vị trí quy định cho mẫu trên khay thử theo hướng dẫn của nhà sản
xuất
|
|
6
|
Đọc kết quả xét nghiệm trong khoảng thời gian
quy định của nhà sản xuất.
|
|
7
|
Lưu mẫu theo quy trình lưu, hủy mẫu sau xét
nghiệm của đơn vị
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Đọc kết quả mẫu
chứng
Kết qủa của người bệnh
được chấp nhận khi thực hiện kỹ thuật với mẫu chứng âm và chứng dương đều đạt
yêu cầu:
- Chứng âm: chỉ có vạch
xuất hiện tại vị trí C trên khay thử.
- Chứng dương: có vạch
xuất hiện tại vị trí C và T trên khay thử.
4.2.2 Đọc kết quả và
nhận định kết quả
- Chỉ có vạch xuất hiện
tại vị trí C trên khay thử: Không có tác nhân vi sinh vật (tên loại vi sinh vật
của khay thử).
- Có vạch xuất hiện tại
vị trí C và vạch tại vùng thử có kí hiệu tương ứng với từng loại vi sinh vật
T1, T2 hoặc T3 trên khay thử: có tác nhân vi sinh vật (loại vi sinh vật tương
ứng vạch trên khay thử).
- Không có vạch phản ứng
xuất hiện tại các vị trí C và T của khay thử: xét nghiệm không có giá trị, tiến
hành thực hiện lại với khay thử khác.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
Trả kết quả bằng bản
điện tử và/hoặc bản giấy theo quy trình trả kết quả và lưu hồ sơ của đơn vị.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT
|
XỬ TRÍ
|
|
Lấy mẫu bệnh phẩm, vận chuyển mẫu bệnh phẩm
và bảo quản mẫu không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù phản
ứng được thực hiện đúng.
|
- Tùy từng trường hợp cụ thể, có thể lấy lại
mẫu bệnh phẩm để thực hiện lại xét nghiệm nếu cần.
|
|
- Thực hiện sai các bước trong quy trình
hướng dẫn.
- Độ nhạy của kết quả giảm nếu sinh phẩm hóa
chất không được thực hiện ở nhiệt độ quy định
- Sinh phẩm hoá chất bị hư hỏng, hết hạn.
|
- Thực hiện lại xét nghiệm và tuân thủ đúng
các bước theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Đảm bảo độ ổn định hoá chất xét nghiệm theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Khuyến cáo hóa chất được đưa về nhiệt độ phòng
xét nghiệm trước khi sử dụng.
- Thực hiện lại xét nghiệm với hóa chất sinh
phẩm còn hạn sử dụng và đảm bảo chất lượng.
|
|
- Phiên giải, báo cáo và trả kết quả có thể
xảy ra nhầm lẫn.
|
- Thông báo tới Bác sĩ lâm sàng để trả kết
quả đúng cho người bệnh và phải có hành động phòng ngừa phù hợp
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện đánh giá chất
lượng sinh phẩm hóa chất mới đưa vào sử dụng (xác nhận/thẩm định phương pháp)
theo mục 8.16 của quyết định 2429/QĐ-BYT
năm 2016.
- Thực hiện nội kiểm định
kỳ trên mẫu nội kiểm theo quy định tại mục 8.10 của quyết định 2429/QĐ-BYT.
- Thực hiện ngoại kiểm
theo mục 8.15 của quyết định 2429/QĐ-BYT.
- Để khẳng định kết quả
xét nghiệm bất thường hoặc nghi ngờ, cần chuyển gửi đến phòng xét nghiệm tương
đương hoặc phòng xét nghiệm tham chiếu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định định tính
virus và vi khuẩn (chẩn đoán in vitro) gây bệnh đường hô hấp bằng công nghệ
khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Thiết bị xét nghiệm
sinh học phân tử tự động sử dụng công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt
để phát hiện định tính axít nucleic của virus SARS-CoV-2, virus Cúm A, Cúm B,
RSV hoặc Streptococcus nhóm A qua việc sử dụng cartridge riêng biệt. Thay vì sử
dụng luân nhiệt, công nghệ này sử dụng enzyme để nhanh chóng thúc đẩy quá trình
khuếch đại.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ vi sinh hoặc
bác sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm
cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Tăm bông vô trùng/dụng
cụ lấy bệnh phẩm
- Môi trường bảo quản
bệnh phẩm
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng tay không bột
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Tủ an toàn sinh học
cấp II
- Hệ thống máy PCR tự
động và máy tính có cài đặt phần mềm chức năng:
- Bộ lưu điện
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ lạnh 2 ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
- Máy vi tính
- Máy in
- Máy in mã vạch
- Phần mềm quản lý xét
nghiệm
- Máy hút ẩm
- Bồn rửa mắt và tắm
khẩn cấp
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
* Loại bệnh phẩm:
- Với bệnh phẩm Cúm
A&B: Tăm bông lấy dịch mũi/mũi họng
- Với bệnh phẩm RSV: Tăm
bông lấy dịch mũi họng
- Với bệnh phẩm
Covid-19: Tăm bông lấy dịch mũi/mũi họng
- Với bệnh phẩm Strep
A: Tăm bông lấy dịch họng
* Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 120 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đảm bảo các mẫu, thiết
bị xét nghiệm ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra xem có thể
nhìn thấy viên thuốc thử ở đáy của mỗi ống phản ứng hay không trước khi đưa
Test Base vào Thiết bị ID NOW. Không sử dụng Test Base nếu không nhìn thấy viên
ở đáy mỗi ống phản ứng.
Bước 1: Bật máy ID Now - bấm nút
nguồn ở bên cạnh
Nhập mã người dùng
Chọn “Run Test”
Chọn loại xét nghiệm
phù hợp: Cúm A/B, RSV, SAR-CoV-2, Strep A
Chọn loại mẫu (nếu yêu
cầu)
Nhập mã bệnh nhân
Bước 2: Mở nắp và đưa Đế xét
nghiệm vào vị trí. Xác nhận xét nghiệm đúng loại được hiển thị trên màn hình
Bước 3: Đưa bộ nhận mẫu vào vị
trí. Đợi làm nóng.
Bước 4: Lấy mẫu và đưa mẫu vào
bộ nhận mẫu. Trộn mẫu.
Bước 5: Đưa cartridge chuyển
vào bộ nhận mẫu. Sau đó đưa cartridge chuyển vào đế xét nghiệm
Bước 6: Đóng nắp thiết bị để
bắt đầu thực hiện xét nghiệm. Kết quả sẽ được thực hiện tự động
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC): Chỉ đọc kết quả khi mẫu chứng đạt yêu cầu..
4.2.2 Đọc và nhận định
kết quả
Khi quá trình phản ứng
kết thúc, kết quả xét nghiệm sẽ được báo cáo tự động trên màn hình thiết bị
(Dương tính/Âm tính hoặc Không hợp lệ).
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Nếu thu được kết quả
không hợp lệ, cần chạy thêm một xét nghiệm nữa sử dụng cùng một bộ nhận mẫu xét
nghiệm. Cần tuân thủ hướng dẫn dưới đây:
• Tháo đế xét nghiệm và
hộp chuyển được liên kết khỏi thiết bị và nối phần đế xét nghiệm với một bộ
nhận mẫu xét nghiệm mở CHƯA DÙNG. Đế xét nghiệm và hộp chuyển được liên kết
PHẢI được gắn vào bộ nhận mẫu xét nghiệm trước khi vứt bỏ. Có thể sử dụng bộ
nhận mẫu xét nghiệm từ một gói bộp chuyển mới cho xét nghiệm này.
• Cẩn thận tháo riêng
bộ nhận mẫu xét nghiệm màu xanh lam ra khỏi thiết bị. Bộ nhận mẫu xét nghiệm
phải được giữ lại và giữ thẳng đứng để tránh làm đổ các chất lỏng.
• Từ màn hình Home, bắt
đầu một xét nghiệm mới. Tuân thủ các yêu cầu trên màn hình; tuy nhiên, khi được
yêu cầu lắp bộ nhận mẫu xét nghiệm, hãy tái sử dụng bộ nhận mẫu xét nghiệm và
KHÔNG dung ly lại que lấy mẫu.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục..
