|
Bản dịch này thuộc quyền sở hữu của
THƯ VIỆN PHÁP LUẬT. Mọi hành vi sao chép, đăng tải lại mà không có sự đồng ý của
THƯ VIỆN PHÁP LUẬT là vi phạm pháp luật về Sở hữu trí tuệ.
THƯ VIỆN PHÁP LUẬT has the copyright on this translation. Copying or reposting it without the consent of
THƯ VIỆN PHÁP LUẬT is a violation against the Law on Intellectual Property.
X
CÁC NỘI DUNG ĐƯỢC SỬA ĐỔI, HƯỚNG DẪN
Các nội dung của VB này được VB khác thay đổi, hướng dẫn sẽ được làm nổi bật bằng
các màu sắc:
: Sửa đổi, thay thế,
hủy bỏ
Click vào phần bôi vàng để xem chi tiết.
|
|
|
Đang tải văn bản...
Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế kỹ thuật
Số hiệu:
|
13/2013/TT-BTNMT
|
|
Loại văn bản:
|
Thông tư
|
Nơi ban hành:
|
Bộ Tài nguyên và Môi trường
|
|
Người ký:
|
Bùi Cách Tuyến
|
Ngày ban hành:
|
21/06/2013
|
|
Ngày hiệu lực:
|
Đã biết
|
Ngày công báo:
|
Đã biết
|
|
Số công báo:
|
Đã biết
|
|
Tình trạng:
|
Đã biết
|
BỘ TÀI NGUYÊN
VÀ
MÔI TRƯỜNG
--------
|
CỘNG HÒA XÃ HỘI
CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
----------------
|
Số: 13/2013/TT-BTNMT
|
Hà Nội, ngày 21
tháng 06 năm 2013
|
THÔNG TƯ
QUY
ĐỊNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT VÀ ĐỊNH MỨC KINH TẾ-KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT
BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT
DEOXYRIBONUCLEIC
Căn cứ Luật Đa dạng
sinh học số 20/2008/QH12 ngày 13 tháng 01 năm 2008 của Quốc hội Nước Cộng hòa
xã hội chủ nghĩa Việt Nam;
Căn cứ Nghị định số 69/2010/NĐ-CP
ngày 21 tháng 6 năm 2010 về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu
vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen;
Căn cứ Nghị định số 21/2013/NĐ-CP
ngày 04 tháng 3 năm 2013 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn
và cơ cấu tổ chức của Bộ Tài nguyên và Môi trường;
Theo đề nghị của Tổng cục trưởng Tổng cục Môi
trường, Vụ trưởng Vụ Kế hoạch và Vụ trưởng Vụ Pháp chế;
Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban hành Thông
tư quy định quy trình kỹ thuật và Định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện
sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axit
deoxyribonucleic,
QUY ĐỊNH:
Điều 1. Ban hành kèm theo
Thông tư này quy trình kỹ thuật và Định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện
sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axít
deoxyribonucleic.
Điều 2. Thông tư này có hiệu
lực thi hành kể từ ngày 05 tháng 08 năm 2013.
Điều 3. Bộ trưởng, Thủ trưởng
cơ quan ngang Bộ, cơ quan thuộc Chính phủ, Chủ tịch Ủy ban nhân dân các tỉnh,
thành phố trực thuộc Trung ương, Tổng cục trưởng Tổng cục Môi trường, Thủ trưởng
các đơn vị trực thuộc Bộ Tài nguyên và Môi trường, Giám đốc Sở Tài nguyên và
Môi trường các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương và tổ chức, cá nhân có
liên quan chịu trách nhiệm thi hành Thông tư này./.
Nơi nhận:
- Văn phòng Quốc hội;
- Văn phòng Chủ tịch nước;
- Văn phòng Chính phủ;
- Văn phòng Trung ương và các Ban của Đảng;
- Tòa án nhân dân tối cao;
- Viện kiểm sát nhân dân tối cao;
- Các Bộ, cơ quan ngang Bộ, cơ quan thuộc Chính phủ;
- Kiểm toán Nhà nước;
- Ủy ban Trung ương Mặt trận Tổ quốc Việt Nam;
- Cơ quan Trung ương của các đoàn thể;
- HĐND, UBND các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương;
- Cục kiểm tra văn bản QPPL (Bộ Tư pháp);
- Các Thứ trưởng Bộ TN&MT;
- Các đơn vị trực thuộc Bộ TN&MT, Website của Bộ;
- Công báo, Cổng Thông tin điện tử Chính phủ;
- Lưu VT, PC, TCMT (D) 200.
|
KT. BỘ TRƯỞNG
THỨ TRƯỞNG
Bùi Cách Tuyến
|
QUY TRÌNH
KỸ
THUẬT VÀ ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC
(Ban hành kèm theo Thông tư số 13/2013/TT-BTNMT ngày 21 tháng 6 năm 2013
của Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường)
Phần 1.
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN)
Quá trình phân tích định tính, định lượng ADN của
sinh vật biến đổi gen bao gồm 04 bước (chi tiết xem lại Phụ lục kèm theo Thông
tư này):
Bước 1: Tách chiết ADN;
Bước 2: Đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng
ADN;
Bước 3: Phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến
đổi gen bằng phương pháp PCR;
Bước 4: Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng
phương pháp real-time PCR (phản ứng PCR tức thời);
1. Tách chiết ADN
Theo TCVN 7606:2007
(ISO 21571), nguyên tắc cơ bản của việc tách chiết ADN bao gồm việc giải phóng
ADN ra dung dịch hỗn hợp các chất và tiếp theo là tinh sạch ADN ra khỏi hỗn hợp
đó. Các bước chính để tách chiết ADN bao gồm:
- Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất;
- Nghiền mẫu;
- Tách chiết ADN;
- Tinh sạch ADN.
Có rất nhiều phương pháp để tách chiết ADN và tùy
thuộc vào nguồn gốc các loại mẫu phẩm (động vật, thực vật hay vi sinh vật) có
những phương pháp tách chiết phù hợp. Trong tập định mức kinh tế-kỹ thuật này
áp dụng 3 phương pháp tách ADN đối với các đối tượng động vật, thực vật và vi
sinh vật, cụ thể như sau:
- Tách chiết ADN của các mẫu sinh học có nguồn gốc
từ thực vật dựa trên CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide);
- Tách chiết ADN của các mẫu sinh học có nguồn gốc từ
động vật dựa trên phenol/cloroform;
- Phương pháp chiết ADN đối với nấm men và/hoặc nấm
sợi thu được từ thực phẩm dựa trên phenol/cloroform.
