Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8678:2011 thức ăn chăn nuôi – Xác định hoạt độ phytaza

Số hiệu:	TCVN8678:2011	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2011	Ngày hiệu lực:
ICS:	65.120	Tình trạng:	Đã biết

Dung dịch chuẩn	Thế tích dung dịch chuẩn gốc phosphat (4.19)	Thể tích dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 % phần khối lượng (4.16)	Hệ số pha loãng	Nồng độ µmol/ml^a
A	1	1	2	25
B	1	3	4	12,5
C	1	7	8	6,25
D	1	15	16	3,125
^a Tính các nồng độ chính xác (4.19).

8.2.2. Kiểm soát mức phytaza

Đối với việc ủ mỗi mẫu thử, cần bao gồm bước kiểm soát mức phytaza. Dung dịch chuẩn gốc phytaza (4.20) có hoạt độ đã biết, được pha loãng đến hoạt độ cuối cùng từ 0,15 U/ml đến 0,25 U/ml và hoạt độ chính xác được xác định như qui định trong 8.4.

8.3. Đường chuẩn

Thực hiện ba phép xác định đối với mỗi dung dịch phosphat đã pha loãng và hai mẫu trắng và tính trung bình các kết quả. Qui trình được quy định trong Bảng 2.

Đối với các dung dịch chuẩn phosphat, dùng pipet lấy 360 µl dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01% phần khối lượng (4.16) cho vào ống nghiệm 2 ml (5.12). Thêm 40 µl dung dịch chuẩn phosphat (Bảng 1).

Đối với các dung dịch trắng chuẩn phosphat, dùng pipet lấy 400 µl dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 % phần khối lượng (4.16) cho vào ống nghiệm 2 ml (5.12).

Trong cả hai trường hợp, cho thêm 0,8 ml dung dịch cơ chất phytat (4.18) và 0,8 ml thuốc thử STOP (4.13). Trộn các lượng chứa trong các ống và duy trì các ống 10 min ở nhiệt độ phòng. Ly tâm (5.8) các ống cùng với mẫu trong 3 min với gia tốc từ 11 000 g đến 20 000 g và đo OD của phần nổi phía trên ở bước sóng 415 nm, D(415).

Bảng 2 – Qui trình đối với đường chuẩn

Bước phân tích

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

Dung dịch trắng

Dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 % phần khối lượng (4.16)

360 µl

400 µl

Dung dịch chuẩn phosphat (8.2.1)

40 µl

0 µl

Dung dịch cơ chất phytat (4.18)

0,8 ml

...

Thuốc thử STOP (4.13)

0,8 ml

Trộn

có

Nhiệt độ phòng

10 min

...

3 min trong khoảng từ 11000 g đến 20000 g

Máy đo quang phổ (5.11)

415 nm (so với nước)

8.4. Kiểm soát mức phytaza

Thực hiện ba phép xác định đối với mỗi dung dịch đã pha loãng và hai dung dịch trắng và tính trung bình các kết quả. Qui trình được quy định trong Bảng 3.

Đối với các dung dịch trong phép xác định kiểm soát mức phytaza, dùng pipet lấy 360 µl dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 % phần khối lượng (4.16) cho vào ống nhiệm 2 ml (5.12). Thêm 40 µl dung dịch kiểm soát mức phytaza loãng (8.2.2). Trộn mẫu. Ủ trước các dung dịch trong 5 min ở 37 ^oC. Thêm 0,8 ml dung dịch cơ chất phytat (4.18) đã được làm nóng sơ bộ đến 37 ^oC. Ủ chính xác 30 min ở 37 ^oC. Sau 30 min, thêm 0,8 ml thuốc thử STOP (4.13) và trộn. Duy trì các dung dịch trong 10 min ở nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm trong 3 min ở gia tốc trong khoảng từ 11 000 g đến 20 000 g. Đo D(415) của phần dung dịch trong nổi phía trên.

Đối với các dung dịch mẫu trắng kiểm soát mức phytaza, dùng pipet lấy 360 µl dung dịch đệm axetat (4.15) cho vào ống nghiệm 2 ml (5.12). Thêm 40 µl dung dịch kiểm soát mức phytaza loãng (8.2.2). Trình tự bổ sung các dung dịch khác với trình tự được sử dụng cho các phép xác định. Các mẫu trắng được ủ sơ bộ 5 min ở 37 ^oC. Sau đó, theo bước 1, thêm thuốc thử STOP (4.13); theo bước 2, thêm dung dịch cơ chất phytat (4.18) đã được làm nóng sơ bộ đến 37 ^oC. Sau đó tiến hành theo Bảng 3, cột 3, dòng 9 trở đi.

