Cách tiến hành xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8674:2011 như thế nào?

Nội dung chính

• Thuốc thử nào dùng để xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi?
• Cách tiến hành xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8674:2011 như thế nào?
• Báo cáo thử nghiệm xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi phải nêu rõ nội dung gì?

Thuốc thử nào dùng để xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi?

Tại Mục 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8674:2011 (ISO 14565:2000) có quy định về thuốc thử xác định làm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi như sau:

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.

- Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

- Dung dịch kali hydroxit (KOH)

Hòa tan 500 g kali hydroxit trong nước và pha loãng bằng nước đến 1 lít.

- Etanol, w(C2H5OH) = 95% (theo thể tích), hoặc dùng cồn đã metyl hóa công nghiệp tương đương.

- 2-propanol (C3H7OH).

- Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khoảng từ 40 0C đến 60 0C.

Lượng cặn còn lại sau khi bay hơi phải nhỏ hơn 20 mg/l.

- Chất chuẩn vitamin A

+ All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

+ All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

- Metanol, dùng cho HPLC.

- Pha động dùng cho sắc ký lỏng

Trộn metanol (5.7) với nước (5.1) theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích).

Lọc qua bộ lọc màng (6.6), nếu cần.

- Natri sulfat (Na2SO4), dạng khan.

- Dung dịch natri ascorbat, r = 100 g/l.

- Khí trơ, ví dụ: nitơ.

Cách tiến hành xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8674:2011 như thế nào? (Hình từ Internet)

Cách tiến hành xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8674:2011 như thế nào?

Tại Mục 9 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8674:2011 (ISO 14565:2000) có quy định về cách tiến hành xác định làm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi như sau:

(1) Yêu cầu chung

Vì vitamin A nhạy với bức xạ tia cực tím và không khí, nên cần thực hiện tất cả các thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên và mạnh. Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu khi có thể. Hoàn thành phép thử trong một ngày làm việc. Thực hiện việc xà phòng hóa và chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn và các mẫu thức ăn chăn nuôi cùng một lúc.

(2) Xà phòng hóa

Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 1 lít.

Thêm 200 ml etanol (5.3). Xoay bình để làm phân tán mẫu.

Thêm 2 ml natri ascorbat (5.10) và 50 ml dung dịch kali hydroxit (5.2) và xoay bình để trộn.

Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu và nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi (6.3).

Để lượng chứa trong bình cầu hồi lưu trong 60 min, thỉnh thoảng xoay bình.

Tháo bình cầu ra và để nguội đến nhiệt độ phòng càng nhanh càng tốt dưới dòng nước lạnh.

(3) Chiết xuất vitamin A (retinol)

Chuyển lượng chứa trong bình cầu sang ống chiết hình trụ (xem 6.5).

Rửa sạch bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 25 ml etanol hoặc cồn metyl công nghiệp (5.3) và chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ.

Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 125 ml dầu nhẹ (5.5) và một phần 250 ml nước (5.1), mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ.

Đậy nắp ống chiết hình trụ và lắc đều trong 1 min, thỉnh thoảng chú ý giải phóng áp suất.

Làm nguội ống chiết hình trụ dưới dòng nước lạnh trong khi đợi tách hai pha lỏng, trước khi tháo bỏ nắp.

Khi đã tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt trong nắp bằng một vài mililit dầu nhẹ (5.5) và chèn ống có thể điều chỉnh (xem 6.5), chỉnh vị trí đầu dưới sao cho chỉ hơi trên mức phân lớp.

Bằng cách áp dụng một áp lực nhẹ của khí trơ (5.11) vào ống bên cạnh, chuyển lớp dầu nhẹ phía trên sang phễu chiết 1 lít (xem 6.5).

Thêm 125 ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 min.

Để tách lớp lại và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống có thể điều chỉnh (xem 6.5) như trên.

Thêm tiếp 125ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 min.

Lại để cho tách lớp và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống điều chỉnh như trên.

Rửa sạch các dịch chiết dầu nhẹ với bốn phần, mỗi phần 100 ml nước, lúc đầu chỉ nhẹ nhàng đảo ngược sau đó lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương ở mức tối thiểu.

Chuyển dịch chiết đã rửa qua giấy lọc trung bình/nhanh có chứa 60 g natri sulfat khan (5.9), vào một bình cầu thích hợp để bay hơi chân không.

Rửa sạch phễu chiết hai lần, mỗi lần dùng 20 ml dầu nhẹ (5.5) và cho nước rửa qua bộ lọc vào bình cầu làm bay hơi.

Rửa bộ lọc tiếp hai lần, mỗi lần dùng 25 ml dầu nhẹ (5.5) và cho nước rửa vào bình làm bay hơi.

Làm bay hơi dịch chiết dầu nhẹ đến khô dưới chân không ở nhiệt độ không quá 40 0C.

Khôi phục lại áp suất khí quyển bằng cách nạp khí trơ (5.11).

(4) Sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Hòa tan cặn bằng một lượng tối thiểu 2-propanol (5.4) và chuyển định lượng sang bình định mức 20 ml.

Rửa sạch bình cầu làm bay hơi có ba phần nhỏ 2-propanol (5.4), chuyển nước rửa vào bình định mức. Pha loãng đến vạch bằng 2-propanol (5.4) và trộn. Đối với vật liệu có chứa trên 100 000 IU/kg, thì có thể cần phải pha loãng tiếp.

CHÚ THÍCH: IU = Đơn vị quốc tế; 1 IU vitamin A = 0,300 mm của all-trans-retinol.

Nếu cần, lọc dịch chiết mẫu qua bộ lọc màng (6.6).

