Tiêu chuẩn TCVN 8685-31:2019 về Quy trình kiểm nghiệm Vắc xin phòng bệnh dại trên chó

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Chó khỏe mạnh: Chó mẫn cảm từ 2 tháng tuổi đến 4 tháng tuổi, không mắc bệnh ký sinh trùng, chưa được tiêm vắc xin dại hoặc kiểm tra huyết thanh có kết quả âm tính với kháng thể chống lại vi rút dại.

5.2  Chuột lang khỏe mạnh: Chuột lang trọng lượng từ 250 g đến 300 g

5.3  Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 12 g đến 15 g

5.4  Dung dịch PBS pH 7,4

5.5  Huyết thanh ngựa

5.6  Kit ELISA phát hiện kháng thể dại

...

...

...

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Bơm tiêm 1 lần, dung tích 1 ml, 3 ml, 5 ml, 10 ml

6.2  Handy step Eppendorf

6.3  Positive Displacement Tips Dung tích 500 µl (1 giọt tương ứng với 30 μl)

6.4  Kim tiêm não chuột chuyên dụng

6.5  Ống Falcon (Conical Type) Dung tích 15 ml, 50 ml

6.6  Máy đọc ELISA

7  Cách tiến hành

...

...

...

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

Theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3  Kiểm tra thuần khiết

7.3.1  Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma. Theo TCVN 8684 : 2011

7.3.2  Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella. Theo TCVN 8684 : 2011

7.4  Kiểm tra tính an toàn

7.4.1  Phương pháp trọng tài

7.4.1.1  Tiêm bắp thịt cho 3 chó mẫn cảm (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

...

...

...

7.4.1.3  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi cả 3 chó (7.4.1.1) sống khỏe mạnh, không có biểu hiện triệu chứng của bệnh dại như: hoảng loạn, chạy lung tung, sợ gió, sợ nước, tiếng sửa khản đặc hoặc rống lên, gầy sút nhanh, hoặc có biểu hiện bất thường.

7.4.2  Phương pháp thay thế

7.4.2.1  Trên chuột nhắt trắng

7.4.2.1.1  Tiêm dưới da cho 5 chuột nhắt trắng (5.3), mỗi con 1/2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

7.4.2.1.2  Theo dõi chuột thí nghiệm trong 14 ngày.

7.4.2.1.3  Đánh giá vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi cả 5 chuột ( 7.4.2.1.1) phải sống khỏe.

7.4.2.2  Trên chuột lang

7.4.2.2.1  Tiêm dưới da cho 2 chuột lang (5.2), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

7.4.2.2.2  Theo dõi 14 ngày.

...

...

...

7.5  Kiểm tra hiệu lực

7.5.1  Kiểm tra hiệu lực theo phương pháp Habel

Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi hiệu số LD₅₀ giữa thí nghiệm và đối chứng đạt ít nhất 103 LD₅₀ (xem phụ lục A).

Tính liều LD₅₀ theo công thức của Reed & Munch (xem phụ lục E).

7.5.2  Kiểm tra hiệu lực theo phương pháp NIH

- ED₅₀ của vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử nghiệm đều nằm trong khoảng giữa liều tiêm lớn nhất và liều tiêm nhỏ nhất.

- Giới hạn độ tin cậy của công hiệu tương quan nằm trong khoảng 25 - 400 %.

- Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi:

+ LD₅₀ của chủng cường độc phải nằm trong khoảng 10-100 LD₅₀/ 0,3 ml;

...

...

...

+ Chỉ số RP (the Relative Potency) được tính như sau: Số đảo nghịch của ED₅₀ vắc xin thử/ số đảo nghịch của ED₅₀ vắc xin tham chiếu (xem phụ lục B).