2. Đánh giá chất lượng và xác
định hàm lượng ADN
Chất lượng, số lượng và tính nguyên vẹn của mẫu ADN
ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của phương pháp phân tích. Theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571), các bước chính của
bước đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng ADN bao gồm:
- Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất;
- Điện di ADN trên gel agarose;
- Xác định hàm lượng ADN trên máy quang phổ;
- Phân tích xử lý kết quả.
Có 2 phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN
trong dung dịch: Phương pháp điện di và phương pháp đo hàm lượng ADN bằng quang
phổ.
3. Phát hiện và nhận dạng ADN
của sinh vật biến đổi gen (định tính) thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp (kỹ
thuật PCR)
Phương pháp PCR thông thường được sử dụng để nhân bản
một đoạn gen sử dụng cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho trình tự gen này. Trong
trường hợp này PCR được sử dụng để phát hiện và nhận dạng sinh vật biến đổi gen
hay PCR định tính.
Theo TCVN 7605:2007
(ISO 21569), các bước chính để phát hiện và nhận dạng sinh vật biến đổi gen bằng
kỹ thuật PCR bao gồm:
- Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất;
- Thiết kế các cặp mồi nhân đoạn gen;
- Tiến hành phản ứng PCR;
- Phân tích và xử lý kết quả bằng điện di trên gel
agarose.
4. Định lượng ADN của sinh vật
biến đổi gen bằng kỹ thuật real-time PCR (phản ứng PCR tức thời)
Theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 21570, các bước chính
trong định lượng sản phẩm biến đổi gen bằng kỹ thuật real-time PCR bao gồm:
- Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất;
- Xây dựng các đường chuẩn ADN cho gen chuẩn (gen nội
sinh) và gen đích;
- Tiến hành phản ứng real-time PCR;
- Phân tích và xử lý kết quả.
Phần 2.
ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ
THUẬT
Chương 1.
QUY ĐỊNH CHUNG
1. Phạm vi điều chỉnh: Định mức kinh tế-kỹ
thuật này được áp dụng để lập, giao kế hoạch và tính đơn giá sản phẩm phục vụ lập
dự toán, thanh quyết toán các công trình, dự án, nhiệm vụ liên quan đến việc
xác định sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng
axít deoxyribonucleic.
2. Đối tượng áp dụng: Định mức này áp dụng
cho các cơ quan, tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến xác định sinh vật
biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axít
deoxyribonucleic.
3. Căn cứ xây dựng định mức
Định mức được xây dựng căn cứ theo:
- Nghị định số 204/2004/NĐ-CP
ngày 14 tháng 12 năm 2004 của Chính phủ về chế độ tiền lương đối với cán bộ
công chức, viên chức và lực lượng vũ trang;
- Thông tư số 06/2005/TT-BLĐTBXH
ngày 05 tháng 01 năm 2005 của Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội hướng dẫn
phương pháp xây dựng định mức lao động trong các công ty nhà nước theo Nghị định
số 206/2004/NĐ-CP ngày 14 tháng 12 năm 2004 của
Chính phủ;
- Quyết định số 32/2008/QĐ-BTC
ngày 29 tháng 5 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Tài chính về việc ban hành chế độ quản
lý, tính hao mòn tài sản cố định trong cơ quan nhà nước, đơn vị sự nghiệp công
lập và các tổ chức có sử dụng ngân sách nhà nước.
4. Định mức thành phần
Định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật
biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng ADN bao gồm các định
mức thành phần sau:
4.1. Định mức lao động công nghệ
Định mức lao động công nghệ (sau đây gọi là định mức
lao động) là thời gian lao động cần thiết để sản xuất ra một sản phẩm.
Nội dung của định mức lao động công nghệ bao gồm:
a) Nội dung công việc: bao gồm các thao tác cơ bản
thực hiện các bước công việc cho hoạt động phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng
phương pháp phân tích định tính, định lượng ADN.
b) Định biên: số lượng và cấp bậc kỹ thuật từng bước
công việc.
c) Định mức: thời gian lao động để sản xuất ra sản
phẩm. Đơn vị tính là công nhóm/đơn vị sản phẩm; ngày công tính bằng 8 giờ làm
việc.
4.2. Định mức vật tư và thiết bị
Định mức vật tư và thiết bị gồm định mức dụng cụ, định
mức thiết bị và định mức vật liệu:
a) Định mức dụng cụ: là thời gian sử dụng dụng cụ cần
thiết để sản xuất ra sản phẩm.
Thời hạn của dụng cụ: xác định bằng phương pháp thống
kê, kinh nghiệm; đơn vị là tháng.
Mức sử dụng các dụng cụ nhỏ, phụ được tính bằng 5%
mức sử dụng các dụng cụ chính đã được tính định mức.
b) Định mức thiết bị: là thời gian sử dụng thiết bị
cần thiết để sản xuất ra sản phẩm.
Thời hạn (niên hạn tính khấu hao) của thiết bị theo
quy định của Bộ Tài chính.
c) Định mức vật liệu: là số lượng vật liệu cần thiết
để sản xuất ra sản phẩm.
Mức vật liệu phụ, vụn vặt và hao hụt được tính bằng
8% mức vật liệu chính đã được tính định mức.
5. Định mức này không quy định các công việc khảo
sát, thu thập mẫu
6. Quy định chữ viết tắt
TT
|
Chữ viết tắt
|
Nội dung viết tắt
|
1
|
Định mức KT-KT
|
Định mức kinh tế-kỹ thuật
|
2
|
BHLĐ
|
Bảo hộ lao động
|
3
|
TCVN
|
Tiêu chuẩn Quốc gia
|
4
|
ĐVT
|
Đơn vị tính
|
5
|
KS1
|
Kỹ sư bậc 1
|
6
|
KS4
|
Kỹ sư bậc 4
|
7
|
ADN
|
Axít deoxyribonucleic
|
8
|
RNA
|
Axít ribonucleic
|
9
|
CTAB
|
Cetyltrimethylammonium bromide
|
10
|
PCR
|
Phản ứng chuỗi trùng hợp
(Polymerase chain reaction)
|
11
|
Real-time PCR
|
Phản ứng PCR tức thời
|
7. Áp dụng định mức: Trong quá trình áp dụng
Định mức kinh tế-kỹ thuật này, nếu có vướng mắc hoặc phát hiện bất hợp lý, đề nghị
phản ánh về Bộ Tài nguyên và Môi trường để tổng hợp, điều chỉnh kịp thời.