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Thực hiện chương trình
ngoại kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm soi phân
dùng để tìm phát hiện các thành phần có trong mẫu phân, các thông số phát hiện
trên máy xét nghiệm soi phân tự động gồm: Bạch cầu, hồng cầu, tế bào sinh mủ,
nấm, hạt mỡ, đại thực bào, bào tử lucidum, hạt tinh bột, tế bào biểu mô, tinh
thể charcot-leyden, tinh thể canxi oxalat, máu, trứng sán lá gan nhỏ, trứng
giun đũa, trứng giun tóc, trứng sán dây , trứng giun móc, trứng giun kim, ấu
trùng giun lươn, blastocystis hominis, trứng sán máng, trứng sán lá gan lớn,
trichomonas, amip, cryptosporidium, giardia lamblia.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Mẫu phân sau khi được
nạp vào máy sẽ được tự động tiền xử lý (pha loãng, trộn, lọc, làm phong phú mẫu
phân và/hoặc nhuộm iod). Mẫu sau khi xử lý được đưa vào buồng đo và soi trên
kính hiển vi độ phóng đại 20X và 40X đồng thời camera tích hợp sẵn sẽ tự động
chụp các hình ảnh hiển thị các thành phần có trong mẫu phân. kết quả cuối cùng
được báo cáo sau khi xem xét thủ công.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế:
Ví dụ minh hoạ cho Máy
xét nghiệm soi phân hoàn toàn tự động
- Dung dịch sát khuẩn
tay nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa
tay
- Dung dịch khử trùng
- Cốc đựng mẫu
- Dung dịch rửa
- Dung dịch rửa đậm đặc
- Dung dịch pha loãng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng
cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy xét nghiệm soi
phân hoàn toàn tự động (VD hoặc tương đương)
- Hệ thống quản lý
phòng xét nghiệm
- Bàn xét nghiệm
- Máy vi tính
- Máy in
- Máy in mã vạch
- Phần mềm quản lý xét
nghiệm
- Máy hút ẩm
- Bồn rửa mắt và tắm
khẩn cấp
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: phân.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh - ký sinh trùng.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện:
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Đặt mẫu bệnh phẩm lên khay đựng mẫu của máy.
|
|
2
|
Bộ phận nạp mẫu tự động của máy sẽ chuyển mẫu
đến vị trí lấy mẫu đã được chỉ định.
Bơm pít tông và đầu kim dẫn dung dịch phối
hợp để pha loãng mẫu và trộn mẫu, kim đâm xuyên qua nắp của cốc đựng mẫu hút
một lượng mẫu nhất định cần để xét nghiệm vào buồng đo.
Sau khi để lắng mẫu trong buồng đo trong một
thời gian nhất định, kính hiển vi phóng đại các thành phần và PC điều khiển
camera chụp và lưu hình ảnh của mẫu; báo cáo kết quả sẽ được hình thành dựa
theo kết quả xử lý của máy soi tự động.
|
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả báo cáo bao
gồm:
- Hình ảnh chụp tính
chất vật lý của mẫu kèm theo diễn giải tự động của hệ thống ( mẫu phân mềm/lỏng,
màu sắc,..)
- Các hình ảnh chụp
dưới kính hiển vi và kết quả nhận diện phân tích của hệ thống về các thành phần
có trong mẫu phân.
- Xét nghiệm định tính
trả kết quả Âm tính/Dương tính.
- Kiểm tra kết quả soi
thủ công trong trường hợp cần kiểm tra
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Trong bệnh phẩm phân,
có thể nhầm với trứng giun sán khác.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Chạy QC hàng tháng hoặc
khi cần
- Chuẩn bị hóa chất QC và
tiến hành chạy mẫu QC dưới chế độ cài đặt chạy QC của máy.
- Thiết bị đã được hiệu
chuẩn trước khi xuất xưởng và không yêu cầu hiệu chuẩn thường xuyên, chỉ nên
hiệu chuẩn thiết bị trong các trường hợp sau:
+ Các thành phần hóa
chất chính liên quan đến việc xét nghiệm mẫu phân được thay thế.
+ Khi thiết bị không
được sử dụng trong một thời gian dài.
+ Kết quả kiểm chuẩn có
độ lệch rất lớn.
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện chương trình
ngoại kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện kháng thể
reagin (kháng thể kháng cardiolipin) trong mẫu huyết thanh hoặc dịch não tủy,
hỗ trợ chẩn đoán bệnh giang mai do Treponema pallidum gây ra.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
VDRL là một xét nghiệm
kết tủa vi thể, được thực hiện dưới dạng định tính và bán định lượng để phát
hiện kháng thể reagin trong huyết thanh hoặc dịch não tủy. Kháng nguyên sử dụng
là hỗn hợp cardiolipin, cholesterol và lecithin. Khi kháng thể reagin có mặt
trong mẫu bệnh phẩm, sẽ cho phản ứng với kháng nguyên VDRL, tạo thành các vi
hạt kết tủa có thể quan sát dưới kính hiển vi.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Hóa chất thử nghiệm
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm vô
trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Đồng hồ bấm giây
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy ly tâm thường
- Tủ lạnh 2-8ºC
- Kính hiển vi
- Đồng hồ bấm giờ
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Có thể
sử dụng huyết thanh hoặc dịch não tủy.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
- Để thanh thử và dung
môi pha loãng về nhiệt độ phòng.
- Ly tâm mẫu máu 3500
vòng/phút, 10 phút
- Mẫu bệnh phẩm và chứng
cần bất hoạt 30min ở 56ºC
- 50µL huyết thanh hoặc
DNT vào vòng tròn 14mm
- Nhỏ 1 giọt huyền dịch
đã pha ở trên
- Đặt lên máy xoay tốc độ
180±5 vòng/phút trong 4 phút cho huyết thanh hoặc 8 phút cho DNT
- Đọc kết quả dưới kính
hiển vi độ phóng đại 100 lần
Các bước xét nghiệm bán
định lượng
- 50µL nước muối vào các
vòng tròn 2-4
- 50µL huyết thanh hoặc
DNT lên vòng tròn 1-2
- Trộn ở vòng 2 bằng
pipet 5-6 lần (tránh tạo bọt), chuyển 50µL vòng 2 sang 3, trộn 5-6 lần. Lặp lại
tương tự ở vòng 4, hút bỏ 50µL. Ta có tỷ lệ pha loãng tương ứng từ vòng 1-4 là
1:1; 1:2; 1:4; 1:8
- Thực hiện các bước 2-4
tương tự như xét nghiệm định tính, đọc kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của
nhà sản xuất.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm: Chỉ đọc kết quả khi có vạch C.
4.2.2. Đọc kết quả:
- Xác định hiệu giá kháng
thể ở nồng độ pha loãng lớn nhất vẫn còn dương tính.
- Các mẫu huyết thanh
dương tính hoặc nghi ngờ hoặc không xác định thì phải làm phản ứng bán định
lượng
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể gặp khi:
- Hóa chất bị hư hỏng,
hết hạn. Tiến hành làm lại xét nghiệm với hóa chất mới đảm bảo chất lượng.
- Thực hiện sai quy trình
xét nghiệm:
+ Sử dụng không đúng pipet
nhỏ quà hoặc ít hơn lượng bệnh phẩm cần nhỏ
+ Thời gian đọc kết quả
không đúng
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện được trực tiếp từ máu toàn phần của
người các loài vi khuẩn Bacteroides fragilis, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii,
Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus haemolyticus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Staphylococcus capitis, Stenotrophomonas maltophilia,
Staphylococcus hominis bằng kỹ thuật Real-time PCR.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Nguyên lý của kỹ
thuật Real-time PCR, là phản ứng PCR trong đó kết quả khuếch đại DNA đích được
hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng.