- Nếu không thể tránh khỏi việc trì hoãn, thì bảo quản dịch chiết dưới khí trơ (5.11) trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 0C và sau đó đưa trở lại nhiệt độ phòng ở nơi tối.

- Bơm 10 ml dịch chiết mẫu vào cột sắc ký lỏng (6.1) và đo diện tích pic của retinol.

- Tính diện tích pic trung bình thu được từ các lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu và xác định nồng độ retinol của dịch chiết bằng cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm được của các lần bơm lặp lại của chuẩn retinol có nồng độ tương tự. Thời gian lưu của retinol là khoảng 5 min. Thực hiện các lần bơm thay thế của dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn.

(5) Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn

Chuẩn bị dung dịch của all-trans-retinyl axetat (5.6) trong etanol (5.3) sao cho 1 ml chứa khoảng 15 000 IU vitamin A.

CHÚ THÍCH: 1 IU vitamin A = 0,344 mm các all-trans-retinyl axetat.

Dùng buret 5 ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch này sang bình cầu 150 ml.

Thêm 20 ml etanol (5.3), 1 ml dung dịch kali hydroxit (5.2) và 5 ml dung dịch natri ascorbat (5.10).

Lắp bình ngưng vào bình cầu. Nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi và để hồi lưu trong 60 min.

Làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng dưới dòng nước lạnh và chuyển lượng chứa trong bình sang phễu chiết (xem 6.5).

Tráng bình cầu bằng 50 ml nước (5.1), tiếp theo là 25 ml etanol (5.3), cho nước tráng sang phễu chiết.

Chiết pha nước bằng một phần 80 ml dầu nhẹ (5.5) và sau đó chiết tiếp hai lần mỗi lần 50 ml dầu nhẹ (5.5).

Gộp tất cả các dịch chiết bằng dầu nhẹ, sau đó rửa hai lần mỗi lần 50 ml nước. Thêm 2 g natri sulfat khan (5.9).

Chuyển dịch chiết dầu nhẹ sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch. Nồng độ retinol của dung dịch này (dung dịch 1) là khoảng 150 IU/ml.

(6) Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn

Dùng pipet lấy 5 ml ± 0,03 ml dung dịch 1 (9.5) cho vào bình định mức 50 ml và loại bỏ dung môi ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ (5.11).

Hòa tan cặn trong 2-propanol (5.4) và sau đó thêm 2-propanol đến vạch.

Đo độ hấp thụ (A) của dung dịch, sử dụng 2-propanol làm đối chứng, ở bước sóng 310 nm, 325 nm và 334 nm. Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ từ 0,7 đến 0,8. Có thể sử dụng dung dịch trung gian, nếu cần.

Sử dụng công thức sau đây, tính hấp thụ hiệu chỉnh ở bước sóng 325 nm:

A325, corr = 6,815 x A325 - 2,555 x A310 - 4,26 x A334

Nếu A325,corr/A325 nhỏ hơn 0,97, thì sử dụng giá trị A325,corr để chuẩn hóa, nếu không sử dụng A325.

Nồng độ retinol của dung dịch 1 được đưa ra bằng:

nồng độ (IU/ml) = A325 x 183 IU/ml, hoặc

nồng độ (IU/ml) = A325,corr x 183 IU/ml.

(7) Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký

Chuẩn bị dung dịch retinol trong 2-propanol (5.4) có nồng độ xấp xỉ như nồng độ dự kiến trong dịch chiết mẫu (9.4.1). Đối với mỗi 1 000 IU vitamin A trên kilogam mẫu, thì nồng độ retinol dự kiến có trong dịch chiết là 2,5 IU/ml.

Cho bay hơi một thể tích của dung dịch 1 (9.5) đến khô ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ (5.11). Hòa tan cặn trong một lượng thích hợp của 2-propanol để có được nồng độ retinol theo yêu cầu và trộn.

Lọc dung dịch chuẩn qua bộ lọc màng (6.6), nếu cần.

Cách khác để hiệu chuẩn, có thể sử dụng dung dịch chuẩn của vitamin A (retinol) trong 2-propanol (5.4) được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc của all-trans-retinol bằng cách hòa tan một lượng thích hợp của chất chuẩn all-trans-retinol (5.6.2) trực tiếp trong 2-propanol (5.4).

Trong trường hợp này, kiểm tra chuẩn vitamin A bằng cách đo hấp thụ của dung dịch chuẩn trong các cuvet thạch anh (6.2) ở bước 300 nm, 325 nm, 350 nm và 370 nm với 2-propanol làm đối chứng. Xác định tỷ lệ A/A325 tại mỗi bước sóng đối với all-trans-retinol. Nếu tỷ lệ này không vượt quá 0,602, 0,432 và 0,093 ở các bước sóng 300 nm, 350 nm và 370 nm tương ứng, thì các chất chuẩn là phù hợp cho sử dụng (xem tài liệu tham khảo [5], [6]).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng hiệu chuẩn nhiều điểm để tạo thuận lợi cho phép phân tích trong những trường hợp, ví dụ, nồng độ vitamin A dự kiến trong mẫu chiết chưa biết.

Báo cáo thử nghiệm xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi phải nêu rõ nội dung gì?

Tại Mục 12 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8674:2011 (ISO 14565:2000) có quy định báo cáo thử nghiệm xác định hàm lượng vitamin A trong thức ăn chăn nuôi như sau:

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Mọi chi tiết thao tác được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

- Thể hiện kết quả thử nghiệm thu được, hoặc hai kết quả thử nghiệm thu được nếu độ lặp lại được kiểm tra.

Trân trọng!