TCVN 5306:1991
(ST SEV 5625-86)
Animal feeding stuffs
Method for
determination of Fuzariotoxin
TCVN 5306-1991 phù
hợp với ST SEV 5625 - 86.
TCVN 5306-1991 do
Trung tâm Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng khu vực 1 biên soạn, Tổng cục Tiêu
chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị và được ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành
theo quyết định số 49/QĐ ngày 21 tháng 1 năm 1991.
Tiêu chuẩn này áp
dụng cho thức ăn chăn nuôi và quy định phương pháp xác định Zaralenon (độc tố
F-2) và độc tố T-2 trong hạt.
Tiêu chuẩn này phù
hợp với ST SEV 5625-86.
1. Nguyên tắc của
phương pháp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2.
Quy đinh chung
2.1. Khi tiến hành
thử cần tuân thủ yêu cầu của các qui định hiện hành.
2.2. Khi tiến hành
thử nếu không có các chỉ dẫn khác thì sử dụng thuốc thử loại “tinh khiết phân
tích” và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
2.3. Mức phát hiện
tối thiểu khi xác định bằng phương pháp này là không nhỏ hơn 100mg/kg đối với độc tố F-2 và không nhỏ
hơn 500mg/kg đối với độc tố
T-2.
3.
Thiết bị.
3.1. Thiết bị để làm
sắc ký lớp mỏng gồm: Máy trải lớp mỏng, buồng sắc ký, bình triển khai dung tích
5; 10; 50 mm3, các tấm kính 20 x 20 cm.
3.2. Nguồn phát tia
cực tím với bước sóng 254 và 365 mm.
3.3. Thiết bị rung
lắc
3.4. Tủ sấy, đảm bảo
điều chỉnh nhiệt độ đến 150°C.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.6. Máy nghiền thí
nghiệm, đảm bảo độ mịn không lớn hơn 1mm.
3.7. Cân kỹ thuật có
sai số ± 0,1g
3.8. Cân phân tích có
sai số ± 0,00001g
3.9. Bơm phun nước
3.10. Máy bốc hơi
chân không loại quay
3.11. ống đong hình
trụ dung tích 5; 10 và 100 cm3
3.12. Bình đong dung
tích 10 cm3
3.13. Pipet dung tích
1, 2 và 5 cm3
3.14. Bình cầu đáy
tròn dung tích 100; 250 và 500 cm3 với độ mỏng bình thường.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.16. ống nghiệm chia
độ với độ mỏng bình thường.
3.17. ống nghiệm nhám
với độ mỏng bình thường.
3.18. Phễu Bucne
đường kính 10 cm
3.19. Phễu chia có
dung tích 100 cm3
3.20. Sàng có đường
kính lỗ 1 mm
3.21. Máy phun mù có
dùng chất lỏng
3.22. Bình Bunden
dung tích 500 cm3
3.23. Bình hút ẩm để
bảo quản các tấm lớp mỏng
4.
Thuốc thử, dung tích và vật liệu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.2. Metanol
4.3. N-hecxan
4.4. Natri nitrit,
dung dịch nước 5%
4.5. Natri hydroxyt,
dung dịch nước 10%
4.6. Natri sunfat
khan
4.7. Benzidin
4.8. Hỗn hợp
Clorofooc và metanol theo tỷ lệ thể tích 95+5;
4.9. Natri Clorua,
dung dịch nước 0,85%
4.10. Natri cacbonat,
dung dịch nước 10%
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.12. Axit sunfuric,
dung dịch 20% trong etanol
4.13. Benzidin - dung
dịch 0,5% trong hỗn hợp etanol - nước theo tỷ lệ thể tích 1+1, độ pH 1;
4.14. Dung dịch
benzidin
Dung dịch này được
chuẩn bị như sau: ở nhiệt độ 0°C,
trộn các thể tích bằng nhau của dung tích nước 5% Natri nitrit và dung dịch
benzidin 0,5% trong hỗn hợp etanol - nước. Sau đó dùng dung dịch nước 10% natri
hydroxyt tạo độ pH của dung dịch bằng 5.
4.15. F-2 và T-2 dung
dịch
Chuẩn bị các dung
dịch chuẩn ban đầu: Cho 1mg zearalenon hay độc tố T-2 vào bình đong dung dịch
10cm3, hoà tan nó trong clorofooc và thêm đến vạch. Nồng độ dung
dịch phải đạt 0,1mg/cm3.
Chuẩn bị các dung
dịch chuẩn làm việc:
Đổ 1 cm3
dung dịch chuẩn ban đầu vào bình đong dung tích 10cm3 và pha thêm
clorofooc đến vạch. Nồng độ dung dịch phải đạt 10mg/cm3.