Định nghĩa: Droplet Digital PCR:
PCR kỹ thuật số vi giọt.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế:
- Bộ sinh phẩm Sepsis
Pathogenic Microorganisms Detection Kit (VD hoặc tương đương)
- Sepsis pathogenic
microorganisms detection kit (digital PCR)
- Blood Microbiome DNA
Isolation Kit
- Sepsis Pathogenic
Microorganism Detection Kit
- Cồn tuyệt đối
- Dung dịch khử nhiễm
- Đầu tip có màng lọc,
vô trùng 1000 µl
- Grinding tube for
Microbiome
- 5ml Tube Strips
- 10-Strip Tip Magnet
Rod Sleeve
- Generation Oil for
Probes
- Digital PCR cartridge
- Digital PCR cartridge
sealing cover
- Heat transfer film
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
(ống lấy máu EDTA 4 ml)
- Bông tiêm
- Bơm kim tiêm vô trùng
- Panh
- Giá nhựa cho tuýp 1.7
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Khẩu trang
- Găng tay không bột
dùng một lần
- Kính bảo vệ mắt
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi đựng rách thải
sinh học
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm thường
- Tủ an toàn sinh học
cấp II
- Máy DropX-2044HT
digital PCR, barcode scanner và hệ thống máy vi tính.
- Hệ thống tách chiết
tự động
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt kèm lắc
rung
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ ấm có khả năng đạt
tới 65ºC
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích
cỡ từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
- Máy vi tính
- Máy in
- Máy in mã vạch
- Phần mềm quản lý xét
nghiệm
- Máy hút ẩm
- Bồn rửa mắt và tắm
khẩn cấp
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
toàn phần có chất chống đông EDTA.
- Đảm bảo tiêu chuẩn
nhận mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ
định xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét
nghiệm phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 300 phút (5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
a. Tách chiết acid nucleic
Thực hiện tách chiết
bằng máy hoặc tách chiết thủ công.
b. Thực hiện phản ứng real-time PCR
* Chuẩn bị PCR mix
o Rã đông kỹ bộ hóa chất
ở nhiệt độ phòng.
o Vortex và spin Digital
PCR Buffer, hỗn hợp primer, probe Panel A/B/C/D.
o Xác định số lượng phản
ứng (N là số lượng phản ứng bao gồm mẫu, đối chứng dương tính và đối chứng âm
tính) sẽ được đưa vào thử nghiệm.
o Trong 4 ống, chuẩn bị
hỗn hợp Digital PCR bằng cách thêm Digital PCR Buffer và hỗn hợp primer, probe
Panel A/B /C/D dựa trên bảng bên dưới. Trộn kỹ hỗn hợp PCR bằng vortex.
|
Ống
|
Thành phần
|
Thể tích (µL)
|
|
Panel A
|
Digital PCR Buffer
|
10 x (N+1)
|
|
Panel A primer probe
mix
|
2 x (N+1)
|
|
Tổng thể tích (µL)
|
12 x (N+1)
|
|
Panel B
|
Digital PCR Buffer
|
10 x (N+1)
|
|
Panel B primer probe
mix
|
2 x (N+1)
|
|
Tổng thể tích (µL)
|
12 x (N+1)
|
|
Panel C
|
Digital PCR Buffer
|
10 x (N+1)
|
|
Panel C primer probe
mix
|
2 x (N+1)
|
|
Tổng thể tích (µL)
|
12 x (N+1)
|
|
Panel D
|
Digital PCR Buffer
|
10 x (N+1)
|
|
Panel D primer probe
mix
|
2 x (N+1)
|
|
Tổng thể tích (µL)
|
12 x (N+1)
|
o Rã đông mẫu DNA chiết ở
nhiệt độ phòng.
o Chia 12µL hỗn hợp
Digital PCR vào ống 200 µL. Đảm bảo không đưa bất kỳ bọt hoặc bong bóng nào vào
ống khi chia hỗn hợp.
o Thêm 8 µL mẫu DNA đã
tách chiết (hoặc đối chứng dương tính hoặc đối chứng âm tính) để tạo thành 20µL
hỗn hợp phản ứng PCR kỹ thuật số. Đảm bảo gửi mẫu trực tiếp bằng pipet vào hỗn
hợp phản ứng trong ống PCR. Trộn kỹ bằng vortex và ly tâm trong 1 phút.
* Chuẩn bị Microfluidic cartridge
o Đặt microfluidic
cartrdge vào cartridge holder. Mỗi cartridge holder chứa được 4 cartridge
o Chia 75µL Generation
Oil vào giếng chứa dầu của cartridge. Chia 20 µL Panel A/B/C/D đã chuẩn bị ở
bước 2 vào mỗi giếng
o Đạy cartridge lại bằng
Cartridge cover, dán Heat film và chuyển vào máy PCR cài chu trình nhiệt theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
o Đưa vào máy để phân
tích kết quả
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm (QC): Chỉ đọc kết quả khi mẫu chứng đạt yêu cầu.
- Đối chứng NC phải báo
cáo kết quả âm tính đối với tất cả 15 vi khuẩn gây bệnh được liệt kê (số lượng
giọt dương tính ít hơn 3). Nếu bất kỳ Kênh FAM, HEX, ROX hoặc Cy5 nào dương
tính thì quá trình chạy Digital PCR không hợp lệ.
- PC và NC được xác
định dựa trên mức cutoff <3 positive droplets.
- Kết quả chấp nhận
được hiển thị như bảng dưới đây:
|
Control
Type
|
Negative
|
Positive
|
|
Control
Name
|
Negative
Control (NC)
|
Positive
Control (PC)
|
|
Expected
Results and Concentration Values
|
Bacteroides fragilis
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Staphylococcus epidermidis
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Enterococcus faecium
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Streptococcus pneumoniae
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Acinetobacter baumannii
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Enterobacter cloacae
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Enterococcus faecalis
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Staphylococcus aureus
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Staphylococcus haemolyticus
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Klebsiella pneumoniae
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Pseudomonas aeruginosa
|
Negative
|
0-2
positive droplets
|
Positive
|
≥4 positive droplets
|
|
Escherichia coli
|
Positive
|
0-2 positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Staphylococcus capitis
|
Positive
|
0-2 positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
|
Stenotrophomonas maltophilia
|
Positive
|
0-2 positive droplets
|
Positive
|
≥5 positive droplets
|
|
Staphylococcus hominis
|
Positive
|
0-2 positive droplets
|
Positive
|
≥3 positive droplets
|
4.2.2 Đọc và nhận định
kết quả
Phân tích kết quả trên phần
mềm phân tích
- Tại tab
“Plot&Analyses”, chọn “Amplitude 2D”
- Phân tích kết quả trên
từng kênh màu
- Transfer data: Chọn
tab “Settings” →Export kết quả “Raw data” và “minimize”
Có
thể phân tích kết quả dựa trên thông tin phân tích dưới đây:
|
Bacteria
|
Positive Droplets
|
Interpretation
|
|
Bacteroides
fragilis
|
0-2
positive droplets
|
Negative
|
|
≥3
positive droplets
|
Positive
|
|
Staphylococcus
epidermidis
|
0-2
positive droplets
|
Negative
|
|
≥3
positive droplets
|
Positive
|
|
Enterococcus
faecium
|
0-2
positive droplets
|
Negative
|
|
≥3
positive droplets
|
Positive
|
|
Streptococcus
pneumoniae
|
0-2
positive droplets
|
Negative
|
|
≥3
positive droplets
|
Positive
|
|
Acinetobacter
baumannii
|
0-2
positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Enterobacter cloacae
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Enterococcus faecalis
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Staphylococcus aureus
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Staphylococcus haemolyticus
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Klebsiella pneumoniae
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Pseudomonas aeruginosa
|
0-3 positive droplets
|
Negative
|
|
≥4 positive droplets
|
Positive
|
|
Escherichia coli
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Staphylococcus capitis
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
|
Stenotrophomonas maltophilia
|
0-4 positive droplets
|
Negative
|
|
≥5 positive droplets
|
Positive
|
|
Staphylococcus hominis
|
0-2 positive droplets
|
Negative
|
|
≥3 positive droplets
|
Positive
|
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Số lượng bản sao
của IC yếu hoặc không có: lặp lại xét nghiệm
● Phản ứng PCR bị ức chế:
Kiểm tra phương pháp
tách chiết DNA theo khuyến cáo.
● Điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn 
Kiểm tra điều kiện bảo quản.
● Điều kiện PCR không
đúng theo hướng dẫn Kiểm
tra điều kiện PCR và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC trong quy trình.
● Không thêm IC vào các
mẫu trong khi hút thuốc thử Thêm IC trong quá trình tách chiết DNA/RNA.
5.2.2. Số lượng bản sao
của mẫu ít: lặp lại xét nghiệm.