...

Các bước tiến hành

Mẫu kiểm soát mức

Mẫu trắng

Dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01% phần khối lượng (4.16)

360 µl

Dung dịch kiểm soát mức phytaza loãng (8.2.2)

40 µl

...

Có

Ủ sơ bộ ở 37 ^oC

5 min

Dung dịch cơ chất phytat (4,18) ở 37 ^oC

0,8 ml

0,8 ml: Bước 2

Trộn

...

Không

Ủ ở 37 ^oC

30 min

Không

Thuốc thử STOP (4.13)

0,8 ml

0,8 ml: Bước 1

Trộn

Có

...

Nhiệt độ phòng

10 min

Ly tâm

3 min trong khoảng từ 11 000 g đến 20 000 g

Máy đo quang phổ (5.11)

415 nm (so với nước)

...

Thực hiện ba phép xác định cho mỗi lần chiết (Điều 7) và hai mẫu trắng và tính trung bình các kết quả. Qui trình được quy định trong Bảng 4.

Đối với các phép xác định, dùng pipet lấy 300 µl dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01% phần khối lượng (4.16) cho vào ống nghiệm 2 ml (5.12). Thêm 100 µl dịch chiết mẫu (Điều 7) là phần mẫu thử. Trộn lượng chứa trong ống. Ủ sơ bộ 5 min ở 37 ^oC. Thêm 0,8 ml dung dịch cơ chất phytat (4.18) đã được nóng sơ bộ đến 37 ^oC. Ủ chính xác 30 min ở 37 ^oC. Sau 30 min, thêm 0,8 ml thuốc thử STOP (4.13) và trộn. Duy trì ống 10 min ở nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm 3 min trong khoảng từ 11 000 g đến 20 000 g. Đo D(415) của dung dịch trong nổi phía trên.

Đối với các mẫu trắng, dùng pipet lấy 360 µl dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 phần khối lượng (4.16) cho vào ống nghiệm 2 ml (5.12). Thêm 100 µl dịch chiết mẫu thức ăn chăn nuôi (Điều 7). Trình tự bổ sung các dung dịch khác với trình tự được sử dụng đối với phần mẫu thử. Ủ sơ bộ các mẫu trắng 5 min ở 37 ^oC. Sau đó, theo bước 1, thêm thuốc thử STOP (4.13); theo bước 2, thêm dung dịch cơ chất phytat (4.18) được làm nóng sơ bộ đến 37 ^oC. Sau đó tiến hành theo Bảng 4, cột 3, dòng 9 trở đi.

Bảng 4 – Qui trình đối với phần mẫu thử thức ăn chăn nuôi

Các bước tiến hành

Mẫu thức ăn chăn nuôi

Mẫu trắng

Dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01% phần khối lượng (4.16)

300 µl

...

Phần mẫu thử^a

100 µl

Trộn

Có

Ủ sơ bộ ở 37 ^oC

5 min

...

0,8 ml

0,8 ml: Bước 2

Trộn

Không

Ủ ở 37 ^oC

30 min

Không

Thuốc thử STOP (4.13)

...

0,8 ml: Bước 1

Trộn

Có

Nhiệt độ phòng

10 min

Ly tâm

3 min trong khoảng từ 11000 g đến 20 000 g

...

Máy đo quang phổ (5.11)

415 nm (so với nước)

^a Phần mẫu thử ≤ 200 U phytaza/kg thức ăn chăn nuôi, lấy 200 µl dịch chiết mẫu thử và 200 µl dung dịch đệm axetat 0,50 mol/l có chứa polysorbat 20, 0,01 % phần khối lượng (4.17) để phân tích (độ pha loãng 1 ® 2). Các mẫu thử > 2 000 U phytaza/kg thức ăn phải được pha loãng thích hợp với dung dịch đệm axetat 0,25 mol/l có chứa 0,01 % phần khối lượng polysorbat 20 (4.16).

