Tiêu chuẩn TCVN 13282:2021 về Xác định hàm lượng tinh bột tổng số bằng phương pháp quang phổ

• Số hiệu: TCVN13282:2021
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2021

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13282:2021

SẢN PHẨM NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ SAU KHI THỦY PHÂN BẰNG AMYLOGLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE

Cereal products - Determination of total starch content by spectrophotometric method after hydrolysis by amyloglucosidase and α-amylase

Lời nói đầu

TCVN 13282:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 996.11 Starch (total) in cereal products. Amyloglucosidase-α-amylase method;

TCVN 13282:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SẢN PHẨM NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ SAU KHI THỦY PHÂN BẰNG AMYLOGLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE

...

...

...

CẢNH BÁO: Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng tinh bột tổng số trong các sản phẩm ngũ cốc bằng quang phổ sau khi thủy phân bằng các enzym amyloglucosidase và α-amylase.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1

Đơn vị hoạt độ α-amylase (unit of α-amylase activity)

U

Lượng α-amylase xúc tác để giải phóng 1 μmol p-nitrophenol trong thời gian 1 min từ p-nitrophenyl maltoheptaoside khoá mạch với sự có mặt của α-glucosidase và amyloglucosidase bão hòa ở 40 °C, pH 6,0.

...

...

...

Đơn vị hoạt độ amyloglucosidase (unit of amyloglucosidase activity)

U

Lượng amyloglucosidase xúc tác để giải phóng 1 μmol p-nitrophenol trong thời gian 1 min từ p-nitrophenyl β-maltoside với sự có mặt của β-glucosidase bão hòa, ở 40 °C, pH 4,5.

2.3

Hàm lượng tinh bột tổng số (total starch content)

Lượng chất xác định được theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng tinh bột tổng số được tinh bằng phần trăm khối lượng chất khô.

3  Nguyên tắc

Mẫu thử được hydrat hoá trong nước và tinh bột được thủy phân thành maltodextrin bởi α-amylase bền nhiệt ở 95 °C đến 100 °C. Maltosaccharid được thủy phân hoàn toàn thành glucose bằng amyloglucosidase ở nhiệt độ và pH xác định. Glucose được xác định bằng thuốc thử glucose oxidase- peroxidase. Mẫu thử có chứa hàm lượng amylose hoặc tinh bột bền lớn được xử lý trước bằng dimetyl sulfoxid ở 95 °C trước khi xử lý bằng α-amylase.

...

...

...

Sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác

4.1  Dung dịch đệm axit 3-(N-morpholino) propanesulfonic (MOPS), pH 7,0 chứa MOPS 50 mM, canxi clorua 5 mM và natri azid 0,02 %

Hòa tan 11,55 g MOPS trong 900 ml nước đựng trong bình định mức 1 L (5.16) và chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric 1 M (khoáng 17 mL). Thêm 0,74 g canxi clorua ngậm hai phân tử nước và 0,2 g natri azid. Pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch đệm ổn định ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).

4.2  Dung dịch α-amylase bền nhiệt, 10 mL, 3000 U/mL

Pha loãng 1 mL dung dịch α-amylase (trong glycerol 50 %) thành 30 mL bằng dung dịch đệm MOPS (4.1). Dung dịch đệm α-amylase bền nhiệt ổn định trong 3 năm khi được bảo quản đông lạnh (khoảng -20 °C).

4.3  Dung dịch amyloglucosidase, 10 mL, 200 U/mL

Sử dụng trực tiếp dung dịch này mà không cần pha loãng. Dung dịch nhớt, để phân phối dung dịch cần sử dụng bộ phân phối dung môi.

Dung dịch amyloglucosidase ổn định trong 3 năm ở 4 °C.

...

...

...

Chuẩn bị dung dịch đệm đậm đặc bằng cách hòa tan 13,6 g kali đihyđrophosphat, 4,2 g natri hydroxit và 3,0 g axit 4-hydroxybenzoic trong 90 mL nước, đựng trong bình định mức 100 mL (5.16). Chỉnh pH đến 7.4 bằng axit clohydric 2 M (16,7 mL HCl/100 mL) hoặc natri hydroxit 2 M (8,0 g NaOH/100 mL). Pha loãng bằng nước đến vạch, thêm 0,4 g natri azid và lắc cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Dung dịch đệm đậm đặc ổn định trong 3 năm ở 4 °C.