Chương 2.
ĐỊNH MỨC KINH TẾ-KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN
ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC
(ADN)
1. Định mức lao động
1.1. Nội dung công việc
Phương pháp phân tích này dựa vào các tính chất cụ
thể của trình tự ADN đích để xác định sự có mặt và định lượng ADN có nguồn gốc
từ sinh vật biến đổi gen.
1.2. Định biên: nhóm 2 lao động gồm 1
KS1 và 1 KS4
1.3. Định mức: công nhóm/mẫu
Bảng số 01
TT
|
Công việc
|
Mức
|
1
|
Tách chiết ADN
|
0,50
|
2
|
Đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng ADN
|
0,25
|
3
|
Phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến đổi
gen bằng kỹ thuật PCR
|
0,60
|
4
|
Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ
thuật real- time PCR
|
0,60
|
2. Định mức vật tư và thiết bị
2.1. Định mức dụng cụ: ca/mẫu
2.1.1. Tách chiết ADN
a) Tách chiết ADN của các mẫu sinh học có nguồn gốc
từ thực vật dựa trên CTAB
Bảng số 02
TT
|
Danh mục dụng cụ
|
ĐVT
|
Thời hạn
(tháng)
|
Mức
(ca/mẫu)
|
1
|
Áo BHLĐ
|
cái
|
9
|
0,80
|
2
|
Giá để dụng cụ, hóa chất
|
cái
|
60
|
0,20
|
3
|
Đồng hồ treo tường
|
cái
|
48
|
0,20
|
4
|
Đồng hồ hẹn giờ
|
cái
|
24
|
0,07
|
5
|
Kính bảo hộ
|
cái
|
3
|
0,80
|
6
|
Ống đong (loại 50, 100, 250 ml)
|
ống
|
12
|
0,06
|
7
|
Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí
|
hộp
|
24
|
0,40
|
8
|
Khay đựng mẫu 45 vị trí
|
cái
|
24
|
0,40
|
9
|
Hộp đựng đầu tip 10 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,40
|
10
|
Hộp đựng đầu tip 200 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,40
|
11
|
Máy trộn mẫu (vortex)
|
cái
|
60
|
0,02
|
12
|
Phích đá giữ mẫu
|
cái
|
24
|
0,40
|
13
|
PIPETman loại 2 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
14
|
PIPETman loại 10 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
15
|
PIPETman loại 100 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
16
|
PIPETman loại 1000 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
17
|
Bút viết
|
cái
|
6
|
0,02
|
18
|
Bút viết kính
|
cái
|
6
|
0,02
|
19
|
Sổ hướng dẫn thí nghiệm
|
quyển
|
24
|
0,02
|
20
|
Chày, cối sứ
|
bộ
|
12
|
0,02
|
21
|
Đèn neon 40W
|
bộ
|
48
|
0,80
|
22
|
Máy hút ẩm 2 kW
|
cái
|
36
|
0,05
|
23
|
Máy hút bụi 1,5 kW
|
cái
|
36
|
0,01
|
24
|
Quạt thông gió 40W
|
cái
|
12
|
0,13
|
25
|
Quạt trần 100W
|
cái
|
60
|
0,13
|
26
|
Điện năng
|
kW
|
|
1,39
|
b) Tách chiết ADN của các mẫu sinh học có nguồn
gốc từ động vật dựa trên phenol/cloroform
Áp dụng theo quy định tại mục a của 2.1.1 ở trên
c) Phương pháp chiết ADN đối với nấm men và/hoặc
nấm sợi thu được từ thực phẩm dựa trên phenol/cloroform
Bảng số 03
TT
|
Danh mục dụng cụ
|
ĐVT
|
Thời hạn
(tháng)
|
Mức
(ca/mẫu)
|
1
|
Áo BHLĐ
|
cái
|
9
|
0,80
|
2
|
Giá để dụng cụ, hóa chất
|
cái
|
60
|
0,40
|
3
|
Đồng hồ treo tường
|
cái
|
48
|
0,40
|
4
|
Đồng hồ hẹn giờ
|
cái
|
24
|
0,03
|
5
|
Kính bảo hộ
|
cái
|
3
|
0,40
|
6
|
Ống đong (loại 50, 100, 250 ml)
|
ống
|
12
|
0,06
|
7
|
Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí
|
hộp
|
24
|
0,40
|
8
|
Khay đựng mẫu 45 vị trí
|
cái
|
24
|
0,40
|
9
|
Hộp đựng đầu tip 10 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,40
|
10
|
Hộp đựng đầu tip 200 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,40
|
11
|
Máy trộn mẫu (vortex)
|
cái
|
60
|
0,02
|
12
|
Phích đá giữ mẫu
|
cái
|
24
|
0,40
|
13
|
PIPETman loại 2 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
14
|
PIPETman loại 10 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
15
|
PIPETman loại 100 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
16
|
PIPETman loại 1000 ml
|
cái
|
36
|
0,10
|
17
|
Bút viết
|
cái
|
6
|
0,02
|
18
|
Bút viết kính
|
cái
|
6
|
0,02
|
19
|
Sổ hướng dẫn thí nghiệm
|
quyển
|
24
|
0,02
|
20
|
Đèn neon 40W
|
bộ
|
48
|
0,80
|
21
|
Máy hút ẩm 2 kW
|
cái
|
36
|
0,05
|
22
|
Máy hút bụi 1,5 kW
|
cái
|
36
|
0,01
|
23
|
Quạt thông gió 40W
|
cái
|
12
|
0,13
|
24
|
Quạt trần 100W
|
cái
|
60
|
0,13
|
25
|
Điện năng
|
kW
|
|
1,39
|
2.1.2. Đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng
ADN của sinh vật biến đổi gen
Bảng số 04
TT
|
Danh mục dụng cụ
|
ĐVT
|
Thời hạn
(tháng)
|
Mức
(ca/mẫu)
|
1
|
Áo BHLĐ
|
cái
|
9
|
0,40
|
2
|
Bàn máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,15
|
3
|
Ghế máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,15
|
4
|
Chuột máy tính
|
cái
|
6
|
0,15
|
5
|
Ổn áp (chung) 10A
|
cái
|
48
|
0,04
|
6
|
Giá để dụng cụ, hóa chất
|
cái
|
48
|
0,20
|
7
|
Đồng hồ treo tường
|
cái
|
48
|
0,20
|
8
|
Kính bảo hộ
|
cái
|
12
|
0,40
|
9
|
Khay đựng mẫu 45 vị trí
|
cái
|
24
|
0,20
|
10
|
Hộp đựng đầu tip 10 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,20
|
11
|
Hộp đựng đầu tip 200 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,20
|
12
|
Máy trộn mẫu (vortex)
|
cái
|
60
|
0,02
|
13
|