5.2.3. Chứng âm xuất
hiện các bản sao:
● Nhiễm trong quá trình
tách chiết. Kết quả tất cả các mẫu không hợp lệ:
Khử trùng tất cả bề mặt và dụng cụ
với sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA đặc trưng.
Chỉ sử dụng tip có đầu lọc trong
quá trình tách chiết. Thay đổi đầu tip giữa các ống.
Lặp lại bước tách chiết DNA với bộ
thuốc thử mới.
Thực hiện lại bước chuẩn bị PCR
với bộ thuốc thử mới.
5.2.4. Số lượng bản sao
của chứng dương ít hoặc không có: thực hiện lại một lần nữa phản ứng PCR.
● Có thể chương trình
khuếch đại không chính xác hoặc các lỗi khác xảy ra trong quá trình khuếch đại
PCR Kiểm tra điều
kiện PCR và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC chứng dương trong quy trình.
● Chứng dương bị hỏng Có thể điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo quản.
5.2.5. Tín hiệu phân bố
không đồng đều trên plate: lặp lại phản ứng
● Thao tác pipet chính
xác để không tạo bọt khi chia hóa chất vào các giếng trên plate.
● Kiểm tra không gian
xung quanh vị trí đặt máy Rainsure (nên đặt máy trên 1 bàn độc lập, không có
các thiết bị khác gây ảnh hưởng).
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện chương trình
ngoại kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
25.
Vi khuẩn miễn dịch huỳnh quang
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm miễn dịch để
phát hiện định tính kháng nguyên vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân
bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xét nghiệm dựa trên
công nghệ miễn dịch huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên vi khuẩn. Thẻ xét
nghiệm có vạch chứng và vạch thử được phủ trước với kháng thể đơn dòng kháng
PPR và kháng thể thỏ kháng vi khuẩn tương ứng. Mẫu bệnh nhân được đưa vào giếng
nhỏ mẫu trên thẻ xét nghiệm và mẫu di chuyển dọc theo màng. Nếu có kháng nguyên
vi khuẩn, nó sẽ tương tác với europium liên hợp với kháng thể đơn dòng kháng vi
khuẩn tại lớp đệm liên hợp và hình thành phức hợp hạt huỳnh quang kháng thể-
kháng nguyên. Phức hợp này di chuyển dọc theo màng đến vạch thử và bị bắt giữ
bởi kháng thể kháng vi khuẩn trên vạch thử và hình thành tín hiệu huỳnh quang.
Cường độ của ánh sáng huỳnh quang tạo thành trên màng được quét bởi máy xét
nghiệm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Hóa chất thử nghiệm
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm vô
trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Đồng hồ bấm giây
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy ly tâm thường
- Tủ lạnh 2-8ºC
- Kính hiển vi
- Đồng hồ bấm giờ
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Có thể
sử dụng huyết thanh, tăm bông hoặc dịch sinh học của người. Mẫu bệnh phẩm được
lấy vào lọ đựng mẫu sạch, đóng kín
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
Chuẩn bị mẫu
- Để các thành phần của
kít và mẫu xét nghiệm đến nhiệt độ phòng (15-30ºC (59- 86ºF) trong tối thiểu 30
phút trước khi tiến hành xét nghiệm.
- Đọc kỹ Hướng dẫn sử
dụng kít xét nghiệm
- Kiểm tra hạn dùng ở mặt
sau túi nhôm. Sử dụng lô thành phẩm khác nếu đã quá hạn dùng.
- Mở túi nhôm, kiểm tra
thẻ xét nghiệm và gói hút ẩm silicagel trong túi.
Chuẩn bị mẫu chứng dương/chứng âm
- Đặt tăm bông chứng
dương/ chứng âm có trong bộ kit vào ống dung dịch đệm để chiết tách chứng. Xoay
tăm bông ít nhất năm lần.
- Lấy tăm bông ra và loại
bỏ tăm bông đã sử dụng tuân thủ theo quy định xử lý chất thải nguy hiểm sinh
học.
- Để phân tích mẫu chứng,
thực hiện theo hướng dẫn về 'Phân tích mẫu'
Phân tích mẫu xét nghiệm
- Sử dụng chế độ Xét
nghiệm chuẩn “STANDARD TEST”:
- Sử dụng các máy phân
tích : Chọn chế độ xét nghiệm chuẩn “Standard Test” -> Nhập ID bệnh nhân và/hoặc
ID người vận hành lên máy phân tích.
+ Lấy thẻ xét nghiệm ra
khỏi túi nhôm và đặt lên một bề mặt khô và phẳng. Viết thông tin bệnh nhân lên
nhãn của thẻ xét nghiệm.
+ Cài thẻ xét nghiệm
vào khe thẻ của máy phân tích.
+ Bóp bầu trên cùng của
pipet thể tích cố định (100μl) và đặt đầu pipet vào mẫu đã chuẩn bị.
+ Thả chậm bầu trên
cùng của pipet thể tích cố định sao cho đầu pipet luôn nhúng trong mẫu đã chuẩn
bị.
+ Nhỏ hoàn toàn lượng
mẫu trong pipet vào giếng nhỏ mẫu trên thẻ xét nghiệm bằng cách bóp mạnh bầu
trên cùng của pipet.
+ Sau khi nhỏ mẫu xét
nghiệm, ngay lập tức nhấn “TEST START”.
+ Máy phân tích sẽ tự
động hiển thị kết quả xét nghiệm trong vòng 15 phút. Mẫu dương tính mạnh có thể
được phát hiện sớm trong 5 phút trên máy phân tích.
- Sử dụng chế độ Chỉ đọc
“READ ONLY”
+ Lấy thẻ xét nghiệm ra
khỏi túi nhôm và đặt lên bề mặt phẳng và khô. Viết thông tin của mẫu xét nghiệm
lên trên nhãn của thẻ xét nghiệm
+ Bóp bầu trên cùng của
pipet thể tích cố định (100μl) và đặt đầu pipet vào mẫu đã chuẩn bị
+ Thả chậm bầu trên
cùng của pipet thể tích cố định sao cho đầu pipet luôn nhúng trong mẫu đã chuẩn
bị.
+ Nhỏ hoàn toàn lượng
mẫu trong pipet vào giếng mẫu trên thẻ xét nghiệm bằng cách bóp mạnh bầu trên
cùng của pipet.
+ Ủ thẻ xét nghiệm
trong 15 phút ở bên ngoài máy phân tích. Không được ủ quá 20 phút
+ Chuẩn bị máy phân
tích và đặt chế độ chỉ đọc “READ ONLY” theo hướng dẫn sử dụng của máy phân tích
+ Cài thẻ xét nghiệm
vào khe thẻ của máy.
+ Khi cài thẻ xét
nghiệm vào máy phân tích, nó sẽ tự động quét và hiển thị kết quả xét nghiệm.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm: Vùng kiểm soát quy trình nội kiểm nằm trên màng của thẻ xét nghiệm
(vùng chứng). Các máy phân tích đọc tín hiệu huỳnh quang của vùng kiểm soát quy
trình nội kiểm. Chỉ trả kết quả khi kết quả nội kiểm hợp lệ.
4.2.2. Đọc kết quả:
- Âm tính: COI < 1,0
- Dương tính: COI ≥ 1,0
- Không hợp lệ: Không có
giá trị ngưỡng
- Khi kết quả không hợp
lệ →thực hiện lại xét nghiệm. với mẫu bệnh phẩm mới
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể gặp khi:
+ Hóa chất bị hư hỏng,
hết hạn. Tiến hành làm lại xét nghiệm với hóa chất mới đảm bảo chất lượng.
+ Sử dụng dung dịch đệm
của lô khác, sử dụng lại kít xét nghiệm
+ Thẻ xét nghiệm không
sử dụng ngay sau khi lấy ra khỏi túi nhôm.
+ Quét lại trên cùng
một thiết bị.sau khi thẻ xét nghiệm đã được máy phân tích quét thành công,
+ Chất phát hiện là một
hợp chất huỳnh quang, không tạo ra kết quả nhìn thấy bằng mắt thường trên thẻ
xét nghiệm.
+ Viết lên mã vạch hoặc
làm hỏng mã vạch của thẻ xét nghiệm.