Ví dụ: ED₅₀ của vắc xin thử là: 1/90 và ED₅₀ vắc xin tham chiếu là: 1/70, và như vậy RP = 90/70 = 1,29 RP/ ml. Để biểu hiện giá trị RP dưới dạng đơn vị quốc tế (UI - International units), lấy giá trị RP × giá trị UI của vắc xin tham chiếu đã biết. Ví dụ: Giá trị RP là 1,29 và giá trị UI của vắc xin tham chiếu đã biết là 1 UI/ ml, ta có 1,29 × 1,0 UI/ ml = 1,29 UI/ ml.

7.5.3  Kiểm tra hiện lực trên chó

Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi 4/5 chó có kết quả ELISA > 0,6 UI/ ml huyết thanh (xem phụ lục C).

8  Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, thuần khiết, vô hoạt, an toàn và hiệu lực như đã nêu ở mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5.

Phụ lục A

(Quy định)

...

...

...

A.1  Chuẩn bị vắc xin

Vắc xin pha loãng 1/40 với dung dịch đệm PBS (5.4).

A.2  Động vật thí nghiệm

120 con chuột nhắt trắng (5.3) chia thành 2 lô:

- Lô thí nghiệm: 60 con dùng để gây miễn dịch.

- Lô đối chứng: 40 con dùng làm đối chứng.

A.3  Gây miễn dịch

- Lô thí nghiệm: tiêm miễn dịch cho 60 chuột nhắt trắng (5.3), mỗi chuột 0,25 ml vắc xin pha loãng 1/40 vào phúc mạc. Tiêm 6 mũi, mỗi mũi cách nhau 1 ngày.

- Lô đối chứng: 40 con không sử dụng vắc xin.

...

...

...

Sau 14 ngày tiêm vắc xin tính từ mũi đầu tiên, chuột miễn dịch và chuột đối chứng được công cường độc bằng chủng Dại CVS với liều 0,03 ml/ con vào nội não.

A.4.1  Chuẩn bị giống công cường độc

Giống Dại CVS được pha loãng với dung dịch đệm PBS (5.4) hoặc nước cất 2 lần đã tiệt trùng, có bổ sung 2 % huyết thanh ngựa thành các nồng độ 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7.

A.4.2  Cách tiến hành

Đối với lô chuột miễn dịch, tiêm các độ pha: 10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1.

Đối với lô chuột đối chứng, tiêm các độ pha: 10^-7, 10^-6, 10^-5.

Theo dõi chuột 14 ngày sau công cường độc, hàng ngày theo dõi 2 lô chuột và ghi kết quả đầy đủ.

Ghi chép số chết, sống của lô thí nghiệm và lô đối chứng:

- Những chuột chết trước ngày thứ 5 sau ngày công cường độc không được tính trong kết quả.

...

...

...

Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14 sau khi công cường độc. Kết quả được tính theo phương pháp Reed & Muench (xem phụ lục E).

Tiến hành gây nhiễm chuột như bảng sau:

Bảng A.1 - Bảng theo dõi chuột công cường độc

Nồng độ Vi rút công cường độc

Lô thí nghiệm

Nồng độ Vi rút công cường độc

Lô đối chứng

Số chuột tiêm

Liều tiêm

...

...

...

Số chuột tiêm

Liều tiêm

Sống/ tổng số

10^-1

10

0,03 ml/ con, dưới màng não

-

10^-5

10

...

...

...

-

10^-2

10

-

10^-6

10

-

10^-3

10

...

...

...

10^-7

10

-

10^-4

10

-

-

-

-

...

...

...

10

-

-

-

-

A.5  Đánh giá kết quả

Vắc xin đạt yêu cầu, khi hiệu số LD₅₀ giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng đạt ít nhất 10³ LD₅₀ (LD₅₀ bảo vệ = LD₅₀ của chuột đối chứng - LD₅₀ của chuột miễn dịch = 1000).

Phụ lục B

...

...

...

Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp NIH

B.1  Chuẩn bị vắc xin

Pha Vắc xin mẫu chuẩn bằng dung dịch đệm PBS (5.4) để có được độ pha có chứa 1 UI/ ml. Phân chia vào các ống một lượng vắc xin đủ dùng cho 1 lần pha tiêm miễn dịch.

Pha vắc xin thử: nếu là vắc xin đông khô phải hoàn nguyên bằng nước hồi chỉnh cho tới nồng độ liều tiêm cho người.

Dung dịch vắc xin mẫu chuẩn (1 UI/ ml) và dung dịch vắc xin mẫu thử đã hoàn nguyên tiếp tục được pha thành 3 độ pha bậc 5 trong dung dịch đệm PBS (5.4). Các độ pha được chọn sao cho có ED₅₀ trung bình không nằm ngoài các độ pha loãng của vắc xin.

Ví dụ:

Vắc xin mẫu chuẩn 1 UI pha thành các độ pha 1/5, 1/25 và 1/125.

Vắc xin thử pha thành các độ pha 1/20, 1/100 và 1/500.

B.2  Động vật thí nghiệm

...

...

...

- Lô đối chứng: 40 chuột nhắt trắng (5.3).

B.3  Gây miễn dịch

- Lô thí nghiệm: mỗi độ pha loãng vắc xin được gây miễn dịch cho ít nhất 16 chuột nhắt trắng (5.3). Mỗi chuột tiêm 0,5 ml vào phúc mạc. Tiêm 2 mũi vào ngày 0 và ngày 7.

- Lô đối chứng: 40 chuột không sử dụng vắc xin, nuôi song song trong cùng điều kiện với lô thí nghiệm.

B.4  Công cường độc

B.4.1  Chuẩn bị giống công cường độc

Giống Dại CVS được pha loãng với nước muối sinh lý 0,9 % (5.6) có bổ sung 2 % huyết thanh ngựa. 1 liều công cường độc có chứa 25 - 50 LD₅₀/1 chuột.

Ví dụ: Sau 5 lần chuẩn độ hiệu giá chủng CVS là 10^-6,81. Như vậy để có được liều 25 LD₅₀ phải dùng độ pha đậm đặc hơn 1,4 log tức là độ pha 10^-5,4.

Để chuẩn độ hiệu giá chủng CVS thử thách thực tế trong thử nghiệm, tiếp tục pha loãng bậc 10 từ hỗn dịch 10^-6,4 để có các độ pha 10^-6,4, 10^-7,4, 10^-8,4.

...

...

...

Lấy độ pha 10^-5,4 tiêm cho tất cả nhóm chuột miễn dịch, mỗi chuột 0,03 ml vào não.

Theo dõi chuột 14 ngày sau công cường độc.

Những chuột liệt hoặc chết sau ngày thứ 5 mới được tính vào kết quả. Những chuột có dấu hiệu co giật, liệt, rối loạn vận động được coi như chết vì bệnh dại.

Cần ghi chép kết quả hàng ngày. Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14 sau công cường độc.

Hiệu giá chủng cường độc CVS tính theo phương pháp Reed & Muench (Phụ lục E).

Tiến hành gây nhiễm chuột miễn dịch như bảng sau:

Bảng B.1 - Bảng theo dõi chuột công cường độc lô vắc xin thử nghiệm và lô vắc xin chuẩn

Độ pha loãng vắc xin

Lô vắc xin thử nghiệm

...

...

...

Lô vắc xin chuẩn

Số chuột tiêm

Liều tiêm

Sống/ tổng số

Số chuột tiêm

Liều tiêm

Sống/ tổng số

1/20

16

...

...

...

-

1/5

16

0,03 ml/con, dưới màng não

-

1/100

16

-

1/25

...

...

...

-

1/500

16

-

1/125

16

-

Tiến hành gây nhiễm chuột đối chứng như bảng sau:

Bảng B.2 - Bảng theo dõi chuột công cường độc lô đối chứng

...

...

...

Lô vắc xin đối chứng

Số chuột tiêm

Liều tiêm

Sống/ tổng số

10^-6,4

10

0,03 ml/con, dưới màng não

-

10^-7,4

...

...

...

