Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4993:1989 (ISO 7954:1987) về Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung đếm nấm men và nấm mốc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25°C

• Số hiệu: TCVN4993:1989
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 1989

Thành phần	Lượng
Chất chiết nấm men	5 g
Dectroza (C6H12O6)	20 g
Cloramphenicol (C11H12Cl2N2O5)	0,1 g*
Thạch	12 - 15 g**
Nước	1000 ml

*. Để thu được nồng độ cuối cùng của 10 mg/ml môi trường.

**. Theo hướng dẫn của người sản xuất.

Đun sôi để hòa tan các thành phần trên vào trong nước. Nếu cần thiết, điều chỉnh độ pH sao cho ngay sau tiệt trùng đạt 6,6. Cho môi trường thạch vào bình (4.5) thích hợp. Tiệt trùng môi trường ở 121 ± 1^oC trong 15 phút.

Chú thích: có thể thay thế cloramphenicol bằng oxytetraxiclin (C₂₂H₃₀N₂O₁₁). Trong trường hợp này cần chuẩn bị môi trường cơ bản như đã trình bày ở trên (trừ cloramphenicol, lấy từng phần 100 ml và tiệt trùng). Cũng chuẩn bị một dung dịch hydroclorua oxytetraxiclin 0,1 % (khối lượng) trong nước và tiệt trùng bằng lọc. Ngay trước khi sử dụng cho thêm 10 ml dung dịch vô trùng này vào 100 ml môi trường cơ bản được làm chảy trước và đã được giữ ở 45^oC.

IV. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THỦY TINH

Chú ý: Nên sử dụng các thiết bị sẵn có hơn là các dụng cụ thủy tinh nếu có các thông số kỹ thuật thích hợp

Các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

4.1. Thiết bị tiệt trùng khô (tủ sấy) hoặc tiệt trùng ướt (nồi hấp) (nồi hấp hoạt động độc lập hoặc là một bộ phận của thiết bị chung để chuẩn bị và phân phối môi trường).

Tiệt trùng các thiết bị sẽ tiếp xúc với môi trường nuôi, các chất pha loãng hoặc mẫu, đặc biệt các dụng cụ bằng chất dẻo (trừ các dụng cụ đã vô trùng được cung cấp) theo một trong các phương pháp sau:

...

...

...

b) Trong nồi hấp ở 121 ± 1^oC không ít hơn 20 phút.

4.2. Tủ ấm có khả năng giữ ở 25 ± 1^oC.

4.3. Bếp cách thủy có khả năng giữ ở 45 ± 1^oC.

4.4. Máy đo pH có bộ bù nhiệt với độ chính xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25^oC.

4.5. Chai hoặc bình.

Chú thích: Cần sử dụng chai hoặc bình có nút vặn kim loại không độc.

4.6. Pipet khắc độ chuyên dùng trong kiểm nghiệm vi khuẩn có dung tích định mức 10 ml và 1 ml với vạch chia tương ứng là 0,5 và 0,1 ml và đầu hút có đường kính danh nghĩa 2 - 3 mm.

4.7. Đĩa Petri có đường kính 90 - 100 mm

V. LẤY MẪU VÀ CHUẨN BỊ MẪU

...

...

...

Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì cần có sự thỏa thuận giữa các bên hữu quan.

VI. TIẾN HÀNH THỬ

6.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng. Xem TCVN 4881-89 (ISO 6887) và các tiêu chuẩn khác liên quan tới sản phẩm cần thử.

Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì cần có sự thỏa thuận giữa các bên hữu quan.

6.2. Cấy và nuôi

6.2.1. Sử dụng 2 đĩa Petri (4.7) vô trùng. Dùng pipet (4.6) vô trùng lấy 1 ml mẫu thử (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml huyền phù (nếu sản phẩm có dạng khác) lần lượt cho vào từng đĩa.

6.2.2. Sử dụng tiếp 2 đĩa petri nữa. Dùng pipet vô trùng khác lấy 1 ml dung dịch pha loãng 10^-1 lần lượt cho vào từng đĩa (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10^-2 (nếu sản phẩm có dạng khác).

Nếu cần, lặp lại thao tác trên với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

6.2.3. Từ bình (4.5) lấy thêm khoảng 15 ml môi trường thạch - chất chiết nấm men - dectroza - cloramphenicol (3.3) làm lỏng và đã được giữ ở 45 ± 1^oC trong bếp cách thủy (4.3) rồi lần lượt cho vào từng đĩa Petri. Thời gian từ khi kết thúc chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10^-1, nếu là sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường vào đĩa không quá 15 phút.

...

...

...

Chuẩn bị đĩa kiểm tra chứa 15 ml môi trường để kiểm tra độ tiệt trùng.

6.2.4. Úp các đĩa và đặt chúng vào tủ ấm (4.2) ở 25 ± 1 ^oC.

6.3. Đọc kết quả.

Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa sau khi nuôi 3, 4 và 5 ngày.

Sau 5 ngày, giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Nếu nấm mốc phủ kín trên các đĩa hoặc khó đếm được các khuẩn lạc tách biệt hẳn thì giữ lại số đếm được sau khi nuôi 4 ngày hoặc thậm chí 3 ngày. Trong trường hợp này, cần ghi lại thời gian nuôi là 3 hoặc 4 ngày vào biên bản.

Nếu cần có thể kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men và nấm mốc với khuẩn lạc của vi khuẩn dựa vào các hình thái của chúng.

VII. BIỂU THỊ KẾT QUẢ

7.1. Tính kết quả

7.1.1. Sử dụng số đếm được từ các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc.

...

...

...

Trong đó

ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;

n₁ - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ nhất;

n₂ - số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ hai;

d - độ pha loãng cho số đếm thứ nhất (ví dụ 10^-2)

7.1.3. Làm tròn kết quả tính được trong 7.1.2 tới 2 chữ số có ý nghĩa.Nếu số được làm tròn là 5 mà không có tiếp những chữ số có ý nghĩa thì cần làm tròn để chữ số kề ngay phía bên trái là số chẵn.

Ví dụ 28.500 được làm tròn thành 28.000

11.500 được làm tròn thành 12.000

...

...

...

Nếu không có khuẩn lạc trên đĩa huyền phù ban đầu (5.1), nếu sản phẩm bán dầu là đặc, thì số nấm men và nấm mốc trên 1 gam sản phẩm được tính là nhỏ hơn 10.

Nếu không có khuẩn lạc trên đĩa mẫu thử, nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng (6.1) thì số nấm men và nấm mốc trên 1 mililit sản phẩm được tính là nhỏ hơn 1.

7.2. Ví dụ tính kết quả

Số đếm nấm men và nấm mốc có thể cho kết quả như sau (nuôi 2 đĩa Petri đối với mỗi độ pha loãng)

Độ pha loãng 10^-2: 83 và 97 khuẩn lạc

Độ pha loãng 10^-3: 33 và 28 khuẩn lạc

Làm tròn kết quả quy định trong 7.1.3 sẽ được kết quả cuối cùng là 11.000. Do đó số nấm men và nấm mốc trên gam hoặc trên mililit sẽ là 1,1.10^4.

7.3. Độ chính xác

...

...

...

VIII. BIÊN BẢN THỬ

Trong biên bản thử cần ghi rõ:

- Phương pháp sử dụng;

- Thời gian nuôi;

- Kết quả;

- Phương pháp biểu thị kết quả;

- Các chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tự lựa chọn có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- Các chi tiết cần thiết để xác định mẫu.

___________________

...

...

...