PIPETman loại 2 ml
|
cái
|
36
|
0,05
|
14
|
PIPETman loại 10 ml
|
cái
|
36
|
0,05
|
15
|
PIPETman loại 100 ml
|
cái
|
36
|
0,05
|
16
|
PIPETman loại 1000 ml
|
cái
|
36
|
0,05
|
17
|
Bút viết
|
cái
|
6
|
0,02
|
18
|
Bút viết kính
|
cái
|
6
|
0,02
|
19
|
Sổ hướng dẫn thí nghiệm
|
quyển
|
24
|
0,02
|
20
|
Lò vi sóng 0,5 kW
|
cái
|
36
|
0,02
|
21
|
Đèn neon 40W
|
bộ
|
48
|
0,40
|
22
|
Máy hút ẩm 2 kW
|
cái
|
36
|
0,02
|
23
|
Máy hút bụi 1,5 kW
|
cái
|
36
|
0,01
|
24
|
Quạt thông gió 40W
|
cái
|
12
|
0,06
|
25
|
Quạt trần 100W
|
cái
|
60
|
0,06
|
26
|
Điện năng
|
kW
|
|
0,75
|
2.13. Phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến
đổi gen bằng kỹ thuật PCR
Bảng số 05
TT
|
Danh mục dụng cụ
|
ĐVT
|
Thời hạn (tháng)
|
Mức
(ca/mẫu)
|
1
|
Áo BHLĐ
|
cái
|
9
|
0,96
|
2
|
Dép đi trong phòng
|
đôi
|
6
|
0,96
|
3
|
Bàn máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,09
|
4
|
Ghế máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,09
|
5
|
Chuột máy tính
|
cái
|
6
|
0,09
|
6
|
Ổn áp (chung) 10A
|
cái
|
48
|
0,02
|
7
|
Giá để dụng cụ, hóa chất
|
cái
|
60
|
0,24
|
8
|
Kính bảo hộ
|
cái
|
3
|
0,96
|
9
|
Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí
|
hộp
|
24
|
0,48
|
10
|
Hộp đựng đầu tip 10 ml
|
hộp
|
24
|
0,48
|
11
|
Hộp đựng đầu tip 200 ml
|
hộp
|
24
|
0,48
|
12
|
Máy tính tay
|
cái
|
24
|
0,03
|
13
|
Phích đá giữ mẫu
|
cái
|
24
|
0,48
|
14
|
PIPETman loại 2 ml
|
cái
|
36
|
0,20
|
15
|
PIPETman loại 10 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
16
|
PIPETman loại 100 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
17
|
PIPETman loại 1000 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
18
|
Bút viết
|
cái
|
6
|
0,03
|
19
|
Bút viết kính
|
cái
|
6
|
0,03
|
20
|
Sổ thí nghiệm
|
quyển
|
48
|
0,03
|
21
|
Máy trộn mẫu (vortex) 0,1kW
|
cái
|
60
|
0,03
|
22
|
Đèn neon 40W
|
bộ
|
48
|
0,96
|
23
|
Máy hút ẩm 2kW
|
cái
|
36
|
0,06
|
24
|
Máy hút bụi 1,5 kW
|
cái
|
36
|
0,01
|
25
|
Quạt thông gió 40W
|
cái
|
12
|
0,16
|
26
|
Quạt trần 100W
|
cái
|
60
|
0,16
|
27
|
Điện năng
|
kW
|
|
1,67
|
2.1.4. Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen
bằng kỹ thuật phản ứng real-time PCR
Bảng số 06
TT
|
Danh mục dụng cụ
|
ĐVT
|
Thời hạn
(tháng)
|
Mức (ca/mẫu)
|
1
|
Áo BHLĐ
|
cái
|
9
|
0,96
|
2
|
Dép đi trong phòng
|
đôi
|
6
|
0,96
|
3
|
Bàn máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,18
|
4
|
Ghế máy vi tính
|
cái
|
72
|
0,18
|
5
|
Chuột máy tính
|
cái
|
6
|
0,18
|
6
|
Ổn áp (chung) 10A
|
cái
|
48
|
0,05
|
7
|
Đồng hồ treo tường
|
cái
|
48
|
0,24
|
8
|
Hộp bảo quản mẫu
|
hộp
|
24
|
0,48
|
9
|
Ống đỡ mao quản để ly tâm
|
hộp
|
36
|
0,10
|
10
|
Hộp đựng tip 10 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,48
|
11
|
Hộp đựng tip 200 ml tiệt trùng
|
hộp
|
24
|
0,48
|
12
|
Máy trộn mẫu (vortex) 0,1 kW
|
cái
|
72
|
0,03
|
13
|
PIPETman loại 2 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
14
|
PIPETman loại 10 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
15
|
PIPETman loại 100 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
16
|
PIPETman loại 1000 ml
|
cái
|
36
|
0,12
|
17
|
Bút viết
|
cái
|
6
|
0,03
|
18
|
Bút viết kính
|
cái
|
6
|
0,03
|
19
|
Sổ thí nghiệm
|
quyển
|
48
|
0,03
|
20
|
Đèn neon 40W
|
bộ
|
48
|
0,96
|
21
|
Máy hút ẩm 2 kW
|
cái
|
36
|
0,06
|
22
|
Máy hút bụi 1,5 kW
|
cái
|
36
|
0,01
|
23
|
Quạt thông gió 40W
|
cái
|
12
|
0,16
|
24
|
Quạt trần 100W
|
cái
|
60
|
0,16
|
25
|
Điện năng
|
kW
|
|
1,67
|
2.2. Định mức thiết bị: ca/mẫu
2.2.1. Tách chiết ADN
Bảng số 07
TT
|
Danh mục thiết
bị
|
ĐVT
|
Công suất
|
Mức (ca/mẫu)
|
a
|
Tách chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn gốc từ
thực vật dựa trên CTAB
|
|
|
|
1
|
Điều hòa nhiệt độ
|
cái
|
2,20
|
0,13
|
2
|
Nồi hấp dụng cụ
|
cái
|
2,00
|
0,02
|
3
|
Tủ hút độc
|
cái
|
1,00
|
0,40
|
4
|
Tủ lạnh bảo quản mẫu
|
cái
|
0,10
|
0,40
|
5
|
Máy ly tâm
|
cái
|
0,30
|
0,03
|
6
|
Cân phân tích
|
cái
|
0,01
|
0,03
|
7
|
Máy đo pH
|
cái
|
0,02
|
0,03
|
8
|
Bình chứa nitơ lỏng
|
cái
|
|
0,40
|
9
|
Máy ủ nhiệt
|
cái
|
0,10
|
0,40
|
|
Điện năng
|
kW
|
|
6,85
|
b
|
Tách chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn gốc từ động
vật dựa trên phenol/cloroform
|
|
|
Theo quy định tại
mục a trên
|
c
|
Tách chiết ADN đối với nấm men, nấm sợi thu được
từ thực phẩm dựa trên phenol/cloroform
|
|
|
|
1
|
Điều hòa nhiệt độ
|
cái
|
2,20
|
0,13
|
2
|
Nồi hấp dụng cụ
|
cái
|
2,00
|
0,03
|
3
|
Tủ hút độc
|
cái
|
1,00
|
0,40
|
4
|
Tủ lạnh bảo quản mẫu
|
cái
|
0,10
|
0,40
|
5
|
Máy ly tâm
|
cái
|
0,30
|
0,03
|
6
|
Cân phân tích
|
cái
|
0,01
|
0,03
|
7
|
Máy đo pH
|
cái
|
0,02
|
0,03
|
8
|
Bình chứa nitơ lỏng
|
cái
|
|
0,40
|
9
|
Máy ủ nhiệt
|
cái
|
0,10
|
0,40
|
10
|
Máy nghiền bi
|
cái
|
0,10
|
0,03
|
11
|
Điện năng
|
kW
|
|
7,05