9. Tính kết quả

9.1. Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn với DD(415) [D(415)_s - D(415)_b], trong đó D(415)_s và D(415)_b là các mật độ quang trung bình của chất chuẩn và mẫu trắng, tương ứng, thu được với các chất chuẩn phosphat (8.2.1 và 8.3), trên trục tung và tính được nồng độ phosphat trên trục hoành {dung dịch pha loãng 1 ® 10 trong ống ly tâm micro [40 µl chất chuẩn pha loãng (Bảng 1) cộng với 360 µl dung dịch đệm] cho phản ứng cần lấy nồng độ phosphat của chất chuẩn để tính toán}. Đường chuẩn tốt nhất được tính bằng hồi qui tuyến tính, (giao nhau ở 0). Ví dụ được đưa ra trong Hình 1.

CHÚ DẪN

...

D(415) mật độ quang ở bước sóng 415 nm

c(PO₄^3-) nồng độ photphat

Hình 1 – Ví dụ về dựng đồ thị mật độ quang theo nồng độ của dung dịch đo màu chuẩn phosphat sử dụng chất đệm 0,25 mol/l axetat chứa polysorbat 0,01 % phần khối lượng 20 (4.16)

9.2. Tính hoạt độ phytaza

Hoạt độ phytaza, a_p, đước tính như sau:

Trong đó:

...

D(415)_t – D(415)_b

Trong đó:

D(415)_t và D(415)_b là mật độ quang trung bình của phần mẫu thử và mẫu trắng (8.5), tương ứng

k là độ dốc của đường cong chuẩn, nghịch đảo của micromol mililit, tại D(415);

V_d là thể tích được dùng để điều chỉnh độ pha loãng (các lần pha loãng dịch chiết), tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g) hoặc kilogam (kg);

t là thời gian ủ, tính bằng phút (min).

VÍ DỤ 1: Kiểm soát mức phytaza

DD(415) = 0,216

...

V_d = 30 000 ml (thể tích chiết 10 ml x 30 [pha loãng 1 ® 30 dung dịch chuẩn gốc phytaza (4.20)] x 10 [40 µl dung dịch chuẩn gốc phytaza đã pha loãng (4.20) + 360 µl dung dịch đệm = 1 ® 10])

m = 0,1074 g

t = 30 min

(2)

VÍ DỤ 2: Phần mẫu thử thức ăn chăn nuôi

DD(415) = 0,183

k = 0,3757 µmol^-1 ml

V_d = 2000 ml (thể tích chiết 500 ml x 4 [100 µl dịch chiết + 300 µl dung dịch đệm = 1 ® 4])

m = 0,050 kg

...

(3)

9.3. Hiệu chỉnh theo độ tinh khiết và hàm lượng nước của axit phytic

Độ tinh khiết và hàm lượng nước của axit phytic thay đổi theo từng mẻ, do đó cần được đưa vào trong tính toán khi chuẩn bị cơ chất.

VÍ DỤ: Muối dodecanatri của axit phytic (phospho vô cơ 0,008% phần khối lượng)4)

Việc hiệu chỉnh như sau:

(4)

Trong đó:

M là khối lượng phân tử của dodecanatri phytat, tính bằng gam trên mol (g/mol);

w_p là độ tinh khiết của dodecanatri phytat, tính theo phần khối lượng;

...

Nếu: c(phytat) = 7,5 mmol/l; M_r = 923,8 g/mol; w_p = 97% phần khối lượng và = 12,6% phần khối lượng, thì số hiệu chỉnh là 8,17 g/l.

9.4. Gây nhiễu do các giá trị mẫu trắng

Các mức cao, ví dụ, MCP (monocanxi phosphat, Ca(H₂PO₄)₂] có trong các mẫu thức ăn chăn nuôi có thể dẫn đến các giá trị trắng cao [D(415)_b > 1,6]. Một số máy đo quang phổ có thể không tuyến tính trong dải OD cao (gần đến 2). Các giá trị phytaza thu được từ các mẫu thức ăn chăn nuôi có các giá trị trắng cao như thế cần được diễn giải một cách cẩn thận vì các giá trị OD cao có thể dẫn đến đánh giá thấp hơn hoặc cao hơn hàm lượng của phytaza. Việc pha loãng 1 ® 2 hoặc 1 ® 4 dịch chiết thức ăn chăn nuôi có thể làm giảm giá trị OD. Tuy nhiên, DD(415) cần phải > 0,04.

10. Độ chụm

10.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Theo thuật ngữ của IUPAC [2], thì giới hạn phát hiện được xác định là L_D = 3s và giới hạn định lượng được xác định là L_Q = 10s, trong đó s và s là các độ lệch chuẩn ước tính và tuyệt đối, tương ứng.

