Loài
|
Tăng sinh
trong canh dinh dưỡng
|
Các chỉ
tiêu sinh hóa
|
0 % NaCl
|
1 % NaCl
|
Oxidase
|
Nitrate
|
ADH
|
LDC
|
ODC
|
Nhóm 1
|
Vibrio cholera
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
Vibrio mimicus
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
Nhóm 2
|
Vibrio metschinikovii
|
-
|
+
|
-
|
-
|
v
|
v
|
-
|
Nhóm 3
|
Vibrio cincinattiensis
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
v
|
-
|
Nhóm 4
|
Vibrio hollisae
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
Nhóm 5
|
Vibrio damselae
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
v
|
-
|
Vibrio fluvialis
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
Vibrio furnissii
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
Nhóm 6
|
Vibrio
alginolyticus
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
v
|
Vibrio
parahaemolyticus
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
Vibrio vulnificus
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
v
|
Vibrio carchariae
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
-
|
+ ≥ 90% dương tính
|
|
|
|
ADH (Arginine dihydrolase)
|
- < 10% dương
tính
|
|
|
|
LDC (Lysine decarboxylase)
|
v 10% - 89% dương tính
|
|
|
|
ODC (Onithine decarboxylase)
|
CHÚ THÍCH: Việc định danh vi khuẩn dựa vào các phản ứng sinh
hóa, có thể sử dụng máy định danh vi
khuẩn tự động (máy định
danh Vitek2 hoặc máy định danh vi khuẩn tự động phù hợp khác) hoặc bộ kit định danh
cho kết quả tương đương.
|
6.2.2 Phương pháp
PCR
6.2.2.1 Nguyên tắc
Phương pháp phân tích này nhằm xác định
ADN của mầm bệnh có hay không tồn tại trong mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định
đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được phát hiện thông qua kỹ thuật PCR,
Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh tăng sinh hoặc từ mẫu mô bệnh của
tôm với các biểu
hiện
triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.
6.2.2.2 Tăng sinh vi
khuẩn
Mẫu sau khi xử lý (xem 6.1.2) được
tăng sinh trong môi trường pepton kiềm (xem 3.3.1) theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm
(xem 4.1.3) từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.
CHÚ Ý: Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu
chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà
không cần phải qua bước tăng sinh (Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 %
với dung dịch PBS (xem Phụ lục A). Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch
nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)
6.2.2.3 Tách chiết
ADN
(Xem thêm phụ lục C)
Mẫu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để
chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt
(xem phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của
nhà sản xuất.
Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở
4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 4.1.1) chờ
đến khi tiến hành xét nghiệm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các bước tiến hành phản ứng tham khảo
Phụ lục D.
Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây
bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính sử dụng cặp mồi AP3. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có
DNase/RNase (xem 3.3.4).
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt
chu trình nhiệt chạy
phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Taq PCR
Master Mix kit, Catalogue
Number: 2014431) của hãng Qiagen.
Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi
khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra
khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.
LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu
cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp
phản ứng
6.2.2.5 Điện di và đọc
kết quả
Các bước tiến hành tham khảo phụ lục
D, D.3
Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy
đọc gel theo Bảng 2:
Bảng 2 - Kết quả điện
di
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vạch 336 bp
Kết quả
Thang chuẩn ADN
Các vạch sáng rõ ràng
Điện di tốt
Mẫu đối chứng dương
Có
Hỗn hợp phản ứng PCR tốt
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mẫu đối chứng âm
Có
Bị tạp nhiễm
Không
Không tạp nhiễm
Mẫu thử
Có
Dương tính với AHPND
Không
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đánh giá kết quả: Điều kiện phản ứng
được công nhận khi: đối chứng dương có kích thước vạch sáng 336 bp so với thang
chuẩn và đối chứng âm không xuất hiện bất kỳ vạch sáng nào.
Mẫu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời
với đối chứng dương có cùng vạch
sáng có chiều dài 336 bp so với thang chuẩn.
Mẫu âm tính là mẫu không có vạch sáng
có chiều dài 336 bp
6.2.3 Phương pháp
Realtime PCR
6.2.3.1 Nguyên tắc
Xem 6.2.2.1
6.2.3.2 Tăng sinh vi
khuẩn
Xem 6.2.2.2
6.2.3.3 Tách chiết
ADN
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.2.3.4 Tiến hành phản
ứng
Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục
E.
Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi
khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi và mẫu dò VpPirA.
Chuẩn bị các mồi và mẫu dò ở nồng độ
10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.3.4).
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt
chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện
vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng,
Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix
- UDG, Cat. No.: 11730-0172) của hãng Invitrogen
LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu
cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp
phản ứng
6.2.3.5 Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu
đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng
dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng
± 2 Ct của mẫu đã
được chuẩn độ trước đó.