|
2.2.2. Đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng
ADN của sinh vật biến đổi gen
Bảng số 08
TT
|
Danh mục thiết
bị
|
ĐVT
|
Công suất
|
Mức (ca/mẫu)
|
1
|
Máy điều hòa
|
cái
|
2,20
|
0,06
|
2
|
Tủ lạnh giữ mẫu
|
cái
|
0,10
|
0,20
|
3
|
Máy ly tâm
|
cái
|
0,30
|
0,01
|
4
|
Máy soi gel nối với máy tính
|
cái
|
0,03
|
0,01
|
5
|
Bộ điện di ngang và nguồn điện
|
cái
|
0,05
|
0,05
|
6
|
Máy đo pH để bàn
|
cái
|
0,05
|
0,01
|
7
|
Cân phân tích
|
cái
|
0,01
|
0,01
|
8
|
Máy đo quang phổ
|
cái
|
0,05
|
0,08
|
9
|
Máy vi tính
|
cái
|
0,40
|
0,08
|
10
|
Máy in laser A4
|
cái
|
0,40
|
0,01
|
12
|
Điện năng
|
kW
|
|
1,67
|
2.2.3. Phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến
đổi gen bằng kỹ thuật PCR
Bảng số 09
TT
|
Danh mục thiết
bị
|
ĐVT
|
Công suất
|
Mức (ca/mẫu)
|
1
|
Máy điều hòa
|
cái
|
2,20
|
0,16
|
2
|
Máy ly tâm
|
cái
|
0,30
|
0,03
|
3
|
Tủ lạnh giữ mẫu
|
cái
|
0,10
|
0,48
|
4
|
Cân phân tích
|
cái
|
0,01
|
0,03
|
5
|
Máy soi gel nối với máy tính
|
cái
|
0,03
|
0,12
|
6
|
Máy nhân gen (PCR)
|
cái
|
0,30
|
0,06
|
7
|
Bộ điện di ngang và nguồn điện
|
cái
|
0,05
|
0,12
|
8
|
Máy vi tính
|
cái
|
0,40
|
0,09
|
9
|
Máy in laser A4
|
cái
|
0,40
|
0,01
|
11
|
Điện năng
|
kW
|
|
4,06
|
2.2.4. Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen
bằng kỹ thuật real-time PCR
Bảng số 10
TT
|
Danh mục thiết
bị
|
ĐVT
|
Công suất
|
Mức (ca/mẫu)
|
1
|
Điều hòa nhiệt độ
|
cái
|
2,20
|
0,16
|
2
|
Máy real-time PCR
|
cái
|
0,45
|
0,18
|
3
|
Tủ lạnh bảo quản mẫu
|
cái
|
0,10
|
0,48
|
4
|
Máy ly tâm
|
cái
|
0,30
|
0,03
|
5
|
Tủ giữ mẫu đông lạnh (-20°C)
|
cái
|
0,15
|
0,48
|
6
|
Máy vi tính
|
cái
|
0,40
|
0,18
|
7
|
Máy in laser A4
|
cái
|
0,40
|
0,02
|
8
|
Máy photocopy
|
cái
|
1,50
|
0,05
|
9
|
Điện năng
|
kW
|
|
6,40
|
2.3. Định mức vật liệu: tính cho 1
mẫu
2.3.1. Tách chiết ADN
a) Tách chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn gốc từ
thực vật dựa trên CTAB
Bảng số 11
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
Nitơ lỏng
|
lít
|
0,50
|
2
|
CTAB (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,001
|
3
|
RNase (25 mg)
|
lọ
|
0,02
|
4
|
Na2EDTA (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,002
|
5
|
Tris-Cl (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,0002
|
6
|
Cloroform
|
lít
|
0,01
|
7
|
2-isopropanol
|
lít
|
0,0015
|
8
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
0,02
|
9
|
Proteinase K (25 mg)
|
lọ
|
0,05
|
10
|
Alpha amylase (100 mg)
|
lọ
|
0,005
|
11
|
Ethanol
|
lít
|
0,01
|
12
|
NaCl
|
kg
|
0,0011
|
13
|
HCl 37%
|
lít
|
0,005
|
14
|
NaOH
|
kg
|
0,001
|
15
|
Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi)
|
túi
|
0,20
|
16
|
Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi)
|
túi
|
0,04
|
17
|
Khẩu trang dùng 1 lần (50 chiếc/hộp)
|
hộp
|
0,08
|
18
|
Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
19
|
Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
20
|
Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,03
|
21
|
Ống eppendorf 2 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,005
|
22
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,01
|
b) Tách chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn gốc từ
động vật dựa trên phenol/cloroform
Bảng số 12
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
Nitơ lỏng
|
lít
|
0,50
|
2
|
Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g
|
lọ
|
0,025
|
3
|
RNase (12 mg)
|
lọ
|
0,04
|
4
|
Na2EDTA (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,004
|
5
|
Tris-Cl (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,002
|
6
|
Cloroform
|
lít
|
0,0216
|
7
|
Phenol
|
lít
|
0,025
|
8
|
Isoamyl alcohol
|
lít
|
0,001
|
9
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
0,02
|
10
|
Proteinase K (25 mg)
|
lọ
|
0,16
|
11
|
Acid acetic băng
|
lít
|
0,001
|
12
|
Ethanol
|
lít
|
0,02
|
13
|
Kali acetat
|
kg
|
0,001
|
14
|
Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi)
|
túi
|
0,2
|
15
|
Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi)
|
túi
|
0,04
|
16
|
Khẩu trang dùng 1 lần (50 cái/hộp)
|
hộp
|
0,08
|
17
|
Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
18
|
Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi)
|
túi
|
0,04
|
19
|
Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,03
|
20
|
Ống eppendorf 2 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,015
|
21
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,01
|
c) Tách chiết ADN đối với nấm men và nấm sợi thu được
từ thực phẩm dựa trên phenol/ cloroform
Bảng số 13
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
RNase (25 mg)
|
lọ
|
0,004
|
2
|
Na2EDTA(500 g/lọ)
|
lọ
|
0,0006
|
3
|
Tris-CI (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,0002
|
4
|
Cloroform
|
lít
|
0,0015
|
5
|