4.16.
Các tấm chuẩn để sắc ký màng mỏng (loại của Tiệp Khắc).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.17. Silicagen cho
sắc ký lớp mỏng.
4.18. Giấy lọc lọc
nhanh
4.19. Khí trơ, ví dụ
nitơ
5.
Chuẩn bị thử
5.1. Chuẩn bị chất
chiết suất của mẫu thử thức ăn chăn nuôi. Trộn đều, cẩn thận mẫu thử và lấy ra
30gam đem nghiền, sàng và trộn kỹ. Cân 25g mẫu thử với sai số không lớn hơn ± 1,0g và đổ vào bình dung tích 500 cm3.
Rót vào bình này 15cm3 dung dịch nước 0,85% natriclorua và khuấy
đều.
Sau 2h trương nở, đổ
thêm 5cm3 metanol, khuấy đều và đổ 45 cm3 clorofooc. Sau
đó đậy nắp bình, đưa lên máy rung và rung trong vòng 2h. Lọc hỗn hợp trong chân
không qua giấy lọc và cặn còn lại trên giấy lọc rửa 2 lần bằng 20cm3
clorofooc. Các chất chiết thu được cho bốc hơi chân không.
5.2. Tinh chế chất
chiết
Thêm 15cm3
dung dịch nước natriclorua 0,85% và 30cm3 N-hecxan vào cặn khô của
chất chiết, lắc dung dịch và chuyển sang phễu tách. Đổ bỏ pha ở trên (bay hơi),
còn pha nước đem rửa 2 lần 20cm3 N-hecxan, loại bỏ tiếp N-hecxan,
sau đó pha nước đem chiết 3 lần theo từng phần một trong 20cm3
clorofooc.
Lọc toàn bộ pha chứa
clorofooc qua lớp natri sunfat khan đặt trên giấy lọc trong phễu thủy tinh. Sau
đó cho phần lọc bay hơi trong bình đáy nhọn dung tích 100cm3 đến thể
tích còn lại gần 1cm3. Đổ chất chiết đậm đặc vào ống chia độ, rửa
bình đáy nhọn 2 lần bằng 0,5cm3 clorofooc. Nước rửa đổ vào cùng ống
chia độ và thêm clorofooc để có thể tích 2,5cm3, bảo quản dung dịch
thử trong bình kín và đặt trong tủ lạnh cho đến khi phân tích.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3.1. Độc tố T-2.
Lấy 2 tấm và nhỏ 10
mm3 dung dịch thử vào góc dưới phía bên trái cách 1cm về phía trong
tấm, nhỏ tiếp cách giọt 5cm3 dung dịch chuẩn làm việc, cách mép dưới
và mép trái tấm chuẩn 14cm vạch một dấu.
5.3.2. Zearalenon
Nhỏ 2 giọt, mỗi giọt
10mm3 mẫu chất chiết thử lên tấm chuẩn vào góc dưới phía trái cách
các mép và cách nhau 2cm.
Chất chiết được chuẩn
bị như sau: Lấy 0,5cm3 dung dịch thử có được theo điều 5.2. Cho bốc
hơi ở nhiệt độ 40°C trong dòng khí trơ
và cặn thì chuyển vào 100mm3 clorofooc.
Nhỏ thêm lên một
trong hai vết 5mm3 chuẩn làm việc (chuẩn nội bộ). Cũng trên tấm này,
nhỏ các mẫu của dung dịch chuẩn làm việc zearalenon với các thể tích 5; 10; 25
và 50mm3.
5.4.
Chuẩn bị buồng sắc ký.
Trước khi tiến hành
sắc ký 30 phút; với 2 buồng có vách bên trong lót giấy lọc, đổ vào 1 buồng 100
cm3 hỗn hợp clorofooc metanol theo tỷ lệ thể tích 9535 và 100cm3
N-hecxan vào buồng kia, sau đó đậy nắp các buồng lại.
6.
Tiến hành thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.1.1. Thử sự có mặt
của độc tố T-2.
6.1.1.1.Nhúng theo
cạnh dưới tấm đã được chuẩn bị sẵn vào buồng có chứa hỗn hợp clorofooc -
metanol (95+5). Sau khi bề mặt của hỗn hợp dung môi ngập đến mức 14cm cách
đường xuất phát thì lấy chuẩn ra khỏi buồng và sấy trong tủ hút.
6.1.1.2. Nhúng lại
tấm chuẩn này vào cùng buồng thử theo cạnh đứng bên trái và lặp lại việc sắc ký
theo điều 6.1.1.1.
6.1.2. Thử sự có mặt
của Zearalenon.
Nhúng
theo cạnh dưới tấm chuẩn đã được chuẩn bị sẵn vào buồng thử có chứa N-hecxan.
Sau khi bề mặt của dung môi ngập đến 14cm cách đường xuất phát thì lấy tấm
chuẩn ra khỏi buồng và sấy trong tủ hút. Sau đó lại nhúng tấm chuẩn này vào
cùng buồng thử đó và lặp lại việc sắc ký. Sau khi sấy, nhúng tấm chuẩn theo
cạnh dưới vào buồng thử chứa hỗn hợp clorofooc - metanol (95+5). Sau khi bề mặt
của hỗn hợp dung môi ngập đến mức 14cm cách đường xuất phát thì lấy tấm chuẩn
ra và sấy trong tủ hút.
6.2. Đánh giá sắc phổ
6.2.1. Phát hiện độc
tố T-2.
Vẩy
dung dịch 20% axit sunfuric trong cồn lên tấm chuẩn đã phơi khô ngoài không khí
và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C
trong 20 phút, soi tấm chuẩn đã để nguội trong buồng tối bằng tia cực tím có độ
dài bước sóng 365mm, cách nguồn phát sáng 20cm. Sau đó, xác định các vết phát
sáng của độc tố T-2 của dung dịch chuẩn ở cả hai hướng phân chia và giao điểm
của các đường quy ước chạy song song với bề mặt của hệ phân chia qua các vết
độc tố T-2 của hướng phân chia thứ nhất và thứ hai.
Trong
trường hợp có độc tố T-2 trong chất chiết thử thì phải phát hiện được vết phát
quang của loại vi độc tố này tại giao điểm của các đường.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc
khẳng định sự tồn tại của độc tố T-2 phải được thực hiện nhờ chất benzidin đã
được diazôt hoá. Để thực hiện việc này cần chuẩn bị thêm một tấm hiện sắc ký
lớp mỏng với dung dịch chất chiết cần thử, dung dịch chuẩn độc tố T-2 và cả với
chuẩn nội bộ. Tiến hành kiểm hoá sơ bộ bằng cách vẩy lên tấm chuẩn dung dịch
nước 10% Natri cacbonat. Sấy tấm chuẩn ở nhiệt độ 105°C trong 20 phút. Sau đó vẩy tiếp lên
tấm chuẩn dung dịch benzidin đã điazôt hoá mới pha. Sau khi sấy, vẩy tiếp dung
dịch nước 2,5% axit clohydric. Khi có độc tố T-2 thì thuốc thử nhạy nitơ bị
nhuộm sang màu da cam, chứng tỏ sự có mặt của độc tố T-2 trong mẫu thử với nồng
độ không nhỏ hơn 500mg/kg. Khi xử lý tấm
chuẩn phải giới hạn vùng Rc của độc tố T-2.
6.2.2.
Phát hiện Zearalenon.
Soi
tấm chuẩn đã phơi khô ngoài không khí với các chuẩn và chuẩn nội bộ của
zearalenon trong phòng tối bằng tia cực tím có độ dài bước sóng 254 nm và cách
nguồn phát sáng 20 cm. Nếu tại khu vực Rc của chuẩn trong chất chiết xuất cần
thử có vết phát sáng màu vàng - xanh thì kết luận sơ bộ về sự có mặt của
zearalenon.
6.2.2.1
Khẳng định sự có mặt của Zearalenon.
Việc
khẳng định sự có mặt của Zearalenon được thực hiện nhờ chất benzidin điazot
hoá. Vùng Rj của chuẩn cần được vảy đều. Sau vài phút có thể quan sát thấy sự
hình thành các vết màu da cam chứng tỏ sự có mặt của zearalenon trong mẫu thử
với nồng độ không nhỏ hơn 100mg/kg.
7. Biên bản thử
Biên
bản thử phải có các số liệu sau:
1.
Tên thức ăn chăn nuôi và nguồn gốc của nó;
2.
Khối lượng mẫu;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.
Kết quả thử;
5.
Ngày tiến hành thử;
6.
Ký hiệu tiêu chuẩn này.
PHỤ
LỤC 1
SƠ
ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Độc tố T-2.
1
: 10 mm3 dung dịch cần thử
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4
và 5 : 5 mm3 dung dịch làm việc.
PHỤ
LỤC 2
SƠ
ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Zearalennon (độc tố
F-2).
1 : 10 mm3 dung dịch cần thử (đậm
đặc)
và
5 mm3 dung dịch tiêu chuẩn (50mg độc tố).
2
: 10 mm3 dung dịch cần thử (đậm đặc)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66