Để chuẩn bị hỗn hợp đệm glucose oxidase-peroxidase-aminoantipyrin, pha loãng 50 mL đệm đậm đặc đến 1,0 L. Sử dụng một phần của đệm đã pha loãng để hòa tan toàn bộ lọ chứa hỗn hợp đông khô glucose oxidase-peroxidase. Chuyển dung dịch thu được vào bình định mức 1 L (5.16) chứa dung dịch đệm pha loãng. Thuốc thử ổn định từ 2 tháng đến 3 tháng ở 4 °C và từ 2 năm đến 3 năm ở - 20 °C. Sự tạo màu với glucose có thể bền trong vài giờ.

CHÚ THÍCH: Glucose oxidase không được nhiễm β-và/hoặc α-glucosidase và phức màu bền ít nhất 60 min.

Kiểm tra sự tạo màu và độ ổn định của hỗn hợp đệm glucose oxidase-peroxidase-aminoantipyrin bằng cách ủ lặp lại hai lần, mỗi lần thêm 3,0 mL hỗn hợp đệm glucose oxidase-peroxidase-aminoantipyrine với dung dịch chuẩn glucose (100 μg tinh thể glucose trong 0,2 mL dung dịch natri benzoat 0,2%). Sau khi ủ 15 min, 20 min, 30 min và 60 min, xác định độ hấp thu, A, tại bước sóng 510 nm. Cần đạt được sự tạo màu tối đa trong vòng 20 min và màu sắc phải bền ít nhất 60 min tại 50°C.

4.5  Dung dịch etanol, khoảng 80 % (phần thể tích)

Pha loãng 80 mL etanol 95 % bằng nước đến 95 mL.

4.6  Dung dịch đệm natri axetat

4.6.1  Dung dịch đệm natri axetat, 200 mM, pH 4,5

Dùng pipet (5.12) lấy 11,8 ml axit axetic băng (1,05 g/mL) cho vào 900 mL nước, đựng trong bình định mức 1 L (5.16). Chỉnh pH đến 4,5 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (khoảng 60 mL). Thêm 0,2 g natri azid và pha loãng bằng nước đến vạch.

...

...

...

Dung dịch đêm ổn định trong 12 tháng ở nhiệt độ phòng.

4.6.2  Dung dịch đệm natri axetat, 50 mM, pH 4,5

Pha loãng dung dịch đệm natri axetat 200 mM (4.6.1) với nước theo tỷ lệ 1:3 (phần thể tích)

4.7  Dimetyl sulfoxid (DMSO).

4.8  Dung dịch chuẩn gốc D-glucose, 1 mg/mL

Trước khi chuẩn bị dung dịch, cần làm khô tinh thể glucose dạng bột (độ tinh khiết trên 97 %) trong 16 h ở 60 °C trong điều kiện chân không. Hòa tan 0,1 g glucose được cân chính xác đến 0,1 mg trong 100 ml nước. Tính lại nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn gốc dựa trên độ tinh khiết và lượng cân thực tế.

4.9  Dung dịch chuẩn làm việc D-glucose, 50 μg và 100 μg

Cho 50 μL và 100 μL dung dịch chuẩn gốc D-glucose (4.8) vào các ống nghiệm riêng rẽ. Thêm nước vào từng ống đến 100 μL.

Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi sử dụng.

...

...

...

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Máy nghiền ly tâm, có roto 12 răng, có sàng cỡ lỗ 0,5 mm hoặc tương tự.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng máy nghiền ly tâm kiểu xoáy đối với các lượng mẫu nhỏ.

5.2  Máy ly tâm, có thể ly tâm ở gia tốc khoảng 1000 g.

5.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.4  Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 50 °C ± 0,1 °C.

5.5  Nồi cách thủy đun sôi, có thể đun sôi ở nhiệt độ 95 °C đến 100 °C

5.6  Máy đo pH

...

...

...

5.8  Đồng hồ bấm giờ

5.9  Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở 103 °C ± 1 °C.

5.10  Máy do quang phổ, có thể đo được ở bước sóng 510 nm.

5.11  Pipet tự động, có thể phân phối các lượng 100 μL và 200 μL, có các đầu tip dùng một lần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng bộ phân phối dung môi bằng tay được kiểm soát.

5.12  Pipet có khoảng trống dương, có đầu tip 5,0 mL có thể phân phối chính xác các lượng 100 μL và 200 μL; đầu tip 50 mL có thể phân phối các lượng 3,0 mL.

5.13  Bộ phân phối dung môi, dung tích 500 mL, dùng để phân phối các lượng 3 mL, được sử dụng cho hỗn hợp đệm glucose oxidase-peroxodase-amioantipyrin

5.14  Ống nghiệm, bằng thủy tinh, dung tích 17 mL, kích thước 16 mm × 120 mm, dùng để ly tâm ở gia tốc 1000 g và kích thước 18 mm × 150 mm.