Phenol
|
lít
|
0,0016
|
6
|
Isoamyl alcohol
|
lít
|
0,0006
|
7
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
0,02
|
8
|
Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g
|
lọ
|
0,012
|
9
|
Acid acetic glacial
|
lít
|
0,001
|
10
|
Ethanol
|
lít
|
0,003
|
11
|
Kali acetat
|
kg
|
0,001
|
12
|
Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi)
|
túi
|
0,10
|
13
|
Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi)
|
túi
|
0,10
|
14
|
Khẩu trang dùng 1 lần (50 cái/hộp)
|
hộp
|
0,08
|
15
|
Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,03
|
16
|
Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
17
|
Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,01
|
18
|
Ống eppendorf 2 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,01
|
19
|
Hạt thủy tinh 100 g
|
lọ
|
0,01
|
20
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,01
|
2.3.2. Đánh giá chất lượng và xác định hàm lượng
ADN của sinh vật biến đổi gen (tính cho 1 mẫu)
Bảng số 14
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
Tris-Cl (1000 g/lọ)
|
lọ
|
0,02
|
2
|
Na2EDTA (500g/lọ)
|
lọ
|
0,001
|
3
|
H3BO3 (500g/lọ)
|
lọ
|
0,002
|
4
|
Glycerol (1000 ml/lọ)
|
lọ
|
0,005
|
5
|
Bromophenol blue (5g/lọ)
|
lọ
|
0,0005
|
6
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
1,00
|
7
|
Ethidium bromide (10 mg/lọ)
|
lọ
|
0,05
|
8
|
Thang ADN chuẩn 1 kb (100 ml/ống)
|
ống
|
0,05
|
9
|
Agarose (100 g/lọ)
|
lọ
|
0,005
|
10
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,01
|
11
|
Găng tay
|
hộp
|
0,04
|
12
|
Parafilm (0,1 x 38m)
|
cuộn
|
0,001
|
13
|
Đầu côn loại 10 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,05
|
14
|
Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
15
|
Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi)
|
túi
|
0,05
|
16
|
Cuvet nhựa
|
cái
|
5,00
|
17
|
Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,025
|
2.3.3. Phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật
biến đổi gen: tính cho 1 mẫu - sử dụng 5 cặp mồi
Bảng số 15
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
Các cặp mồi (Primers)
|
nucleotide
|
0,005
|
2
|
Taq polymerase (100 units/lọ)
|
lọ
|
0,05
|
3
|
dNTPs 100 mM, 1ml/lọ
|
lọ
|
0,005
|
4
|
Ethidium bromide (10 mg/Iọ)
|
lọ
|
0,10
|
5
|
Tris Cl (500 g/lọ)
|
lọ
|
0,08
|
6
|
EDTA (500g/lọ)
|
lọ
|
0,002
|
7
|
Glycerol (1000 ml/lọ)
|
lọ
|
0,0005
|
8
|
Bromophenol blue (5g/lọ)
|
lọ
|
0,0005
|
9
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
1,50
|
10
|
Agarose (100 g/lọ)
|
lọ
|
0,01
|
11
|
Thang ADN chuẩn 1 kb (100 ml/ống)
|
ống
|
0,1
|
12
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,05
|
13
|
Găng tay (50 đôi/hộp)
|
hộp
|
0,08
|
14
|
Khẩu trang (50 cái/hộp)
|
hộp
|
0,08
|
15
|
Đầu côn loại 10 mI (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,05
|
16
|
Đầu côn loại 100 ml, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,04
|
17
|
Ống PCR 0,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,05
|
18
|
Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,01
|
2.3.4. Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen:
tính cho 1 mẫu
Bảng số 16
TT
|
Danh mục vật liệu
|
ĐVT
|
Mức
|
1
|
Các cặp mồi nucleotide
|
nucleotide
|
0,005
|
2
|
Các trình tự nucleotide đặc hiệu chuỗi được đánh
dấu huỳnh quang
|
trình tự
nucleotide
|
0,005
|
3
|
Nước cất khử ion vô trùng
|
lít
|
0,005
|
4
|
LightCycle® Taqman Master CAT.No 04535286001 (bao
gồm: FastStart Taq ADN Polymerase, đệm phản ứng, MgCl2 và dNTP (dùng dUTP
thay thế dTTP)
|
kít
|
0,17
|
5
|
LightCycle® Uracil N-glycosylase (tối ưu)
|
kít
|
0,02
|
6
|
Đầu côn loại 10 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
7
|
Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
8
|
Ống eppendorf loại 1,5 ml (500 cái/túi)
|
túi
|
0,02
|
9
|
Ống mao quản cho phản ứng real-time PCR (96 ống/hộp)
|
hộp
|
0,18
|
10
|
Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn
|
lít
|
0,10
|
11
|
Găng tay (dùng 1 lần)
|
hộp
|
0,06
|
12
|
Giấy A4
|
ram
|
0,02
|
13
|
Mực in
|
hộp
|
0,004
|
14
|
Mực photocopy
|
hộp
|
0,008
|
PHỤ LỤC
QUY
TRÌNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT DEOXYRIBONUCLEIC
(Ban hành kèm theo Thông tư số 13/2013/TT-BTNMT ngày 21 tháng 6 năm 2013
của Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường)
1. Tách chiết ADN
Đối với động vật, thực vật và vi sinh vật thì
phương pháp tách chiết ADN được áp dụng theo các phương pháp khác nhau, như
sau:
a) Phương pháp chiết ADN các mẫu sinh học có nguồn
gốc từ thực vật dựa trên CTAB
Phương pháp này sử dụng để chiết ADN từ thực vật và
các loại chất nền có nguồn gốc từ thực vật, do có khả năng loại bỏ các hợp chất
polysacarit và polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng ADN. Phương pháp này
cũng có thể dùng cho các loại chất nền khác.
