Urê
|
Catalase
|
Oxidase
|
Manitol
|
Glucose
|
Sucrose
|
D-Xylose
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Phương pháp tiến hành, theo
Phụ lục B.
5.2.3.3. Xác định
vi khuẩn bằng
phương pháp PCR
Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi
đặc hiệu và chu trình nhiệt được
nêu trong Bảng
2.
Bảng 2 - Cặp
mồi đặc hiệu
cho Avibacterium
paragallinarum
Tên mồi
Trình tự từ
đầu 5’ tới 3’
Kích thước
sản phẩm
Chu trình nhiệt
N1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
500 bp
94 °C, 10 min;
Chu trình 30 vòng:
(94 °C, 25 s;
55 °C, 50 s;
72 °C, 40 s)
72 °C trong 7 min.
Giữ ở 4 °C
R1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiến hành phản ứng PCR theo Phụ lục C.
6. Kết luận
Gà được xác định là mắc bệnh phù đầu
khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và
phân lập được vi khuẩn Avibacterium paragallinarum trong phòng
thí nghiệm.
Phụ lục A
(Qui định)
Phương pháp nhuộm gram
A.1. Thuốc nhuộm
A.1.1. Dung dịch tím tinh
thể
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Etanol 95 %
Amoni oxalat
Nước
2,0 g
20,0 ml
0,8 g
80,0 ml
Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan
amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.
A.1.2. Dung dịch fushcin gốc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Etanol 95 %
Phenol
Nước
1 g
10 ml
5 g
100 ml
Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo
tỷ lệ 1:10 (phần
thể tích) với nước.
A.1.3. Dung dịch lugol
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Iod tinh thể
Nước
2 g
1 g
200 ml
Nghiền kali iodua và iodua tinh thể,
cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.
A.1.4. Cồn 95 %
A.2. Cách tiến hành
- Nhỏ dung dịch tím tinh
thể lên tiêu bản: từ 1
min đến 2 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min
- Rửa nước nhanh, để khô
- Nhỏ cồn 95 %
- Rửa nước thật nhanh, để khô
- Nhỏ dung dịch fuchsin loãng,
để 1 min
- Rửa nước
- Thấm khô hoặc sấy khô
A.3. Xem tiêu bản
Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào tiêu bản và xem tiêu
bản bằng kính hiển vi quang học (xem 4.6).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục B
(Qui định)
Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa của
vi khuẩn Avibacterium paragallinarum
B.1. Khả năng phân giải urê
- Sử dụng môi trường urê cơ bản (xem
3.4)
(pha
theo hướng dẫn của nhà sản
xuất) có bổ sung thêm 1% huyết thanh gà, b-NAD nồng độ cuối cùng là 5 mM và urê nồng độ cuối
cùng là 20%.
- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ thạch
máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 cấy vào môi trường có urê, nuôi trong tủ ấm
(xem 4.1), đọc kết quả sau 24 h.
+ Phản ứng dương tính: Môi
trường có màu hồng.
+ Phản ứng âm tính: Môi trường không thay
đổi màu.
B.2. Phản ứng
oxidaza
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.3. Phản ứng
catalaza
Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ
môi trường thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 đặt lên một điểm trên
phiến kính (xem 4.4).
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3 % lên khuẩn lạc
trên phiến kính (xem 4.4).
Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính
khi không có hiện tượng sủi bọt.
B.4. Lên men đường
- Chuẩn bị môi trường TSB-đường:
Pha môi trường TSB (xem 3.3) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Bổ sung 1% chỉ thị màu phenol red 0,2%, 1% NaCl (g/v). Chỉnh pH môi trường
ở 6,8 ± 0,2, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 121 °C trong 15 min. Để
nguội đến 45 °C, rồi bổ sung 1 % b-NAD, 1 % huyết thanh gà. Chia môi trường ra các ống
nghiệm (xem 4.10), mỗi ống nghiệm khoảng 4 ml.
Chuẩn bị đường: Pha các loại đường thành dung dịch
10
%,
hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 110 °C trong từ 15 min đến 20 min hoặc
hấp cách quãng 3 lần ở
100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (xem 4.8).
Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10% vào ống
chứa 4 ml môi trường TSB.