5.15  Giấy lọc nhanh, không tro.

...

...

...

5.17  Chai, bằng chất dẻo miệng rộng.

6  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền 50 g mẫu thử bằng máy nghiền (5.1) sao cho mẫu lọt qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm. Chuyển mẫu thử đã nghiền vào chai (5.17) và trộn đều bằng cách lắc và đảo chiều.

7.2  Chuẩn bị mẫu trắng

Dùng pipet (5.11) lấy 0,1 mL nước cho vào các ống nghiệm và tiến hành xác định hàm lượng tinh bột tổng số sử dụng quy trình phân tích chuẩn (7.3.1) từ bước 7.3.1.6.

...

...

...

7.3.1  Quy trình chuẩn α-amylase/amyloglucosidase (AA/AMG)

Tiến hành với dung dịch chuẩn làm việc D-glucose (4.9) (lặp lại 4 lần), mẫu trắng (7.2) (lặp lại 2 lần) và tinh bột ngô (4.10) cho từng lần thử. Sử dụng mẫu thử trắng để chỉnh máy đo quang phổ (5.10) về 0.

7.3.1.1  Dùng cân (5.3) cân khoảng từ 90 mg đến 100 mg mẫu thử cho vào ống nghiệm (5.14). Gõ nhẹ ống để đảm bảo tất cả mẫu thử đều rơi hết xuống đáy ống.

CHÚ THÍCH: Khi phân tích các sản phẩm ngũ cốc có chứa hàm lượng glucose cao (ví dụ: các loại ngũ cốc ăn sáng) và tất cả các sản phẩm chưa biết hoặc không chắc chắn về thành phần (ví dụ: các sản phẩm có chứa glucose tự do hoặc maltodextrin) thì chiết sơ bộ từ 90 mg đến 100 mg mẫu thử đã cân hai lần, mỗi lần bằng 10 mL dung dịch etanol 80 % (4.5), ở 80°C trong 10 min. Ly tâm mẫu thử trong máy ly tâm (5.2) ở gia tốc 1000 g và loại bỏ dịch nổi phía trên, sử dụng phần cặn để phân tích.

7.3.1.2  Cho 0,2 mL dung dịch etanol 80 % (4.5) vào ống và trộn trên máy trộn Vortex (5.7) để mẫu thử thấm đều dung môi. Thêm 3,0 mL α-amylase bền nhiệt (4.2) và trộn ống trên máy trộn Vortex (5.7) để mẫu được phân tán đều.

7.3.1.3  Chuyển ngay ống vào nồi cách thủy (5.5) đun sôi trong 2 min, lấy ống ra và trộn mạnh trên máy trộn Vortex (5.7) để đảm bảo mẫu được phân tán hoàn toàn. Đặt lại ống vào nồi cách thủy (5.5) đun sôi thêm 3 min và sau đó trộn mạnh ống trên máy trộn Vortex (5.7).

CHÚ THÍCH: Một phần mẫu bị có thể bị dính lên thành ống nghiệm, tuy nhiên không ảnh hưởng đến quá trình phân tích vì mẫu đã được xử li bằng enzym.

7.3.1.4  Đặt ống vào nồi cách thủy (5.4) ở 50 °C và để ổn định trong 5 min. Thêm 4,0 mL dung dịch đệm natri axetat 200 mM (4.6.1) và 0,1 mL dung dịch amyloglucosidase (4.3) và trộn mạnh trên máy trộn Vortex (5.7). Đậy nắp ống và ủ ở 50 °C trong nồi cách thủy (5.4) trong 30 min.

7.3.1.5  Chuyển định lượng toàn bộ lượng chứa trong ống vào bình định mức 100 mL (5.16). Sử dụng nước cất để tráng rửa ống. Pha loãng bằng nước đến vạch.

...

...

...

Trộn kỹ lượng chứa trong bình rồi ly tâm trong 10 min ở gia tốc 1000 g. Lọc dung dịch qua giấy lọc (5.15).

7.3.1.6  Lấy 0,1 mL từng dịch lọc cho vào 2 ống nghiệm riêng rẽ.

7.3.1.7  Thêm 3,0 mL hỗn hợp đệm glucose oxidase-peroxidase-aminoantipyrin (4.4) vào mỗi ống (chứa dung dịch mẫu thử và tinh bột ngô, mẫu trắng và dung dịch chuẩn glucose) và ủ ở 50 °C trong 20 min.