Trong các thuật ngữ của DD(415), giới hạn phát hiện bằng

L_D = 0,011 DD(415)

hoặc 20 U/kg thức ăn chăn nuôi; giới hạn định lượng bằng

...

hoặc 60 U/kg thức ăn chăn nuôi.

10.2. Phép thử nghiệm liên phòng

Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền ngoài các dải nồng độ và các chất nền đã nêu.

10.3. Độ lặp lại

Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r) là hệ số biến thiên trung bình từ hai kết quả độc lập thu được từ cùng một mẫu trong cùng một ngày, do cùng một người sử dụng, sử dụng cùng thiết bị và cùng phương pháp.

Hệ số biến thiên lặp lại dự đoán là 10 %.

10.1. Độ tái lập

Hệ số biến thiên tái lập, CV(R) là hệ số biến thiên trung bình từ các kết quả thu được từ cùng một mẫu, sử dụng cùng phương pháp, nhưng từ các phòng thử nghiệm khác nhau, trong các ngày khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau và do các người phân tích khác nhau thực hiện.

Hệ số biến thiên lặp lại dự đoán là 12 %.

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được,

f) thể hiện kết quả cuối cùng thu được, nếu độ lặp lại được kiểm tra.

PHỤ LỤC A

...

CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Một phép thử cộng tác quốc tế (Tài liệu tham khảo [3]) gồm có 14 phòng thử nghiệm tại sáu quốc gia tham gia (Áo, Đan Mạch, Pháp, Đức (2), Hungary], một quốc gia ngoài EU là Cơ quan kiểm tra Thực phẩm (Ottawa, Canada), hai phòng thử nghiệm tư nhân ở Pháp và Thụy Sĩ và năm phòng thử nghiệm công ty) đã được thực hiện trên năm mẫu thức ăn (dạng lỏng và dạng rắn). Các mẫu thức ăn hỗn hợp chứa các thành phần đặc trưng và sử dụng công thức có bổ sung các enzym phytaza từ các nguồn khác nhau và theo các dạng khác nhau, tức là các enzym phytaza do các công ty khác nhau sản xuất và được bổ sung vào dạng rắn hoặc dạng lỏng thức ăn chăn nuôi:

Tám mẫu thức ăn (từ mẫu A đến mẫu H) đã được phân tích, trong đó có một trong bốn sản phẩm phytaza khác nhau, ở dạng lỏng hoặc dạng rắn. Phân tích mẫu mù lặp lại hai lần.

Các số liệu về độ chụm đối với phương pháp thu được từ tài liệu tham khảo [3] nêu trong Bảng A.1. Các số liệu về độ chụm (10.3 và 10.4) được tính từ các kết quả của báo cáo nghiên cứu trong Tài liệu tham khảo [3].

Bảng A.1 – Số liệu về độ chụm của phương pháp

Thông số

Sản phẩm dạng lỏng
1

500 U/kg

...

750 U/kg

Sản phẩm dạng lỏng
3

1000 U/kg

Sản phẩm dạng lỏng
4

1250 U/kg

Sản phẩm dạng rắn
1

...

Sản phẩm dạng rắn
2

1500 U/kg

Sản phẩm dạng rắn
3

1500 U/kg

Sản phẩm dạng rắn
4

1500 U/kg

...

Trung bình, U/kg

519

726

772

1219

1498

1621

1364

1199

...

Số phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ, n

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, U/kg

...

159

164

119

Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r), %

8,3

6,0

...

7,2

10,6

10,1

8,8

2,2

Độ lệch chuẩn của độ chụm trung gian, s_ir, U/kg

...

164

131

Hệ số biến thiên của độ chụm trung gian, CV(ir), %

12,7

7,0

11,5

10,4

...

10,1

9,6

3,3

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, U/kg

115

155

182

...

153

Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), %

15,0

8,1

14,9

12,8

12,2

10,1

...

5,4

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.

[2] Currie, L.A. for the IUPAC Analytical Chemistry Division Commission on Analytical Nomenclature. Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities. Pure Appl. Chem. 1995, 67, pp. 1699-1723. Available (2009-01-19) at http://www.iupac.org/publications/pac/1995/pdf/6710x1699.pdf

[3] Gizzi, G., Thyregod, P., von Holst, C., Bertin, G., Vogel, K., Faurschou-Isaksen, M., Betz, R., Murphy, R., Andersen, B.B. Determination of phytase activity in feed: Interlaboratory study. J. AOAC Int. 2008, 91, pp. 259-267.