+ Sử dụng các mẫu không
được chỉ định trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm miễn dịch để
phát hiện định tính kháng nguyên hoặc kháng thể của virus trong mẫu bệnh phẩm
của bệnh nhân bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xét nghiệm dựa trên
công nghệ miễn dịch huỳnh quang trên máy phân tích để phát hiện kháng nguyên
virus. Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được đưa vào ống đệm chiết chứa dung dịch
đệm chiết để chiết tách kháng nguyên vi rút. Mẫu đã chiết được đưa vào giếng
mẫu trên thẻ xét nghiệm và mẫu thử di chuyển dọc theo màng từ giếng mẫu. Nếu có
kháng nguyên virus trong mẫu, nó sẽ liên kết với kháng thể kháng virus liên hợp
với vi hạt europium sau đó di chuyển qua màng. Các vi hạt huỳnh quang chứa kháng
nguyên virus sẽ được bắt giữ bởi kháng thể đơn dòng kháng virus trên vạch thử.
Cường độ của ánh sáng phát quang được tạo ra trên màng được quét bởi máy phân
tích.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y.
2.2. Thiết bị y tế
- Hóa chất thử nghiệm
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm vô
trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Đồng hồ bấm giây
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy ly tâm thường
- Tủ lạnh 2-8ºC
- Kính hiển vi
- Đồng hồ bấm giờ
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Có thể
sử dụng huyết thanh hoặc các dịch sinh học của người. Mẫu bệnh phẩm được lấy
vào lọ đựng mẫu sạch, đóng kín
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: Khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
Chuẩn bị mẫu
- Để các thành phần của
kít và mẫu xét nghiệm đến nhiệt độ phòng (15-30oC (59- 86oF) trong tối thiểu 30 phút trước khi tiến hành
xét nghiệm.
- Đọc kỹ Hướng dẫn sử
dụng kít xét nghiệm
- Kiểm tra hạn dùng ở mặt
sau túi nhôm. Sử dụng lô thành phẩm khác nếu đã quá hạn dùng.
- Mở túi nhôm, kiểm tra
thẻ xét nghiệm và gói hút ẩm silicagel trong túi.
Chuẩn bị mẫu chứng dương/chứng âm
- Đặt tăm bông chứng
dương/ chứng âm có trong bộ kit vào ống dung dịch đệm để chiết tách chứng. Xoay
tăm bông ít nhất năm lần.
- Lấy tăm bông ra và loại
bỏ tăm bông đã sử dụng tuân thủ theo quy định xử lý chất thải nguy hiểm sinh
học.
- Để phân tích mẫu chứng,
thực hiện theo hướng dẫn về 'Phân tích mẫu'
Xử lý mẫu bệnh phẩm
- Mẫu tăm bông ngoáy dịch
mũi họng: Xử lý như đối với mẫu chứng.
- Mẫu dịch hút/Dịch rửa mũi
họng hoặc các mẫu xét nghiệm trong môi trường vận chuyển:
+ Bóp vào bóng trên của
ống nhỏ giọt thể tích cố định (300μl) và đưa đầu ống vào trong mẫu đã thu thập.
+ Từ từ thả bóng trên
của ống nhỏ giọt ra để ống hút đầy ống nhỏ giọt thể tích cố định
+ Bóp mạnh bóng trên
của ống nhỏ giọt thể tích cố định vào ống đệm chiết để giải phóng toàn bộ mẫu
+ Trộn đều mẫu xét
nghiệm với dung dịch đệm chiết tách bằng cách bóp và thả bóng trên vài lần thật
cẩn thận
+ Loại bỏ ống nhỏ giọt
và đậy chặt nắp lọc vào ống dung dịch đệm
Phân tích mẫu xét nghiệm
- Sử dụng chế độ Xét
nghiệm chuẩn “STANDARD TEST”: Sử dụng các máy phân tích: Chọn chế độ xét nghiệm
chuẩn “Standard Test” -> Nhập ID bệnh nhân và/hoặc ID người vận hành lên máy
phân tích.
+ Lấy thẻ xét nghiệm ra
khỏi túi nhôm và đặt lên một bề mặt khô và phẳng. Viết thông tin bệnh nhân lên
nhãn của thẻ xét nghiệm.
+ Cài thẻ xét nghiệm
vào khe thẻ của máy phân tích.
+ Nhỏ 4 giọt hỗn hợp
mẫu vào giếng mẫu của thẻ xét nghiệm
+ Sau khi nhỏ mẫu xét
nghiệm, ngay lập tức nhấn “TEST START”.
+ Máy phân tích sẽ tự
động hiển thị kết quả xét nghiệm trong vòng 15 phút. Mẫu dương tính mạnh có thể
được phát hiện sớm trong 5 phút trên máy phân tích.
- Sử dụng chế độ Chỉ đọc
“READ ONLY”
+ Lấy thẻ xét nghiệm ra
khỏi túi nhôm và đặt lên bề mặt phẳng và khô. Viết thông tin của mẫu xét nghiệm
lên trên nhãn của thẻ xét nghiệm.
+ Nhỏ 4 giọt hỗn hợp
mẫu vào giếng mẫu của thẻ xét nghiệm.
+ Ủ thẻ xét nghiệm
trong 15 phút ở bên ngoài máy phân tích. Không được ủ quá 20 phút.
+ Chuẩn bị máy phân
tích và đặt chế độ chỉ đọc “READ ONLY” theo hướng dẫn sử dụng của máy phân
tích.
+ Cài thẻ xét nghiệm
vào khe thẻ của máy.
+ Khi cài thẻ xét
nghiệm vào máy phân tích, nó sẽ tự động quét và hiển thị kết quả xét nghiệm.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm: Vùng kiểm soát quy trình nội kiểm nằm trên màng của thẻ xét nghiệm
(vùng chứng). Các máy phân tích đọc tín hiệu huỳnh quang của vùng kiểm soát quy
trình nội kiểm. Chỉ trả kết quả khi kết quả nội kiểm hợp lệ.
4.2.2. Đọc kết quả:
- Âm tính: COI < 1,0
- Dương tính: COI ≥ 1,0
- Không hợp lệ: Không có
giá trị ngưỡng
- Khi kết quả không hợp
lệ →thực hiện lại xét nghiệm. với mẫu bệnh phẩm mới
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể gặp khi:
+ Hóa chất bị hư hỏng,
hết hạn. Tiến hành làm lại xét nghiệm với hóa chất mới đảm bảo chất lượng.
+ Sử dụng dung dịch đệm
của lô khác, sử dụng lại kít xét nghiệm
+ Thẻ xét nghiệm không
sử dụng ngay sau khi lấy ra khỏi túi nhôm.
+ Quét lại trên cùng
một thiết bị.sau khi thẻ xét nghiệm đã được máy phân tích quét thành công,
+ Chất phát hiện là một
hợp chất huỳnh quang, không tạo ra kết quả nhìn thấy bằng mắt thường trên thẻ
xét nghiệm.
+ Viết lên mã vạch hoặc
làm hỏng mã vạch của thẻ xét nghiệm.
+ Sử dụng các mẫu không
được chỉ định trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical microbiology
procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
27.
Vi nấm miễn dịch huỳnh quang
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện kháng nguyên Aspergillus
galactomannan trong huyết thanh người và dịch rửa phế nang (BAL) giúp hỗ
trợ chẩn đoán bệnh Aspergillosis xâm lấn. Kết quả được đọc trên máy phân tích
huỳnh quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xét nghiệm dòng chảy
bên TECO® Fast Aspergillus Galactomannan Ag sử dụng phương pháp sắc ký miễn
dịch huỳnh quang kẹp kháng thể kép để phát hiện Aspergillus galactomannan trong
mẫu huyết thanh người và mẫu BAL.
Kháng nguyên
Aspergillus galactomannan (nếu có) sẽ kết hợp sẽ kết hợp với phức hợp vi cầu huỳnh
quang và di chuyển xa hơn dọc theo màng nitrocellulose. Kháng thể
anti-Galactomannan phủ trên vạch thử nghiệm (T) tương tác với các phức hợp trên
kháng thể hiển thị các dải huỳnh quang trên vạch kiểm soát chất lượng (C) kết
hợp với kháng thể IgY kháng gà của dê. Vạch (C) phải luôn hiển thị một dải huỳnh
quang để kiểm tra xem thử nghiệm có hoạt động chính xác hay không cũng như một
tiêu chuẩn kiểm soát nội bộ. Đọc vùng phát hiện bằng máy phân tích miễn dịch huỳnh
quang để có tín hiệu huỳnh quang, diễn giải giá trị chỉ số.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Hóa chất thử nghiệm
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Lọ đựng bệnh phẩm vô
trùng
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Đồng hồ bấm giây
- Panh
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Túi rác các loại
- Máy ly tâm thường
- Tủ lạnh 2-8ºC
- Kính hiển vi
- Đồng hồ bấm giờ
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh, dịch rửa phế nang (BAL)
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm phải
có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 60 phút.
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo quy trình của phòng xét nghiệm.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo quy trình của phòng xét nghiệm.
a. Chuẩn bị mẫu
- Thêm 300 µL huyết thanh/BAL
vào ống phản ứng 1,5 ml.
- Thêm 100 µL dung dịch
xử lý mẫu vào ống chứa huyết thanh/BAL.
- Lắc xoáy trong 10 giây
để trộn đều, quay ly tâm trong 5 giây ở tốc độ 10.000×g
- Làm nóng ống ở 110°C
(máy ủ nhiệt khô) hoặc ở 100°C (bể ủ nhiệt ướt) trong 3- 4 phút.
- Ly tâm ống ở tốc độ
10.000 × g trong 10 phút. (Khuyến nghị 4°C nếu máy ly tâm được làm lạnh).
- Thu thập phần nổi và sử
dụng để thử nghiệm. Phần nổi có thể được thu thập và bảo quản ở 2-8°C trong tối
đa 8 giờ trước khi thử nghiệm. Nếu phân tích kết quả cho thấy cần phải thử
nghiệm lại, phải xử lý một phần mẫu khác để thử nghiệm.
- Lưu ý: các mẫu đối
chứng không cần xử lý.
b. Quy trình LFA
- Tham khảo kỹ hướng dẫn
sử dụng trước khi thực hiện xét nghiệm.
- Trước khi xét nghiệm,
đảm bảo rằng các thanh thử và mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ phòng. Sử dụng thanh thử
trong vòng 30 phút sau khi mở túi
- Đặt thanh thử trên một
mặt phẳng và sạch; từ từ phân phối 100 μL dịch mẫu hoặc dung dịch đối chứng
chưa xử lý vào miếng đệm mẫu.
- Đảm bảo mã QR cụ thể
cho từng lô đã được tải lên máy đọc và được kích hoạt, đồng thời chọn loại mẫu
chính xác (huyết thanh hoặc BAL, đối chứng được xử lý như mẫu huyết thanh).
- Đọc và ghi lại kết quả
chỉ số bằng máy phân tích miễn dịch huỳnh quang sau 20 phút (Không quá 25 phút,
vì có thể xảy ra kết quả bất thường).
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1 Xem xét kết quả
nội kiểm: Máy phân tích miễn dịch huỳnh quang sẽ tự động tính toán tín hiệu của
Đường kiểm soát (C). Nếu không thành công, máy sẽ hiển thị “Không hợp lệ”. Cần
phải lặp lại xét nghiệm.
- Khuyến nghị là ít nhất
một phép đo kiểm soát cho mỗi bộ dụng cụ hoặc ít nhất một lần chạy kiểm soát
mỗi tháng.
4.2.2 Đọc kết quả:
- Chỉ số ≥ 0,5 được coi
là dương tính với kháng nguyên galactomannan.
Lưu ý: Đối với tất cả các
bệnh nhân dương tính, nên lặp lại xét nghiệm với một mẫu mới (huyết thanh/BAL).
- Chỉ số < 0,5 được
coi là âm tính với kháng nguyên galactomannan.
Lưu ý: Kết quả âm tính có
thể chỉ ra rằng kết quả của bệnh nhân thấp hơn mức có thể phát hiện được của
xét nghiệm. Kết quả âm tính không loại trừ chẩn đoán Bệnh Aspergillosis xâm
lấn. Nên xét nghiệm lại nếu kết quả âm tính nhưng nghi ngờ mắc bệnh.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Các điều kiện
sau đây có thể gây ra kết quả dương tính giả:
a. Sử dụng kháng sinh β-lactam:
chẳng hạn như piperacillin / tazobactam, amoxicillin / axit clavulanic,
cefepime, cefoperazone / sulbactam, v.v.
b. Phản ứng chéo với
các loại nấm khác: chẳng hạn như histoplasma, fusarium và penicillium.
c. Truyền các sản phẩm
máu như albumin, immunoglobulin và các yếu tố đông máu.
d. Vi hệ bình thường
bifidobacterium ở trẻ sơ sinh: Sự hiện diện của nồng độ bifidobacteria cao
trong ruột của trẻ sơ sinh và trẻ em dẫn đến xét nghiệm galactomannan huyết
thanh dương tính ở trẻ sơ sinh.
e. Ngũ cốc: Galactomannans
có trong một số loại ngũ cốc và đi vào máu qua niêm mạc ruột bị tổn thương.
f. Các yếu tố khác: Sự
hiện diện của các quyết định kháng nguyên phản ứng chéo với galactomannans
trong tăm bông được sử dụng trong quá trình phẫu thuật.
5.2.2. Các tình trạng
sau đây có thể gây ra kết quả âm tính giả:
a. Điều trị dự phòng
chống nấm mốc sẽ ảnh hưởng đáng kể đến kết quả xét nghiệm galactomannans.
b. Nhiễm trùng tại chỗ,
bao gồm u hạt mạn tính.
c. Ở một số bệnh nhân
bị nhiễm aspergillus, galactomannans có thể bị phân hủy hoặc trung hòa bởi
kháng thể để gây ra kết quả âm tính giả.
Kết quả xét nghiệm đối
với cùng một bệnh nhân có thể khác nhau ở các giai đoạn khác nhau của bệnh,
trong các điều kiện sinh lý khác nhau và trong các loại thuốc khác.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Yêu cầu thực hiện ngoại
kiểm (EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xác định RNA đặc trưng
của các virus Dengue-Chikungunia-Zika trong mẫu bệnh phẩm của người bằng kỹ
thuật Real-time PCR đa tác nhân.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Xác định vi sinh vật
gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm dựa trên công nghệ phát hiện đa đích và nguyên lý
RT-PCR một bước, đa mồi để khuếch đại và phát hiện nhiều acid nucleic đích từ
mẫu bệnh phẩm.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
1000 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
200 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
20 µL- tiệt trùng
- Đầu côn (típ) có lọc,
10 µL- tiệt trùng
- Tuýp 0.1ml (8 tuýp/1thanh)
- Nắp strip (bằng số tuýp
0,1ml)
- Tuýp 1.7 ml
- Tuýp 15 ml
- Tuýp 50 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Giá nhựa cho tuýp 1.7
ml
- Giá nhựa giữ lạnh cho
tuýp 0.2 ml
- Panh Cái
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng tay không bột
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Máy ly tâm lạnh đa năng
- Máy ly tâm thường
- Tủ an toàn sinh học cấp
II
- Hệ thống tách chiết tự
động hoặc tách chiết thủ công
- Hệ thống máy Real-time
PCR và máy vi tính.
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt kèm lắc
rung
- Máy Vortex
- Máy ly tâm Spin down
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 1 µl đến 1000 µl
- Bàn xét nghiệm
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Máu
toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, mẫu mô và các dịch sinh học
khác. Tốt nhất là huyết thanh và nước tiểu.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 300 phút (5
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Phải đồng nhất và xử lý
mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
a. Tách chiết acid nucleic
- Thực hiện tách chiết
bằng máy hoặc tách chiết thủ công.
b. Thực hiện phản ứng real-time PCR
Vận hành theo hướng dẫn
sử dụng máy Real-time PCR.
- Thực hiện bước này với
các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Chỉ lấy đủ số tube PCR
mix cần. Bóc lớp vỏ nhôm che phủ trên đĩa hoặc tube phản ứng.
- Cho dung dịch hồi chỉnh
vào mỗi giếng.
- Cho chứng +, chứng -
hoặc dịch RNA tách chiết vào từng giếng, đậy nắp, ly tâm nhẹ. Xong, đặt các
tube vào máy real-time PCR.
- Bật máy real-time PCR.
Bật máy tính khởi động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15
phút.
