Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7774:2007 Sữa - Xác định hàm lượng protein - Phương pháp nhuộm đen amido

CHÚ THÍCH: Gia tốc ly tâm tương đối được tạo ra trong máy ly tâm được tính theo công thức sau đây:

1,12 r n² x 10^-6

trong đó

r là bán kính nằm ngang hiệu lực, tính bằng milimet;

n là tần số quay, trên phút.

6.7.2. Thiết bị lọc

Có thể bằng cách lọc qua sợi thủy tinh, tốt nhất là đã silicon hóa, với áp suất nhẹ, để thay thế cho việc ly tâm. Cần phải kiểm tra rằng lượng thuốc thử hấp phụ lên bộ lọc là tối thiểu và không đổi đối với mọi diện tích bề mặt đã cho. Đối với áp suất đã cho, độ xốp của bộ lọc có thể cho phép hiệu chỉnh việc lọc các kết tủa hình thành bởi phức chất protein nhuộm (xem thêm 10.1).

6.8. Máy đo pH, có điện cực thủy tinh và một điện cực chuẩn thích hợp, cho phép đo pH chính xác đến 0,01 đơn vị pH.

6.9. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, 1 000 ml, 2 000 ml và 3 000 ml.

...

...

...

7. Lấy mẫu

Xem TCVN 6400 (ISO 707).

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị mẫu thử

Đưa mẫu thử về nhiệt độ từ 20 ⁰C đến 30 ⁰C bằng cách đặt chai đựng mẫu vào nồi cách thủy, nếu cần.

Trộn kỹ mẫu sữa bằng cách đảo chiều nhẹ nhàng chai đựng mẫu ba đến bốn lần, không làm tạo bọt hoặc làm xáo trộn chất béo. Nếu gặp phải khó khăn trong việc làm phân tán lớp cream, hoặc nếu thấy có tạo kem nhẹ, thì làm ấm từ từ mẫu đến khoảng 35 ⁰C đến 40 ⁰C trên nồi cách thủy, lắc nhẹ; có thể sử dụng bộ đồng hóa mẫu để làm phân tán chất béo, nếu cần.

Nếu chất béo phân tán không đồng đều, thì đưa nhanh mẫu về nhiệt độ 20 ⁰C. Để yên mẫu ít nhất một phút sau khi chỉnh nhiệt độ lần cuối để bọt khí thoát ra (không kéo dài thời gian vì có thể làm xáo trộn chất béo).

8.2. Phần mẫu thử

Dùng pipet hoặc xyranh (6.3) lấy 1 ml mẫu thử đã chuẩn bị (8.1) cho vào ống nghiệm hoặc máy ly tâm (6.1). Lắc nhẹ trong thời gian ngắn trước khi lấy bằng pipet.

...

...

...

8.3.1. Dùng pipet hoặc xyranh (6.4) lấy 20 ml dung dịch đen amido chuẩn (5.2) cho vào phần mẫu thử, đậy ống, nếu cần và dùng tay để lắc lượng chứa bên trong ống 30 s bằng cách đưa lệch khỏi tâm khoảng 25 cm hoặc bằng máy lắc cơ học (6.5). Cách khác, sử dụng khí nén để trộn.

8.3.2. Tháo nắp đậy nếu có và tách kết tủa protein bằng lọc hoặc ly tâm. Trong trường hợp ly tâm thì đặt ống vào máy ly tâm (6.7.1) và cho ly tâm ít nhất 2 min sau khi đạt được gia tốc tại đáy của ống là (350 ± 50) g.

8.3.3. Đổ đầy dịch lỏng phía trên vào cuvet và đo độ hấp thụ sau khi đã chỉnh máy đo quang phổ (6.6) về độ hấp thụ zero dựa vào dung dịch so sánh chuẩn đen amido (5.3.1) ở bước sóng đã chọn (xem 6.6).

8.4. Dựng đường chuẩn

Lấy ít nhất 40 mẫu sữa khác nhau (nếu có thể thì lấy mẫu từ các con bò riêng lẻ) có hàm lượng protein tổng số dao động từ 2,5 % đến 4,5 % (phần khối lượng) hoặc lớn hơn (xem chú thích). Xác định hàm lượng protein của từng mẫu sử dụng phương pháp chuẩn (IDF Standard 20). Chỉnh các kết quả về việc bảo quản, nếu cần (xem 10.1).

Ngoài ra, dùng phương pháp mô tả ở trên để đo độ hấp thụ của dịch nổi phía trên thu được từ mỗi mẫu.

Dựng đồ thị của hàm lượng protein thu được bằng phương pháp chuẩn theo độ hấp thụ. Nếu có bất kỳ sự sai lệch khỏi tuyến tính ở protein cao (độ hấp thụ thấp) cuối đường cong, thì bỏ các kết quả trong phép tính hồi qui. (Qui trình xác định các hàm lượng protein cao này được mô tả trong 10.2). Cũng bỏ qua các giá trị sai lệch nhiều, nghĩa là khi hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp chuẩn sai khác quá hai lần độ lệch chuẩn (được suy ra từ việc tính phương trình hồi qui dưới đây) từ giá trị tương ứng của đồ thị.