Các bước tiến hành cơ bản:
- Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn bằng cối chày sứ
trong nitơ lỏng;
- Phân giải mẫu bằng nhiệt với sự có mặt của CTAB,
tùy thuộc vào loại chất nền, cần bổ sung thêm các enzyme khác vào đệm chiết như
alpha amylaza để thủy phân tinh bột, enzyme proteinaza-K để loại trừ protein và
enzyme Ribonucleaza để phân giải RNA;
- Loại bỏ các tạp chất như các polysacarit và các
protein bằng cloroform;
- Kết tủa các ADN bởi isopropanol và rửa bằng
ethanol.
b) Phương pháp chiết ADN từ các mẫu sinh học có
nguồn gốc từ động vật dựa trên phenol/ cloroform
Phương pháp này có thể dùng để chiết ADN ra khỏi
các loại chất nền khác nhau. Phenol thường rất thích hợp để biến tính các
protein và phá hủy các enzyme nucleaza.
Các bước tiến hành cơ bản:
- Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn bằng cồi chày sứ
trong nitơ lỏng;
- Phân hủy mẫu dưới sự có mặt của natri dodecyl
sulfat và hàm lượng EDTA cao; tùy thuộc vào loại chất nền cần bổ sung thêm
enzyme proteinaza-K để loại trừ protein và enzyme Rnaza để phân giải RNA;
- Loại bỏ các tạp chất như các phân tử ưa mỡ, các
chất polysacarit, các protein và các nuleaza bằng phenol và cloroform;
- Kết tủa ADN cuối cùng bởi isopropanol và rửa bằng
ethanol loại trừ các muối và cloroform còn dư.
c) Phương pháp chiết ADN đối với các mẫu sinh học
có nguồn gốc từ vi sinh vật dựa trên phenol/cloroform
Phương pháp này mô tả qui trình chiết và tinh sạch
ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR từ nấm men hoặc nấm sợi, hoặc các quần
thể vi khuẩn được phân lập. Phương pháp này cũng thích hợp đối với việc truy
nguyên ADN từ các sinh vật biến đổi gen trong các loại chất nền phức hợp cao.
Việc phân lập vi khuẩn ra khỏi chất nền, nuôi cấy
vi khuẩn tăng thu sinh khối tế bào, sau đó tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn
phân lập sẽ cho kết quả tin cậy nhất.
Các bước tiến hành cơ bản:
- Các vi khuẩn, nấm men hoặc nấm sợi bị phá vỡ và
ADN được tách chiết đồng thời bằng cách nghiền trong hỗn hợp
Tris-phenol-cloroform-EDTA-SDS với tốc độ cao trong sự có mặt của các hạt thủy
tinh;
- Đối với phản ứng PCR định lượng cần ủ mẫu với
Rnaza để phân giải RNA;
- Kết tủa ADN bằng ethanol.
2. Đánh giá chất lượng và xác
định hàm lượng ADN
Hai phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN
trong dung dịch:
Phương pháp điện di
ADN được phân tách bằng phương pháp điện di trên
khuôn gel agarose dựa trên điện tích và phân tử lượng của chính nó. Sau khi điện
di, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Ethidium bromide (EtBr), EtBr sẽ liên kết
vào các phân tử ADN và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang
da cam. Do lượng huỳnh quang tỉ lệ với lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có
trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu
chưa biết với một dãy định lượng chuẩn.
Đo hàm lượng ADN bằng quang phổ
Các acid nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh
sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở
260 nm. Vì các ADN và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260
nm, nên ADN không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi
dung dịch bị nhiễm nucleotide và RNA. Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương
pháp thủy phân với enzyme RNase. Các nucleotide và oligonucleotide thu được từ
thủy phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ sẽ dẫn đến đánh giá thừa
hàm lượng ADN của mẫu thử. Ngoài ra ADN xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn ADN
xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ.
Việc chuẩn máy đo quang phổ cần được thực hiện định
kỳ bằng cách đo nồng độ của các dung dịch ADN đối chứng.
3. Phát hiện và nhận dạng ADN
của sinh vật biến đổi gen (định tính) thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp (kỹ
thuật PCR)
Nguyên tắc chung
Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu
của các đoạn ADN có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ
enzym Taq ADN polymerase để khuyếch đại theo hàm mũ các đoạn ADN đích
lên hàng triệu lần. PCR được xem như là một bản dịch đơn giản hóa của quá trình
sao mã ADN mà quá trình này xuất hiện trong suốt thời kì phân chia tế bào. PCR
bao gồm 3 bước chính: biến tính đoạn ADN, gắn mồi oligonucleotide tổng hợp, kéo
dài mồi bởi ADN polymerase. Chu kì gồm 3 bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần,
mỗi lần làm tăng gấp đôi số lượng sản phẩm ban đầu. Sự khuếch đại này được tính
theo công thức x(1+E)n với x là số lượng mẫu ban đầu,
E là hiệu suất của quá trình khuếch đại, n là chu kì của phản ứng PCR. Sau một
vài chu kì, sản phẩm tạo thành được tính bằng kích thước giữa hai đầu cuối 5’ của
hai đoạn mồi.