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị
Ct < 35 được
coi là dương tính. Mẫu không có
giá trị Ct là âm tính.
Mẫu có giá trị
35 ≤ Ct ≤ 40 được coi
là nghi ngờ.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7 Kết luận
Tôm được xác định là mắc bệnh AHPND do
vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh
tích điển hình và kết quả dương tính với một trong các xét nghiệm: phản ứng PCR
hoặc phản ứng Realtime PCR
Phương pháp nuôi cấy, phân lập3)
và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus.
Vì vậy cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc
tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn này.
Phụ
lục A
(Quy
định)
Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử
A.1 Dung dịch muối
đệm phosphat (PBS) pH 7,2
A.1.1 Thành phần:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8,0 g
Kali clorua (KCl)
0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)
1,15g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)
0,2 g
Nước cất
1000 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan natri clorua, kali clorua,
natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong
khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong
khoảng 3 tháng.
GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS
thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.2 Môi trường thạch
chọn lọc TCBS
A.2.1 Thành phần:
Yeast extract
5,0 g
Proteose Peptone
10,0 g
Sodium thiosulfate
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sodium citrate
10,0 g
ŌX gall
5,0 g
Sodium cholate
3,0 g
Saccharose
20,0 g
Sodium chloride
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ferric citrate
1,0 g
Bromothymol blue
0,04 g
Thymol blue
0,04 g
Thạch
Từ 8,0 đến 18 g4)
Nước cất
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2.2 Chuẩn bị:
Hòa tan các thành phần hoặc môi trường
hoàn chỉnh môi trường khô
trong nước, đun đến khi sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở
25°C, nếu cần. Không hấp áp lực.
GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch
TCBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.3 Môi trường thạch
dinh dưỡng TSA 1% muối
A.3.1 Thành phần:
Peptone từ casein
15,0g
Peptone từ đậu nành
5,0g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
10,0g
Thạch
15,0g
Nước cất
1000ml
A.3.2 Chuẩn bị:
Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai
tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH,
sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt
độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội đến 45 - 50°C, trộn đều và đổ đĩa.
GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch
TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.4 Môi trường
pepton kiềm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Peptone 20,0 g
NaCl 20,0 g
Nước cất 1000 ml
A.4.2 Chuẩn bị:
Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai
vô trùng. Điều
chỉnh pH, sao cho sau
khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.
Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút.
GHI CHÚ: Có thể sử dụng peptone kiềm
thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.5 Các môi trường
nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Sử dụng card định danh vi khuẩn gram
âm hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Quy
định)
Phương pháp nhuộm Gram
B.1 Thuốc nhuộm
B.1.1 Dung dịch kết
tinh tím
Tím tinh thể
2,0 g
Ethanol 95%
20,0 ml
Amoni oxalat
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước cất
80,0 ml
Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa
tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc
cho tan hết.
B.1.2 Dung dịch
fucshin đậm đặc
Basic fucshin
1 g
Ethanol 95%
10 ml
Phenol (axit phenic)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước cất
100 ml
Khi dùng, pha loãng dung dịch
fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.
B.1.3 Dung dịch lugol
Kali iodua
2 g
Iodua tinh thể
1 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
200 ml
Nghiền Kali iodua
và iodua tinh thể. cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.
B.1.4 Cồn-axeton
Ethanol 95%
3 phần
Axeton
1 phần
B.2 Tiến hành
nhuộm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nhỏ dung dịch lugol: để 1
phút, rửa nước nhanh, để khô.
- Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để
khô.
- Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước,
thấm khô hoặc sấy
khô.
B.3 Xem tiêu bản
- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem
tiêu bản bằng kính
hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.
- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.
- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.
Phụ
lục C
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương
pháp sốc nhiệt
Cụ thể, gồm các bước như sau:
- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống
eppendorf. Ly tâm 10000
vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.
- Huyền phù sinh khối trong 1ml nước
muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều
trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại
bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.
- Bổ sung 250 µl nước muối sinh lý đã
được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.
- Đặt ống eppendorf vào block
nhiệt khô 95°C trong 20 phút.
- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm
nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.
- Ly tâm ở nhiệt độ từ
20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.
- Chuyển 100 µl dịch nổi bên trên chứa
ADN sang 1 ống mới.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ
lục D
(Tham
khảo)
Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi AP3
D.1 Trình tự cặp
mồi
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen
của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND theo Bercovier TK
(OIE, 2017)
Bảng D.1 -
Trình tự cặp mồi
Mồi
Trình tự
(5'-3')
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
bp
Mồi xuôi AP3-F
ATG AGT AAC
AAT AT A AAA CAT GAA AC
336
Mồi ngược
AP3-R
GTG GTA ATA
GAT TGT ACA GAA
D.2 Thực hiện phản
ứng PCR
Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và
kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Thành phần cho 1 phản ứng được nêu
trong bảng D.2
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.2 -
Thành phần phản ứng PCR
STT
Thành phần
Nồng độ
µM
Thể tích
µl
1
Nước không có DNAse/RNAse
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8,5
2
Dung dịch Master mix 2X
12,5
3
Mồi xuôi AP3-F
10
0,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi ngược AP3-R
10
0,5
Tổng thể tích
22
Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống
phản ứng:
- Mẫu đối chứng dương: cho 3 µl mẫu ADN tách chiết
đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.