7.3.1.8  Đo và đọc giá trị độ hấp thụ A của mỗi dung dịch thử ở bước sóng 510 nm so với mẫu trắng. Tính giá trị độ hấp thụ trung bình của mẫu thử và sử dụng Công thức tính (1).

7.3.2  Quy trình cải biến (DMSO/AA/AMG) (áp dụng đối với các sản phẩm có chứa tinh bột bền)

7.3.2.1  Dùng cân (5.3) cân khoảng 90 mg đến 100 mg phần mẫu thử đã nghiền cho vào ống nghiệm (5.14). Gõ nhẹ ống để đảm bảo tất cả mẫu thử đều rơi xuống đáy của ống.

CHÚ THÍCH: Khí phân tích các sản phẩm ngũ cốc có chứa hàm lượng glucose cao, chiết sơ bộ từ 90 mg đến 100 mg mẫu thử đã cân, mỗi lần bằng 10 mL dung dịch etanol 80 % (4.5), ở 80°C trong 10 min. Ly tâm mẫu thử trong máy ly tâm (5.2) ở gia tốc 1000 g và loại bỏ dịch nổi phía trên. Sử dụng phần cặn để phân tích

7.3.2.2  Cho 0,2 mL dung dịch etanol 80 % (4.5) vào ống và trộn trên máy trộn Vortex (5.7) để mẫu thử thấm đều dung môi.

7.3.2.3  Thêm ngay 2 mL dung dịch DMSO (4.7) và trộn trên máy trộn Vortex (5.7). Đặt ống vào nồi cách thủy đun sôi (5.5) trong 5 min. Thêm 3,0 ml dung dịch α-amylase bền nhiệt (4.2). Trộn ống trên máy trộn Vortex (5.7) để mẫu được phân tán đều.

...

...

...

8  Tính kết quả

Hàm lượng tinh bột tổng số có trong mẫu thử, l, tính bằng phần trăm (%) khối lượng chất khô theo Công thức (1):

(1)

Trong đó:

A

là độ hấp thụ của dung dịch thử so với mẫu trắng;

F

là hệ số chuyển đổi từ giá trị độ hấp thụ sang μg glucose (= 100 μg glucose/giá trị độ hấp thụ của 100 μg glucose;

...

...

...

là hệ số hiệu chỉnh thể tích, tức là lấy 0,1 mL từ 100 mL;

1/1000

là hệ số chuyển đổi đơn vị từ μg sang mg;

100/W

là hệ số chuyển đổi sang 100 mg mẫu thử;

W

là khối lượng mẫu thử, tính bằng miligam (mg);

162/180

là hệ số chuyển đổi từ glucose tự do sang glucose dạng khan.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

...

...

...

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định hàm lượng tinh bột tổng số trong các sản phẩm ngũ cốc chế biến sử dụng amyloglucosidase-a-amylase

Mẫu

Thức ăn cho gà dạng viên

Bánh mì trắng

Đậu xanh

Tinh bột ngô có hàm lượng amylose cao

Bột mì trắng

Tinh bột mì

...

...

...

Mì ống

Tinh bột ngô có hàm lượng amylose cao (phương pháp DMSO)

Tinh bột mì (phương pháp DMSO)

Số phòng thử nghiệm tham gia

32

32

31

26

31

...

...

...

31

31

31

31

Hàm lượng tinh bột tổng số trung bình^a, %

44,9

60,9

38,5

74,8

...

...

...

85,3

38,5

67,5

84,2

84,7

Độ ẩm, %

11,4

10,6

12,4

...

...

...

12,8

12,2

8,8

11,8

13,4

12,2

Giới hạn lặp lại, r^b

3,9

4,5

...

...

...

6,2

5,6

7,8

4,2

7,3

5,0

7,3

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r^a

1,4

...

...

...

1,3

2,2

2,0

2,8

1,5

2,6

1,8

2,6

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

...

...

...

2,6

3,4

2,9

2,9

3,3

3,9

3,9

2,1

3,1

...

...

...

5,9

8,4

5,3

8,1

9,2

5,3

9,0

6,7

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R^a

2,1

3,0

1,9

3,6

2,9

3,3

1,9

3,2

...

...

...

3,9

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

4,7

4,9

4,9

4,8

4,3

3,9

4,9

...

...

...

2,9

4,6

Giá trị Horrat

2,08

2,27

2,12

2,30

2,03

1,90

...

...

...

2,22

1,41

2,24

^a Được tính “bằng”.

^br = 2,8 × s_r.

^c R = 2,8 × s_R.