- Cài đặt vị trí mẫu
“Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn màu Cy5 (Zika),
FAM (Dengue), ROX (Chikungunya) cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX (hoặc
JOE/VIC) cho chứng nội.
- Cài đặt chương trình
“Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào
máy tính.
- Cho máy real-time PCR
chạy chương trình
Chú ý: Đối với các tác nhân có
cùng chương trình PCR thì có thể thực hiện chung 1 lần. Nếu màu dùng để phát
hiện các tác nhân là khác nhau thì cứ mỗi tác nhân sẽ chọn màu tương ứng cho
nó.
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm
Chỉ đọc kết quả khi QC
đạt yêu cầu.
4.2.2. Đọc kết quả
Diễn giải kết quả theo
quy trình của phòng xét nghiệm và hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
5.2.1. Tín hiệu của IC
yếu hoặc không có: lặp lại xét nghiệm
● Phản ứng PCR bị ức chế:
Kiểm tra phương pháp
tách chiết DNA theo khuyến cáo.
● Điều kiện bảo quản
thuốc thử không đúng theo hướng dẫn 
Kiểm tra điều kiện bảo quản.
● Điều kiện PCR không
đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện IC trong quy trình.
● Không thêm IC vào các
mẫu trong khi hút thuốc thử Thêm IC trong quá trình
tách chiết DNA/RNA.
5.2.2. Tín hiệu của mẫu
yếu (Ct > 36): lặp lại xét nghiệm.
5.2.3. Chứng âm xuất
hiện tín hiệu dương tính:
● Nhiễm trong quá trình
tách chiết. Kết quả tất cả các mẫu không hợp lệ:
Khử trùng tất cả bề mặt và dụng cụ với
sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA đặc trưng.
Chỉ sử dụng tip có đầu lọc trong quá
trình tách chiết. Thay đổi đầu tip giữa các ống.
Lặp lại bước tách chiết DNA với bộ thuốc
thử mới.
Thực hiện lại bước chuẩn bị PCR với bộ
thuốc thử mới.
5.2.4. Không có tín
hiệu dương của chứng dương: thực hiện lại một lần nữa phản ứng PCR.
● Có thể chương trình
khuếch đại không chính xác hoặc các lỗi khác xảy ra trong quá trình khuếch đại
PCR Kiểm tra điều kiện PCR
và kênh huỳnh quang cho phát hiện ICchứng dương trong quy trình .
● Chứng dương bị hỏng 
Có thể điều kiện bảo quản thuốc thử
không đúng theo hướng dẫn Kiểm tra điều kiện bảo
quản.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Phòng xét nghiệm tạm
dừng trả kết quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội
kiểm không đạt, phòng xét nghiệm tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực
hiện tiếp xét nghiệm sau khi đã hoàn thành việc khắc phục.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả xét nghiệm.
* Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT)
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.
29.
Beta - D glucan định lượng
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm
(1-3)-β-D-Glucan nấm được thực hiện bằng phương pháp quang phổ để phát hiện
định lượng (1-3)-β-D-Glucan trong huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA. Đây là
một tham chiếu chẩn đoán cho các bệnh nấm xâm nhập.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý: Dựa trên nguyên lý của
kỹ thuật ELISA (miễn dịch hấp phụ gắn enzym). Huyết thanh đã qua xử lý được
thêm vào thuốc thử chính, chứa yếu tố G. Yếu tố G được kích hoạt bởi
(1-3)-β-D-Glucan và yếu tố G đã kích hoạt chuyển enzyme tiền đông máu thành
enzyme đông máu. Enzyme đông máu thủy phân cơ chất (Boc-leu- Gly-Arg-PNA) để
giải phóng PNA. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 405 nm theo phương pháp động
học.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ vi sinh hoặc bác
sĩ xét nghiệm hoặc kỹ thuật y
2.2. Thiết bị y tế
- Bộ sinh phẩm chẩn đoán
nấm (1-3)-β-D-Glucan
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Tiêu hao sinh phẩm cho
chạy chứng, kiểm tra chất lượng
- Nước cất 2 lần
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh
- Cồn 70%
- Dung dịch nước rửa tay
- Dung dịch khử trùng
- Đầu côn (típ) 1000µL-
tiệt trùng
- Đầu côn (típ) 200µL-
tiệt trùng
- Đầu côn (típ) 10µL-
tiệt trùng
- Tuýp 15 ml
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh
phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Bơm kim tiêm vô trùng
- Panh
- Kính lọc mật độ quang
máy đọc ELISA
- Giấy thấm
- Mũ giấy
- Khẩu trang
- Găng khám
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bác sĩ/KTV/hộ
lý
- Áo choàng phòng xét
nghiệm
- Khăn lau tay
- Bàn xét nghiệm
- Máy ly tâm thường
- Dàn máy ELISA và máy
tính có cài đặt phần mềm
- Hệ thống quản lý phòng
xét nghiệm
- Bộ lưu điện.
- Máy lắc trộn Vortex
- Tủ lạnh 2ºC - 8ºC
- Tủ lạnh âm sâu -20 ºC
- Tủ lạnh âm sâu -70 ºC
- Bộ pipette các kích cỡ
từ 10 µl đến 1000 µl
2.3. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại bệnh phẩm: Huyết
thanh người.
- Đảm bảo tiêu chuẩn nhận
mẫu và xử lý mẫu theo quy định.
2.4. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định
xét nghiệm đảm bảo đầy đủ thông tin theo quy định. Phiếu chỉ định xét nghiệm
phải có loại bệnh phẩm và vị trí lấy mẫu (nếu có).
2.5. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 240 phút (4
giờ).
2.6. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm vi
sinh.
3. AN TOÀN
- Phòng xét nghiệm thực
hiện cấp độ ATSH theo công bố phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám chữa
bệnh.
- Thực hiện theo hướng
dẫn sử dụng hoá chất sinh phẩm và an toàn khi sử dụng hoá chất phòng xét nghiệm
(tham khảo MSDS của nhà sản xuất).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Xử lý bệnh phẩm:
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.1.2. Tiến hành kỹ
thuật: Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
|
Các bước
|
Nội dung
|
|
1
|
Để số lượng sinh phẩm cần dùng ở nhiệt độ
phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm
|
|
2
|
Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo
thứ tự.
|
|
3
|
Chuẩn bị dung dịch rửa: Pha loãng với nước
cất theo tỷ lệ hướng dẫn của nhà sản xuất, chuẩn bị dung dịch đệm mẫu, cộng
hợp, dung dịch hiện màu....
|
|
4
|
Khởi động hệ thống: Bật máy lên và khởi động
hệ thống bằng cách nhấp đúp vào biểu tượng chương trình.
|
|
5
|
Kiểm tra nước cất, nước rửa, đầu tip…
|
|
6
|
- Kiểm tra hệ thống: Hệ thống được khởi động
và kiểm tra chức năng máy.
- Đưa sinh phẩm và mẫu bệnh phẩm vào máy:
+ Đưa sinh phẩm có mã vạch vào máy.
+ Đưa mẫu bệnh phẩm vào: khay đựng mẫu cuối
cùng được đưa vào trước
+ Nhập mã số hoặc tên bệnh nhân vào bảng mẫu
và chọn test sử dụng.
+ Tiếp tục cho các khay đựng mẫu bệnh nhân
tiếp theo.
|
|
7
|
Nhập thông tin bệnh nhân:
Nhập thủ công:
Chọn Utilities -> Patient Details và xác
định bệnh nhân và thử nghiệm Beta-D glucan trong Patient Editor.
Chọn Add Patient(s) để mở hộp thoại kế tiếp.
Nhập mã số bệnh nhân và số lượng bệnh nhân
vào ô Number of Patients.
Chọn Add Test(s) trong hộp thoại Patient
Editor. Xác định bệnh nhân với thử nghiệm Beta-D glucan bằng cách chọn bệnh
nhân sau đó chọn loại thử nghiệm.
Nhập bệnh nhân có mã vạch:
Nhấn File -> New -> Worklist
Plate, Assay và test đã hiện lên sẵn chỉ cần
kiểm tra lại và nhấn OK
Nhấn Start
Thuốc thử và mẫu bệnh nhân đã được tự động
được đưa vào vị trí.
Kiểm tra vị trí bình nước rửa, đầu tip.