-

10^-8,4

10

-

B.5  Đánh giá kết quả

- ED₅₀ của vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử nghiệm đều nằm trong khoảng giữa liều tiêm lớn nhất và liều tiêm nhỏ nhất.

- Giới hạn độ tin cậy của công hiệu tương quan nằm trong khoảng 25 % đến 400 %.

- Tiêu chuẩn:

+ LD₅₀ của chủng cường độc phải nằm trong khoảng 10-100 LD₅₀/ 0,3 ml

...

...

...

+ Chỉ số RP (the Relative Potency) được tính như sau: Số đảo nghịch của ED₅₀ vắc xin thử/ số đào nghịch của ED₅₀ vắc xin tham chiếu.

Ví dụ: ED₅₀ của vắc xin thử là: 1/90 và ED₅₀ vắc xin tham chiếu là: 1/70, và như vậy RP = 90/70 = 1,29 RP/ ml. Để biểu hiện giá trị RP dưới dạng đơn vị quốc tế (UI - International units), lấy giá trị RP X giá trị UI của vắc xin tham chiếu đã biết. Ví dụ: Giá trị RP là 1,29 và giá trị UI của vắc xin tham chiếu đã biết là 1 UI/ ml, ta có 1,29 X 1,0 UI/ ml = 1,29 UI/ ml.

Phụ lục C

(Quy định)

Kiểm tra hiệu lực trên chó

C.1  Chuẩn bị vắc xin

Dùng bơm tiêm vô trùng hút và trộn 3 chai vắc xin vào một chai đã được tiệt trùng. Lắc đều trước khi lấy thuốc tiêm miễn dịch.

C.2  Động vật thí nghiệm

...

...

...

- Lô đối chứng: 10 chó (5.1).

Chó được nuôi dưỡng và nhốt trong các chuồng chuyên dụng cách ly tốt.

C.3  Gây miễn dịch

- Lô thí nghiệm: Chó được tiêm với 1 liều vắc xin sử dụng/dưới da.

- Lô đối chứng: Không sử dụng vắc xin.

C.4  Thời gian theo dõi

Theo dõi hàng ngày và 30 ngày sau khi tiêm, tất cả chó được lấy máu chắt huyết thanh để kiểm tra đáp ứng kháng thể.

C.5  Đánh giá kết quả

- Sử dụng phương pháp ELISA và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kít (Ví dụ sử dụng Kít ELISA của hãng Synbiotics - Protocol "SERALISA Rabies Ab Mono Indirect, Synbiotics, France")[1] (xem phụ lục D).

...

...

...

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phản ứng Elisa (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay)

D.1 Vật liệu thử

- Huyết thanh chó cần kiểm tra

- Nước cất 2 lần

- Kít ELISA phát hiện kháng thể Dại

Ví dụ: Dùng Kít ELISA của hãng Synbiotic - France (Serelisa Rabies Ab Mono Indirect).

...

...

...

D.2.1  Huyết thanh được bất hoạt ở 56 °C trong 30 min.

D.2.2  Pha loãng huyết thanh bằng dung dịch pha mẫu (sample diluent - SD) theo tỷ lệ 1/10.

D.2.3  Pha loãng huyết thanh chuẩn bằng dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1/10, 1/25, 1/60, 1/80, 1/170, 1/400 và 1/800.

D.2.4  Pha đối chứng âm, đối chứng dương bằng dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1/10.

D.2.5  Pha Conjugate (CJ) (chất gắn kết) theo tỷ lệ 1/10 với conjugate dilution (CD) (dung dịch gắn kết).

D.2.6  Pha dung dịch rửa theo tỷ lệ 1/10 với nước cất.

D.3  Cách tiến hành

D.3.1  Cho 90 μl dung dịch pha mẫu vào tất cả các giếng cần kiểm tra.

D.3.2  Cho 10 μl đối chứng âm vào 2 giếng A1, A2 của đĩa có phủ kháng nguyên dại, trộn đều.