- Tiến hành: Dùng que cấy
(xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục
5.2.2 cấy vào các ống môi
trường TSB-đường ở phần trên, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) sau 24 h đọc kết quả.
+ Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi
màu.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Phụ lục C
(Qui định)
Phát hiện vi khuẩn Avibacterium
paragallinarum bằng phương pháp PCR
C.1. Nguyên liệu
PCR
C.1.1. Taq PCR Master Mix Kit
C.1.2. Cặp mồi (primers); mồi
xuôi và mồi ngược (Bảng 2).
C.1.3. Nước tinh khiết
không có nuclease
C.1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc
TBE
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
C.1.6. Loading dye
C.1.7. DNA chuẩn (Ladder,
marker)
C.2. Chuẩn bị mẫu
Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Avibacterium
paragallinarum đã nuôi cấy thuần khiết trên
thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hay thạch
sô-cô-la (xem 3.2) được để ở tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h.
Đối chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được giám định
là Avibacterium
paragallinarum hoặc sử dụng các chủng Avibacterium
paragallinarum chuẩn.
C.3. Tách chiết
DNA
Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh
phẩm và các mẫu đối
chứng dương được tách chiết DNA bằng các kít thương mại hay bằng phương
pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản
xuất.
Tách chiết bằng phương
pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 ml nước. Đun huyễn dịch
trong máy ổn nhiệt khô (xem 4.11) trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch
trong đá lạnh trong 5 min.
Ly tâm huyễn dịch với gia tốc
12000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng
PCR.
C.4. Phản ứng PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Taq PCR Master Mix Kit
- Mồi xuôi 20 mM
- Mồi ngược 20 mM
- Nước không có nuclease
- Mẫu DNA
Tổng thể tích
12,5 ml
1 ml
1 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2 ml
25 ml
Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi
khuẩn Avibacterium
paragallinarum (xem C.2).
Đối chứng âm: Gồm đầy đủ các thành phần của một
phản ứng PCR, nhưng
không có DNA của vi khuẩn.
C.5. Chạy điện di
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ
1,5
%
đến 2
%
trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.
Cho 2 ml dung dịch loading
dye vào 8 ml sản phẩm
PCR, trộn đều cho vào từng giếng
trên bản thạch. Cho 10 ml
thang chuẩn (marker) vào một giếng.
Bản thạch được điện di trong môi trường
dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch),
trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng
dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.
Có thể dùng chất nhuộm màu
khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo
quy định của nhà sản xuất (ví
dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Phản ứng dương tính khi:
+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích
cỡ của sản phẩm;
+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện
vạch;
+ Mẫu kiểm tra: Có vạch giống
mẫu đối chứng dương.
- Phản ứng âm tính khi:
+ Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy
nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;
+ Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện
vạch;
+ Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện
vạch;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[1]. Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R.
Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDouglad, D.E. Swayne, L.K. NoLan, 2008. Diseases of
poultry, 789-803.
[2]. Chen, X., Miflin, J. K.,
Zhang, P. & Blackall, P. J. (1996). Development and application of DNA
probes and PCR tests for Haemophilus paragallinarum. Avian Dis 40, 398-407.
[3]. X. Chen, Q. Chen, P. Zhang, W.
Feng, P.J. Blackall. Evaluation of a PCR test for the detection
of Haemophilus paragallinarum in China. Avian Pathology Volume 27, Issue
3, 1998
[4]. Chen X, Song C, Gong Y,
Blackall PJ. Further studies on the use of a polymerase chain reaction
test for the diagnosis
of
infectious
coryza. Avian Pathol. 1998;27(6):618-24.
[5]. Blackall PJ. Infectious
coryza: overview of the
disease and new diagnostic options. Clin Microbiol Rev. 1999 Oct;12(4):627-32.
Review.
[6]. P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey,
G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology, 273-277.
[7]. D de B Welchman, S A
King, P Wragg, A M Wood, R M Irvine, W J Pepper, R Dijkman, J J de Wit. Infectious
coryza in chickens in Great Britain. The Veterinary record 12/2010;
167(23):912-3
[8]. Viện Thú y quốc gia - Jica, 2002.
Cẩm nang chẩn
đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, 182-183.