Mồi
|
Trình tự nucleotit
|
Pf - 1
|
5’-ACG-TTG-GAG-GTT-CGT-CCT-TCA-g-3’
|
Pr - 1
|
5-TCA CCC CCT TGC TTC TCA TTG T-3
|
Cặp mồi Pf -1/Pr -1 dùng để khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn
NHP có kích thước 441 bp.
Chuẩn bị mồi:
- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi
lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để
hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc
bằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).
3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng
Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix
phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa
trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối
chứng âm. Sau đó hút 22,5µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi ký
hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm.
3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR
Thêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR
chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,
KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxynucleotide 200 mM, nồng độ 0,5 µM mỗi
mồi Pf -1 và Pr -1, nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích
25 µl.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ví dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go
Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.
Bảng 2 – Hỗn hợp phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích cho 1 mẫu, µl
Nồng độ cuối cùng
Promega Gotag Green Master Mix, 2X
12,5
1 X
Pr -1 mồi
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5 µM
Pr -1 mồi
0,625 (20 µM)
0,5 µM
DNA mạch khuôn
2,5
Nước
8,75
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.
Chu
trình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.
Bảng 3 – Chu trình nhiệt của phản
ứng PCR
Bước
Nhiệt độ/thời gian
Số chu kỳ
Biến tính
94 °C/30 s
35
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
58 °C/30 s
Kéo dài mạch
72 °C/1 min
Kéo dài mạch
72 °C/5 min
1
Giữ ổn định
4 °C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.2.1.5.3. Chạy điện di
3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel
Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung
dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm
xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì cho vào 5 µl etidi bromua vào mỗi 100 ml. Lắc
nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch
vào khuôn.
Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8
cm.
Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X
hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới
khi ngập bản gel.
3.2.1.5.3.2. Điện di
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán
kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một giếng trên bản gel.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng
khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan
sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng
thạch agarose, dừng quá trình điện di.
CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành
điện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ
vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.
3.2.1.5.4. Đọc kết quả
Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết
quả với tia UV bước sóng 302 nm.
Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang
DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.
Bảng 4 – Kết quả điện di
Giếng
Vạch 441 bp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thang DNA
Phân vạch rõ ràng và sáng theo
kích thước sử dụng
Điện di tốt
Mẫu đối chứng dương tính
Có
Hỗn hợp phản ứng PCR tốt
Không
Mẫu đối chứng dương tính hỏng,
enzym hỏng
Mẫu đối chứng âm tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không ngoại nhiễm
Có
Bị ngoại nhiễm
Mẫu
Có
Dương tính NHP
Không
Âm tính với NHP
Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích
thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA
phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.2.2. Phương pháp mô học
3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử
- Dung dịch Davidson (xem A.1).
- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).
- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).
- Xylen.
- Cloroform.
- Axit picric (dung dịch bão hòa).
- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
- Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4);
- Natri Hydro phosphat (NaH2PO4);
3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán
bệnh và cụ thể như sau:
- Kính giải phẫu
- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu
kéo các loại, lam kính và lamen
- Lọ nhỏ cố định mẫu
- Bình rót parafin
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Máy cắt mẫu microtome
- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ
- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu
- Kính hiển vi quang học
- Cassete
- Khung đúc mẫu.
3.2.2.3. Lấy mẫu
Thu những mẫu tôm có dấu hiệu không bình thường, cơ thể yếu,
bơi lội lờ đờ, biếng ăn và ruột rỗng, giảm sức tăng trưởng rõ rệt, tỷ lệ trọng
lượng, chiều dài thân thấp (mỏng đuôi).
Tôm có vỏ mềm và cơ thể nhũn; mang đen hoặc sẫm màu; bị
nhiều vi sinh vật cơ hội bám trên mặt vỏ; vỏ bị nhiễm vi khuẩn, bao gồm các tổn
thương loét lớp cutin hoặc phần phụ bị ăn mòn hóa đen; bị phồng rộp các tế bào
sắc tố dẫn đến sự xuất hiện các rìa sẫm màu ở các náng đuôi và chân bụng. Khối
gan tụy có thể bị teo.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.2.2.4. Cách tiến hành
3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
Cố định trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm
Postlarvae có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số
tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt
độ phòng.
Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần
đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng thuốc
Davidson tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lượng thuốc dùng từ 0,1
ml đến 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch
Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ,
chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm
trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay
trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.
3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định
Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến
60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min
đến 60 min mỗi lần.
3.2.2.4.3. Làm trong mẫu
Ngâm sang lọ xylen 1, để trong 30 min đến 60 min.
Ngâm sang lọ xylen 2, để trong 30 min đến 60 min.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đúc khuôn: đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập
trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn
lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
3.2.2.4.4. Cắt mẫu
Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để
trên mặt khay đá.
Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt
chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước
30 °C đến 35 °C; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.
3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E
Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3
min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và
etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ
3 min đến 5 min.
Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau
đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm
eosin từ 1 min đến 2 min.
Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %,
etanol 90 % và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min chuyển sang xylen
hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada.
Để khô và soi kính.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật
kính có độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1 000 X).
Mô học gan tụy của tôm bị bệnh hoại tử gan tụy thể hiện đặc
điểm bệnh lý sau: Các vùng mô gan tụy bị hoại tử, bắt màu đồng đều của thuốc
nhuộm, hoàn toàn không còn nhìn thấy cấu trúc tế bào và mô gan tụy đồng thời
xuất hiện dày đặc những tế bào máu bao vây xung quanh những vùng bị hoại tử.
Trên lát cắt mô học gan tụy với thuốc nhuộm haematoxylin và eosin cho thấy dấu
hiệu của sự viêm teo từ trung bình tới rất nặng của ống gan tụy. Các tế bào
biểu mô gan tụy khi bị viêm teo hoại tử chuyển từ hình trụ tròn sang hình khối,
hoặc có thể bị phình to và chứa một số lớn vi khuẩn tự do giống với rickettsia,
gram âm nằm trong nguyên sinh chất của các tế bào.
Ở tôm P, vannamei giai đoạn ấu niên bị nhiễm bệnh NHP
nặng, mãn tính biểu mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng
(dịch tràn hoặc các khu vực có nước trong gan tụy).
Độ phóng đại 10000X tôm bị bệnh trong tế bào chất có nhiều
vi khuẩn bệnh NHP dạng hình que và hình xoắn.
4. Báo cáo kết quả chẩn đoán
Tôm được xác định nhiễm bệnh NHP khi có đặc điểm dịch tễ,
triệu chứng lâm sàng của bệnh và dương tính một trong hai phương pháp sau:
- Kết quả phản ứng PCR dương tính;
- Mẫu cắt mô có bệnh tích của NHP.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Quy
định)
THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ
A.1. Dung dịch Davidson
Etanol 95 %: 330
ml
Formalin (formaldehyd 37 %): 220
ml
Axit axetic đậm đặc: 115
ml
Nước: 335
ml
A.2. Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin – Mayer)
Hematoxylin dạng tinh thể: 1
g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Amoni alum [NH4Al(SO4)2]
hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g
Axit xitric: 1
g
Cloral hydrat: 50
g
Nước: 1
000 mg
Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và
amomi alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit xitric và cloral hydrat
rồi lọc qua giấy lọc.
Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
A.3. Thuốc nhuộm eosin
Eosin Y: 1 g
Etanol 70 %: 1 lít
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa
tan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.
Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bacterial disease of shrimp C.10 Neccrotising Hepatopancreatitis
(NHP). Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases.207 – 10
[2] Boris Brinez, Fernando Aranguren, Marcela Salazar (2003)
Fecal samples as a DNA source for the diagnosis of necrotizing
hepatopancreatitis (NHP) in Penaeus vannamei broodstock. Dis Aquat
Org Vol. 55: 69 – 72
[3] Diseases of crustaceans, Bacterial diseases –
Necrotising hepatopancreatitis. Sourced form AGDAFF-NACA (2007). Aquatic
Animal Diseases Significant to Asia-Pacific
[4] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị
Muội. Bệnh học thủy sản. 2004. 232-235.
[5] Loy JK, Frelier P, Varner P, Templeton JW (1996)
Detection of the etiologic agent of necrotizing hepatopancreatitis in cultured Penaeus
vannamei from Texas and Peru by polymerase chain reaction. Dis Aquat Org
Vol 25:117 – 122
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66