- Mẫu đối chứng âm: cho 3 µl nước không có enzyme
phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Vibrio
parahaemolyticus.
- Mẫu thử: cho 3 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản
ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng D.3 -
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR*
Nhiệt độ
°C
Thời gian
Số chu kỳ
94 (*)
3 phút (*)
1
94
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
30
53
30 giây
72
40 giây
72
5 phút
1
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*)
chỉ phù hợp với kít HotstarTag®Master Mix, Cat. No.: 203445
(Qiagen).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Chuẩn bị thạch Agarose (3.3.5) 1,5 %
pha trong dung dịch TBE (3.3.5) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.3.6) (ví dụ như:
gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).
- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch
vào bể điện di có chứa dung
dịch TBE 1X.
- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm
PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.3.7)).
- Sử dụng thang chuẩn ADN (3.3.8).
LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR
phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.
- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với
dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45
phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.
- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện,
lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp,
chụp ảnh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Tham
khảo)
Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi VpPirA
E.1 Trình tự cặp
mồi và đoạn dò
Bảng E.1 -
Trình tự cặp mồi và đoạn dò
Mồi và đoạn
dò
Trình tự
(5' - 3')
Mồi xuôi
VpPirA-F
TTG GAC TGT CGA ACC AAA CG
Mồi ngược
VpPirA-R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Đoạn dò
VpPirA-P
FAM - AGA CAG CAA ACA TAC ACC TAT
CAT CCC GGA - TAMRA
E.2 Thực hiện phản
ứng Realtime PCR
Sử dụng cặp mồi và đoạn dò đã được chuẩn
bị và kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần cho 1 phản ứng
được nêu trong bảng E.2.
VÍ DỤ: sử dụng bộ kít Master mix
Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của
hãng Invitrogen.
Bảng E.2 -
Thành phần phản ứng Realtime PCR
STT
Thành phần
Nồng độ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(µl)
1
Nước không có DNAse/RNAse
5,5
2
Dung dịch SuperMix
2X
12,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Mồi xuôi VpPirA-F
10 pM
0,75
4
Mồi ngược VpPirA-R
10 pM
0,75
5
Đoạn dò VpPirA-P
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,5
Tổng thể tích
20
- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master
mix tiến hành:
+ Cho 20 µl hỗn hợp
Master mix vào ống PCR 0,2 ml;
+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết
vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;
LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng
PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với
mẫu kiểm tra.
+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh
khiết không có ADNse/RNase vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp
Master mix.
+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương
chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh
AHPND (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh AHPND) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp
Master mix.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng E.3 -
Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR *
Nhiệt độ
Thời gian
Số chu kỳ
50 °C (*)
2 phút (*)
1
95 °C (*)
2 phút (*)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15 giây
40
60 °C
30 giây
(Ghi nhận
tín hiệu quang)
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*)
chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.:
11730-017.
PHỤ
LỤC F
(Quy
định)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hình F.1 - Sơ
đồ chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trong phòng thí nghiệm
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] OIE 2018 chapter 2.2.1 Acute
Hepatopancreatic Necrosic Disease.
[2] TCCS 02:
2014/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ sở phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có
gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật PCR (Quyết định
ban hành số 934/QĐ-TY-TS ngày 12 tháng 12 năm 2014 của Cục trưởng Cục Thú
y).
[3] TCCS 01:
2016/TY-TS: Quy trình xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Quyết định
ban hành số 453/QĐ-TY-TS ngày 01 tháng 07 năm 2016 của Cục truởng Cục Thú y).
[4] Jee Eun Han, Kathy F.J.Tang,
Carlos R. Pantoja, Brenda L. White, Donald V. Lightner, 2015. qPCR
assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute
hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio
parahaemolyticus. Aquaculture 442 (2015) 12-15.
[5] ISO
20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for
sample preparation for qualitative detection.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[7] Chapter VI -
Laboratory identification of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the
Diagnosis of Vibrio cholerae, Centers for Disease Control and Prevention.
1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện
thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định
sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử
dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết
quả tương đương.
2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện
thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm
của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
3) Phương
pháp nuôi cấy phân lập thường được sử dụng để
phục vụ kiểm tra kháng sinh đồ cũng như lưu
giữ gốc vi khuẩn gây bệnh dùng cho các nghiên cứu.
4) Tùy thuộc sức đông của thạch