...

...

...

D.3.4  Cho 10 μl huyết thanh chuẩn đã pha từ 1/10 đến 1/800, mỗi nồng độ 2 giếng, từ C1, C2 đến A3, A4, của đĩa có phủ kháng nguyên dại, trộn đều.

D.3.5  Cho 10 μl huyết thanh cần kiểm tra đã pha 1/10 vào các giếng, mỗi mẫu 2 giếng, từ B3, B4 đến H3, H4 của đĩa có phủ kháng nguyên dại, trộn đều.

D.3.6  Ủ ở nhiệt độ 37 °C ± 3 °C trong 1 h ± 5 min.

D.3.7  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng bằng dung dịch rửa đã pha (D.2.6). Mỗi giếng 350 μl, rửa 4 lần.

D.3.8  Cho 100 pl chất gắn kết (CJ) (D.2.5) vào tất cả các giếng cần kiểm tra.

D.3.9  Ủ ở nhiệt độ 37°C ± 3°C trong 1 h ± 5 min.

D.3.10  Loại bỏ dung dịch trong dĩa, rửa các giếng bằng dung dịch rửa đã pha (D.2.6). Mỗi giếng 350 μl, rửa 4 lần.

D.3.11  Cho 100 μl cơ chất (Substrate) vào tất cả các giếng cần kiểm tra, trộn đều.

D.3.12  Ủ ở nhiệt độ phòng 23 °C ± 5 °C trong 30 min ± 5 min.

...

...

...

D.3.14  Đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.6) ở bước sóng 450 nm để ra các giá trị OD của các mẫu cần kiểm tra.

Bảng D.1 - Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

1

2

3

4

A

N 1:10

...

...

...

WHO 1:8000

WHO 1:8000

B

P 1:10

P 1:10

S1 1:100

S1 1:100

C

WHO 1:100

...

...

...

S2 1:100

S2 1:100

D

WHO 1:250

WHO 1:250

S3 1:100

S3 1:100

E

WHO 1:600

...

...

...

S4 1:100

S4 1:100

F

WHO 1:800

WHO 1:800

S5 1:100

S5 1:100

G

WHO 1:1700

...

...

...

S6 1:100

S6 1:100

H

WHO 1:4000

WHO 1:4000

S7 1:100

S7 1:100

Chú thích:

N: Negative control (Đối chứng âm)

...

...

...

S: Sample (Mẫu

WHO: WHO reference serum (Huyết thanh chuẩn của WHO)

D.4  Điều kiện kết quả:

OD positive (OD của đối chứng dương) ≥ 0,300

OD negative (OD của đối chứng âm) < 0,50 × OD positive (OD của đối chứng dương)

r > 0,95 (tính r theo công thức trên đường hồi quy)

D.5  Công thức tính kết quả:

Công thức chuẩn độ dựa theo đường hồi quy (Phần mềm do hãng sản xuất cung cấp)

- Kết quả chuẩn độ > 0,6: con vật có khả năng bảo hộ.

...

...

...

Phụ lục E

(Quy định)

Công thức tính LD₅₀ theo phương pháp Reed-Muench

Trong đó:

A: Độ pha loãng của giống CVS gây chết chuột ngay sát dưới 50 %

a: % chuột chết ngay sát dưới 50 %

b: % chuột chết ngay sát trên 50 %

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-03.2009/BNNPTNT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về lấy mẫu thuốc thú y để kiểm tra chất lượng.

[2] Phụ lục 15.30. Xác định hiệu lực vắc xin dại theo phương pháp Habel - Dược điển Việt Nam 4, lần xuất bản thứ tư, 2009

[3] Phụ lục 15.31. Xác định hiệu lực của vắc xin dại theo phương pháp NIH - Dược điển Việt Nam 4, lần xuất bản thứ tư, 2009

[4] MARTIN M. KAPLAN & HILARY KOPROWSKI: Laboratory Techniques in Rabies, Third Edition, WHO, 1973.