Suy luận phương trình hồi qui về hàm lượng protein xác định được bằng phương pháp chuẩn (y) dựa vào độ hấp thụ (x) và dựng đồ đường chuẩn đối với y và x.

CHÚ THÍCH: Các sản phẩm sữa xử lý nhiệt (thanh trùng và tiệt trùng) và sữa hoàn nguyên có thể cần đến các đường chuẩn khác nhau.

...

...

...

Đồng thời với việc dựng đường chuẩn, đo độ hấp thụ của hai dung dịch so sánh chuẩn đã chuẩn bị trong 5.3.2 và 5.3.3 (xem chú thích trong 5.2.2).

8.6. Kiểm soát hiệu chuẩn

8.6.1. Các mẫu sữa kiểm chứng

Vì việc hiệu chuẩn có thể bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi theo mùa của các phần nitơ khác nhau trong sữa, do đó cần được kiểm tra thường xuyên. Việc này có thể thực hiện được bằng cách sử dụng ít nhất một mẫu đại diện từ một lượng sữa lớn (nghĩa là từ một lượng lớn sữa bò) của hàm lượng protein trung bình, hoặc, tốt nhất là sử dụng hai mẫu như thế có hàm lượng protein cao và hàm lượng protein thấp, đã được xác định bằng phương pháp chuẩn Kjeldahl (IDF Standard 20).

8.6.2. Sử dụng mẫu sữa kiểm chứng

Phải lấy đủ các mẫu kiểm chứng bằng cách lấy mẫu đại diện từ các mẫu kiểm chứng sữa như 8.6.1. Có thể bổ sung các chất bảo quản (xem 10.1) vào các mẫu đại diện sao cho mẫu có thể được sử dụng trong một quãng thời gian mà giá trị hàm lượng protein chuẩn không bị thay đổi.

Mẫu hoặc các mẫu kiểm chứng cần thử nghiệm hai lần giống nhau trước mỗi ngày thử nghiệm mẫu. Thông thường, chúng phải được thực hiện sau mỗi dãy xác định ở tần số 1 trong 10, hoặc vào các khoảng định kỳ trong quá trình thử nghiệm liên tục để kiểm soát "độ trệch". Tương tự, cũng cần kiểm tra số đọc của máy đo quang phổ sử dụng các dung dịch so sánh chuẩn, các số đọc thang đo của máy đo quang phổ đã được xác định tại thời điểm hiệu chuẩn (xem 8.5 và 8.6.1).

9. Biểu thị kết quả

9.1. Phương pháp tính

...

...

...

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch kết quả giữa hai phép xác định tiến hành liên tục nhanh, do một người thực hiện, không được vượt quá 0,03 g protein trên 100 g mẫu.

10. Trường hợp đặc biệt

10.1. Mẫu được bảo quản

Phương pháp này có thể áp dụng mà không cần sửa đổi, cho các mẫu đã được bảo quản bằng cách bổ sung từ 0,07 % đến 0,1 % (phần khối lượng) thủy ngân (II) clorua (qui định cho phép) hoặc từ 0,02 % đến 0,3 % (phần khối lượng) natri azit. Đối với các mẫu được bảo quản bằng kali dicromat 0,1 % (phần khối lượng) thì phương pháp này chỉ có thể áp dụng nếu thời gian tính từ lúc bổ sung dung dịch đen amido vào sữa và đến lúc lấy các số đọc quang phổ là rất ngắn, vì trường hợp này sử dụng phương pháp lọc (xem 6.7); không thể áp dụng qui trình ly tâm. Phương pháp này không thể áp dụng cho các mẫu được bảo quản bằng formaldehyt.

Trong trường hợp bảo quản bằng các viên thuốc, thì thường khoảng 0,5 % (phần khối lượng) natri clorua. Điều này sẽ ảnh hưởng đến độ hấp thụ, các kết quả thu được bằng phương pháp Kjeldahl và cũng có thể cần phải hiệu chỉnh các kết quả. Nên suy hàm lượng protein từ đường chuẩn đặc thù thu được với các mẫu được bảo quản như vậy và dựa vào các kết quả thu được bằng phương pháp Kjeldahl đã hiệu chỉnh về bảo quản (ảnh hưởng pha loãng của viên thuốc, nitơ từ azit và thuốc nén).

10.2. Sự lệch khỏi đường tuyến tính trong đường chuẩn

Đối với các loại sữa có hàm lượng protein cao mà cho kết quả không nằm trong đường chuẩn tuyến tính thì tiến hành như sau:

Pha loãng một lượng nhất định mẫu sữa có hàm lượng protein cao với một thể tích tương tự của mẫu sữa có hàm lượng protein đã biết (dung dịch chuẩn hoặc dung dịch kiểm chứng), trộn đều và xác định hàm lượng protein của hỗn hợp theo 8.3 và 9.1.

...

...

...

w₁ = 2w₂ - w₃

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp lấy mẫu đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm:

a) hệ số đã sử dụng để thu được hàm lượng protein từ hàm lượng nitơ xác định được bằng phương pháp chuẩn (IDF Standard 20);

b) mọi quan sát có thể cho thấy kết quả nghi ngờ về độ chính xác;

c) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử.