Từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...

Đăng nhập

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19

Số hiệu: TCVN8710-19:2019 Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành: *** Người ký: ***
Ngày ban hành: Năm 2019 Ngày hiệu lực:
Tình trạng: Đã biết

Loài

Tăng sinh trong canh dinh dưỡng

Các chỉ tiêu sinh hóa

0 % NaCl

1 % NaCl

Oxidase

Nitrate

ADH

LDC

ODC

Nhóm 1

Vibrio cholera

+

+

+

+

-

+

+

Vibrio mimicus

+

+

+

+

-

+

+

Nhóm 2

Vibrio metschinikovii

-

+

-

-

v

v

-

Nhóm 3

Vibrio cincinattiensis

-

+

+

+

-

v

-

Nhóm 4

Vibrio hollisae

-

+

+

+

-

-

-

Nhóm 5

Vibrio damselae

-

+

+

+

+

v

-

Vibrio fluvialis

-

+

+

+

+

-

-

Vibrio furnissii

-

+

+

+

+

-

-

Nhóm 6

Vibrio alginolyticus

-

+

+

+

-

+

v

Vibrio parahaemolyticus

-

+

+

+

-

+

+

Vibrio vulnificus

-

+

+

+

-

+

v

Vibrio carchariae

-

+

+

+

-

+

-

+ 90% dương tính

 

 

 

ADH (Arginine dihydrolase)

- < 10% dương tính

 

 

 

LDC (Lysine decarboxylase)

v 10% - 89% dương tính

 

 

 

ODC (Onithine decarboxylase)

CHÚ THÍCH: Việc định danh vi khuẩn da vào các phn ứng sinh hóa, thể sử dng máy đnh danh vi khuẩn t động (máy định danh Vitek2 hoặc máy định danh vi khuẩn tự động phù hợp khác) hoặc bộ kit định danh cho kết quả tương đương.

6.2.2  Phương pháp PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này nhằm xác định ADN của mầm bệnh có hay không tồn tại trong mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được phát hiện thông qua kỹ thuật PCR, Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh tăng sinh hoặc từ mẫu mô bệnh của tôm với các biểu hiện triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

6.2.2.2  Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý (xem 6.1.2) được tăng sinh trong môi trường pepton kiềm (xem 3.3.1) theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm (xem 4.1.3) từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.

CHÚ Ý: Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần phải qua bước tăng sinh (Mu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch PBS (xem Phụ lục A). Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)

6.2.2.3  Tách chiết ADN (Xem thêm phụ lục C)

Mu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 4.1.1) chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục D.

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi AP3. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (xem 3.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Taq PCR Master Mix kit, Catalogue Number: 2014431) của hãng Qiagen.

Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

LƯU Ý: Mu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.2.5  Điện di và đọc kết quả

Các bước tiến hành tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo Bảng 2:

Bảng 2 - Kết quả điện di

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Vạch 336 bp

Kết quả

Thang chuẩn ADN

Các vạch sáng rõ ràng

Điện di tốt

Mu đối chứng dương

Hỗn hợp phản ứng PCR tốt

Không

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Mu đối chứng âm

Bị tạp nhiễm

Không

Không tạp nhiễm

Mu thử

Dương tính với AHPND

Không

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Đánh giá kết quả: Điều kiện phản ứng được công nhận khi: đối chứng dương có kích thước vạch sáng 336 bp so với thang chuẩn và đối chứng âm không xuất hiện bất kỳ vạch sáng nào.

Mu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời với đối chứng dương có cùng vạch sáng có chiều dài 336 bp so với thang chuẩn.

Mẫu âm tính là mẫu không có vạch sáng có chiều dài 336 bp

6.2.3  Phương pháp Realtime PCR

6.2.3.1  Nguyên tắc

Xem 6.2.2.1

6.2.3.2  Tăng sinh vi khuẩn

Xem 6.2.2.2

6.2.3.3  Tách chiết ADN

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

6.2.3.4  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục E.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi và mẫu dò VpPirA.

Chuẩn bị các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng, Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-0172) của hãng Invitrogen

LƯU Ý: Mu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.3.5  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mu không có giá trị Ct là âm tính. Mu có giá trị 35 Ct 40 được coi là nghi ngờ.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

7  Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh AHPND do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình và kết quả dương tính với một trong các xét nghiệm: phản ứng PCR hoặc phản ứng Realtime PCR

Phương pháp nuôi cấy, phân lập3) và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus. Vì vậy cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2

A.1.1  Thành phần:

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

8,0 g

Kali clorua (KCl)

0,2 g

Natri hydrophosphat (Na2HPO4)

1,15g

Kali dihydrophosphat (KH2PO4)

0,2 g

Nước cất

1000 ml

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có th sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Môi trường thạch chọn lọc TCBS

A.2.1  Thành phần:

Yeast extract

5,0 g

Proteose Peptone

10,0 g

Sodium thiosulfate

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Sodium citrate

10,0 g

ŌX gall

5,0 g

Sodium cholate

3,0 g

Saccharose

20,0 g

Sodium chloride

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Ferric citrate

1,0 g

Bromothymol blue

0,04 g

Thymol blue

0,04 g

Thạch

Từ 8,0 đến 18 g4)

Nước cất

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

A.2.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh môi trường khô trong nước, đun đến khi sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Không hấp áp lực.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TCBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA 1% muối

A.3.1  Thành phần:

Peptone từ casein

15,0g

Peptone từ đậu nành

5,0g

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

10,0g

Thạch

15,0g

Nước cất

1000ml

A.3.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phn với nước ct trong chai tam giác vô trùng. Điu chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội đến 45 - 50°C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sn xuất.

A.4  Môi trường pepton kiềm

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Peptone                                    20,0 g

NaCl                                         20,0 g

Nước cất                                  1000 ml

A.4.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước ct trong chai vô trùng. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi kh trùng là 8,6 ± 0,2 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng peptone kiềm thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn ca nhà sản xuất.

A.5  Các môi trường nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram âm hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

B.1  Thuốc nhuộm

B.1.1  Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể

2,0 g

Ethanol 95%

20,0 ml

Amoni oxalat

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Nước cất

80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin

1 g

Ethanol 95%

10 ml

Phenol (axit phenic)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

c cất

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.

B.1.3  Dung dịch lugol

 

Kali iodua

2 g

Iodua tinh thể

1 g

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

200 ml

Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể. cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

B.1.4  Cồn-axeton

 

Ethanol 95%

3 phần

Axeton

1 phần

B.2  Tiến hành nhuộm

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

B.3  Xem tiêu bản

- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bn bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.

 

Phụ lục C

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ đáy.

- Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Bổ sung 250 µl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

- Đặt ống eppendorf vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

- Ly tâm nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển 100 µl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi AP3

D.1  Trình tự cặp mồi

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND theo Bercovier TK (OIE, 2017)

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi

Mồi

Trình tự (5'-3')

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

bp

Mồi xuôi AP3-F

ATG AGT AAC AAT AT A AAA CAT GAA AC

336

Mồi ngược AP3-R

GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA

D.2  Thực hiện phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

µM

Thể tích

µl

1

Nước không có DNAse/RNAse

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

8,5

2

Dung dịch Master mix 2X

 

12,5

3

Mồi xuôi AP3-F

10

0,5

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Mồi ngược AP3-R

10

0,5

Tổng thể tích

22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mu đối chứng dương: cho 3 µl mẫu ADN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.

- Mu đi chứng âm: cho 3 µl nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Vibrio parahaemolyticus.

- Mu thử: cho 3 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR*

Nhiệt độ

°C

Thời gian

Số chu kỳ

94 (*)

3 phút (*)

1

94

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

30

53

30 giây

72

40 giây

72

5 phút

1

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

- Chuẩn bị thạch Agarose (3.3.5) 1,5 % pha trong dung dịch TBE (3.3.5) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.3.6) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.3.7)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (3.3.8).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

 

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

(Tham khảo)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi VpPirA

E.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng E.1 - Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò

Trình tự (5' - 3')

Mồi xuôi VpPirA-F

TTG GAC TGT CGA ACC AAA CG

Mồi ngược VpPirA-R

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Đoạn dò VpPirA-P

FAM - AGA CAG CAA ACA TAC ACC TAT CAT CCC GGA - TAMRA

E.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và đoạn dò đã được chuẩn bị và kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng E.2.

VÍ DỤ: sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng Realtime PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

(µl)

1

Nước không có DNAse/RNAse

 

5,5

2

Dung dịch SuperMix

2X

12,5

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Mồi xuôi VpPirA-F

10 pM

0,75

4

Mồi ngược VpPirA-R

10 pM

0,75

5

Đoạn dò VpPirA-P

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

0,5

Tổng thể tích

20

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Đ kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có ADNse/RNase vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn ca vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR *

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C (*)

2 phút (*)

1

95 °C (*)

2 phút (*)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

15 giây

40

60 °C

30 giây

(Ghi nhận tín hiệu quang)

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

 

PHỤ LỤC F

(Quy định)

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Hình F.1 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trong phòng thí nghiệm

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE 2018 chapter 2.2.1 Acute Hepatopancreatic Necrosic Disease.

[2] TCCS 02: 2014/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ s phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật PCR (Quyết định ban hành số 934/QĐ-TY-TS ngày 12 tháng 12 năm 2014 của Cục trưởng Cục Thú y).

[3] TCCS 01: 2016/TY-TS: Quy trình xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Quyết định ban hành số 453/QĐ-TY-TS ngày 01 tháng 07 năm 2016 của Cục truởng Cục Thú y).

[4] Jee Eun Han, Kathy F.J.Tang, Carlos R. Pantoja, Brenda L. White, Donald V. Lightner, 2015. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture 442 (2015) 12-15.

[5] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for sample preparation for qualitative detection.

...

...

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

[7] Chapter VI - Laboratory identification of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae, Centers for Disease Control and Prevention.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người s dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm ca nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sn phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sn phm ca nhà cung cp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết qu tương đương.

3) Phương pháp nuôi cấy phân lập thường được s dụng đ phục vụ kiểm tra kháng sinh đồ cũng như lưu giữ gốc vi khuẩn gây bệnh dùng cho các nghiên cứu.

4) Tùy thuộc sức đông của thạch

Văn bản này chưa cập nhật nội dung Tiếng Anh

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm

Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!


Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...


Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên tại đây


2.812

DMCA.com Protection Status
IP: 3.146.35.53
Hãy để chúng tôi hỗ trợ bạn!