Nhấn OK
Nhập Lot, hạn sử dụng và mã: NC, CAL, PC nhắp
OK
Đặt Plate vào vị trí qui định theo hướng dẫn
của máy và đặt tên cho Plate đó.
|
|
8
|
Chương trình bắt đầu chạy test đặt sẵn theo
quy trình:
a. Phân bổ các giếng trên Microtiter plate R8
cho các mẫu chuẩn, đối chứng và mẫu.
b. Hút 60 μl Dung dịch Diluent R6 vào các
giếng tương ứng làm đối chứng âm tính.
c. Hút 60 μl dung dịch Chuẩn (A, B, C, D và
E) vào các giếng tương ứng.
d. Hút 20 μl mẫu huyết thanh hoặc đối chứng
dương tính vào các giếng tương ứng.
e. Thêm 40 μl Dung dịch Solution R3 vào các
giếng chứa 20 µl mẫu huyết thanh hoặc đối chứng dương tính.
f. Lắc trong 5-10 giây và ủ đĩa Microtiter ở
37°C trong 10 phút.
g. Thêm 100 μl Main Reagent R1 mới hoàn
nguyên vào mỗi giếng.
h. Lắc đĩa trong 5-10 giây.
i. Đọc giá trị OD ở 37°C theo phương pháp
động học tại 405 nm và 490 nm trong 40 phút.
|
|
9
|
Khi đã kết thúc quá trình thử nghiệm, kết quả
được lưu lại vào một tập tin và hiển thị lên màn hình.
|
|
10
|
Lấy sinh phẩm, mẫu bệnh phẩm và tấm ra sau
khi chạy máy xong.
|
|
11
|
Vệ sinh máy:
Cất nước rửa và thay bằng nước cất.
Đổ đầu tip đã sử dụng và bình đựng nước thải.
Súc rửa bình nước thải
|
|
12
|
Tắt máy tính.
|
|
13
|
Tắt máy miễn dịch.
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Xem xét kết quả
nội kiểm
Kết quả được chấp nhận
khi kết quả của mẫu chứng đạt các yêu cầu:
- Xem xét kết quả QC:
+ Đánh giá theo tiêu chuẩn
nhà sản xuất:
Chạy kiểm tra chứng âm và chứng dương mỗi khi mở một hộp kit mới, ít nhất 24
giờ một lần trước khi chạy test và sau mỗi lần chạy chuẩn theo hướng dẫn của
nhà sản xuất
+ Đánh giá theo tiêu chuẩn phòng xét nghiệm
• NC và PC: Đánh giá
kết quả theo hướng dẫn theo dõi QC
• Qui trình xét nghiệm
được thực hiện xem xét định kì hàng năm: xem xét độ lặp lại, độ tái lặp...
4.2.2. Đọc và nhận định
kết quả
Lập đồ thị Đường chuẩn:
Lập
một đường cong hiệu chuẩn bằng cách vẽ nồng độ tiêu chuẩn trên trục x và độ dốc
trung bình OD/phút trên trục y. Sử dụng đường khớp hồi quy tuyến tính để xử lý
dữ liệu. Nồng độ (1-3)-β-D-Glucan của mẫu và đối chứng có thể được đọc từ đường
cong tiêu chuẩn này.
Kết quả điển hình: Độ dốc trung bình OD/phút
của đối chứng âm phải nhỏ hơn Standard E, cho thấy xét nghiệm không bị nhiễm
bẩn. Nếu có sự lệch lớn trong đường cong tiêu chuẩn, nên lặp lại xét nghiệm. Hệ
số tương quan r2 phải > 0,980. Nồng độ tính toán của đối chứng
dương phải nằm trong phạm vi mục tiêu được chỉ định trên nhãn của lọ Control R5
cho từng lô cụ thể. Nếu giá trị của đối chứng dương không nằm trong giới
hạn của phạm vi mục tiêu, kết quả xét nghiệm nên được coi là không đáng tin cậy
và mẫu cần được xét nghiệm lại.
Giải thích kết quả: Các giới hạn cắt được
xác định trong quần thể được nghiên cứu để thu thập các đặc tính hiệu suất. Tuy
nhiên, mỗi phòng thí nghiệm có thể muốn thiết lập các giá trị cắt và giải thích
kết quả âm tính và dương tính riêng với quần thể bệnh nhân của họ.
• Kết quả < 70 pg/ml
cho thấy kết quả âm tính.
• Kết quả ≥ 95 pg/ml
cho thấy kết quả dương tính.
• Kết quả 70 pg/ml ≤
Kết quả < 95 pg/ml cho thấy kết quả không kết luận. Kết quả không kết luận
cho thấy nghi ngờ nhiễm nấm xâm lấn, cần lấy mẫu bổ sung và xét nghiệm lạ
4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
- Xem xét toàn bộ quá
trình trước, trong và sau xét nghiệm trước khi trả kết quả. Không trả kết quả
khi phát hiện sai sót.
- Trả kết quả theo quy
định bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
- Lưu hồ sơ kết quả xét
nghiệm bằng bản cứng hoặc bản điện tử.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
Sai sót có thể do lấy,
đóng gói, bảo quản hoặc vận chuyển mẫu bệnh phẩm không đúng quy định. Phòng xét
nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm. Trong trường hợp không thể lấy lại được
bệnh phẩm, phòng xét nghiệm vẫn thực hiện và ghi chú về tính không chính xác
của kết quả xét nghiệm do lấy mẫu không đảm bảo chất lượng.
5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật
Việc lấy mẫu bệnh phẩm,
vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù
phản ứng được thực hiện đúng.
Có thể xảy ra hiện
tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do: thực hiện sai các bước
trong quy trình hướng dẫn, nhiễm chéo mẫu bệnh phẩm: Chứng âm và những mẫu bệnh
phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/ huyết tương có nồng độ kháng thể
cao. Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxid hoá (thuốc tẩy, ion kim
loại v.v…), dung dịch dừng phản ứng bị nhiễm bẩn
Xử trí:
- Tuân thủ đúng các bước
qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét
nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.
- Với mục đích chẩn đoán,
kết quả luôn cần được đánh giá phối hợp tiền sử, lâm sàng và nhiều bằng chứng
khác trên bệnh nhân.
- Kiểm tra, bảo dưỡng, vệ
sinh máy định kỳ và đúng quy trình khi thực hiện xét nghiệm.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật:
- Đọc, nhận định, phiên
giải và biện luận kết quả cần cẩn thận và chính xác để tránh nhầm lẫn.
- Kết quả nội kiểm được
xem xét định kỳ nhằm phát hiện và khắc phục những xu hướng ảnh hưởng tới kết
quả XN.
- PXN tạm dừng trả kết
quả cho khách hàng nếu kết quả nội kiểm không đạt. Khi kết quả nội kiểm không
đạt, PXN tìm kiếm nguyên nhân và khắc phục, chỉ thực hiện tiếp XN sau khi đã
hoàn thành việc khắc phục.
- Lưu ý: Có thể có các
yếu tố làm ảnh hưởng sai lệch tới kết quả xét nghiệm theo hướng dẫn của nhà sản
xuất (Ví dụ: hemoglobin, lipid máu, bilirubin máu, một số loại thuốc…) hoặc có
phản ứng chéo.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- Yêu cầu thực hiện kiểm
tra chất lượng (IQC và/hoặc EQC theo Quyết định 2429/QĐ-BYT).
- Thực hiện ngoại kiểm
(EQA) hoặc so sánh liên phòng.
- Với kết quả xét nghiệm
bất thường hoặc nghi ngờ, cần thực hiện lại xét nghiệm hoặc chuyển gửi đến
phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc các cơ sở y tế có chứng nhận về chất lượng để
khẳng định.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ, Nghị định số 103/2016/NĐ-CP ngày 01/7/2016 quy định về bảo
đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm, 2016.
2. Bộ Y tế, Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/6/2017 Ban hành Tiêu chí
đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, 2017.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 về việc ban hành Đề
cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm, 2023.
4. Karen C. Carroll and Michael A. Pfaller. Manual
of clinical microbiology. ASM Press, Washington, DC. 2023, 13th edition.
5. Amy L. Leber, CareyAnn D. Burnham. Clinical
microbiology procedures handbook. ASM Press, Washington, DC. 2023, 5th
edition.