Các phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN của sinh
vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR bao gồm các phương pháp như sau:
Phương pháp đặc hiệu taxon - đích
Taxon là cấp phân loại, đơn vị phân loại. Taxon
đích là đơn vị phân loại của sinh vật biến đổi gen. Đây là phương pháp thông
thường để phát hiện trình tự ADN trong một taxon đích, thường là một loài nhưng
có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn. Các phương pháp dựa vào taxon
đích để đánh giá sự có mặt, chất lượng và số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon và
đôi khi còn được sử dụng là đơn vị chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có
nguồn gốc biến đổi gen.
Ví dụ trình tự nucleotide của gen lectin Le1
đậu tương thu được từ Ngân hàng dữ liệu gen được sử dụng làm gen đơn đặc hiệu
trong xác định đặc hiệu taxon đích để phát hiện thành phần từ đậu tương.
Phương pháp sàng lọc PCR để phát hiện ADN của
sinh vật biến đổi gen
Phương pháp sàng lọc PCR là phương pháp phát hiện
các yếu tố di truyền thông thường đối với một số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn
như gen khởi động, gen kết thúc hoặc một số yếu tố di truyền được quan tâm khác).
Phương pháp sàng lọc nhanh và đáng tin cậy một số lượng lớn các mẫu thử.
Phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR
chủ yếu dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter và terminator. Hầu hết
các trình tự ADN chuyển vào hệ gen thực vật dưới sự điều khiển CaMV 35S
promoter, chỉ có một vài trường hợp sử dụng các promoter biểu hiện đặc hiệu ở
phần chuyển hóa như rễ, thân, hạt... hay các promoter cảm ứng. Hiện nay rất nhiều
các cây trồng biến đổi gen đã được cấp phép trồng mang ít nhất một bản sao của
35S promoter và T-Nos terminator (phân lập từ gen tổng hợp nopaline ở Agrobacterium
tumefaciens). Một gen khác được sử dụng khá phổ biến là gen chọn lọc
kanamycin nptII phân lập từ Escherichia coli transposon 5. Vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens và virus khảm súp lơ (Cauliflower mosaic
virus) đều nằm trong các danh mục các loài gây hại cho thực vật và đặc biệt
virus khảm súp lơ ngoài gây bệnh cho súp lơ còn gây bệnh cho các thành viên
khác thuộc họ Brassicceae (Cruciferae) cũng như họ Resedaceae và Solanaceae.
Vì thế, kết quả dương tính từ các mẫu Brassicaceae, Resedceae và Solanaceae
cần được xử lý cẩn thận. Để phân biệt giữa nhiễm virus và vật liệu biến đổi gen
cần có phương pháp phát hiện virus.
Đối với động vật biến đổi gen, thường các promoter
sử dụng có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine
kinase, b-actin, amylase, insulin, b-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ
virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)... Tuy nhiên
do các promoter có nguồn gốc từ động vật dễ gây ra nhầm lẫn với promoter nội
sinh của vật chủ, nên các promoter có nguồn gốc từ virus động vật có thể được sử
dụng để sàng lọc sự có mặt của ADN có nguồn gốc động vật.
Phương pháp nhận dạng cấu trúc đặc thù (event
specific) để phát hiện trình tự gen đích của các sản phẩm biến đổi gen
Phương pháp này được sử dụng nhằm phát hiện sự tổ hợp
của các trình tự ADN được đưa vào hệ gen vật chủ, cấu trúc này chỉ tìm thấy
trong các dòng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen. Trường hợp để phát hiện
ngô T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen trong
các nguyên liệu thô bằng cách khuếch đại vùng nối giữa trình tự ADN có nguồn gốc
từ promoter 35S-CaMV và gen pat (gen kháng thuốc trừ cỏ). Phương pháp này không
phân biệt được các giống ngô mà chỉ sử dụng để phát hiện sự có mặt của đoạn gen
chuyển trong hạt và cây ngô.
Kích thước của đoạn gen đích sau khi khuếch đại bằng
phản ứng PCR được xác định khi kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích
thước của đoạn ADN đích dự kiến. Các sản phẩm PCR được phân tích và xử lý bằng
phương pháp điện di trên gel agarose và nhuộm bởi ethidium bromide. Gel agarose
1,5 % là thích hợp để phân tích các sản phẩm của PCR từ 150-1000 bp. Thang ADN
chuẩn có kích thước trong khoảng 0,1-10kb để phân biệt độ lớn các đoạn
nucleotide khác nhau.
4. Định lượng ADN của sinh vật
biến đổi gen bằng kỹ thuật real-time PCR
Real-time PCR có thể được hiểu là phản ứng PCR động
(kinetic PCR) mà trong đó số liệu phân tích được thu nhận thông qua phản ứng
PCR, chính vì vậy mà sự nhân bản các gen đặc hiệu và việc phát hiện các sản phẩm
có thể được kết hợp trong cùng một bước tiến hành thông qua việc sử dụng các loại
chất phát huỳnh quang trong phản ứng. Cường độ huỳnh quang biểu thị nồng độ sản
phẩm PCR tạo thành. Phản ứng được xác định sau các điểm thời gian (hoặc các chu
kì PCR) mà trong đó sự nhân bản trình tự đích sẽ được phát hiện đầu tiên. Giá
trị này được biểu thị với tên gọi là ngưỡng chu kì Ct (cycle
threshold), đây chính là thời điểm mà cường độ huỳnh quang lớn hơn giá trị huỳnh
quang cơ sở. Lượng ADN đích được nhân bản càng nhiều thì tín hiệu phát huỳnh
quang càng nhanh, do vậy mà giá trị Ct sẽ càng thấp.
Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại
thuốc nhuộm liên kết ADN sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe
hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR).
Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện
tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra.
Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi
chu kỳ.
Trong phân tích định lượng ADN của sinh vật biến đổi
gen và các sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen, cần thiết phải xác định một gen
chuẩn - gen tham chiếu (là gen nội sinh của sinh vật chuyển gen) để chuẩn hóa
phương pháp. Gen chuẩn này phải phù hợp với các điều kiện: i) trình tự có tính
đặc hiệu cao; ii) có một bản sao duy nhất trong bộ gen đoa bội, iii) biểu hiện ổn
định trong các dòng khác nhau của cùng một loài. Do vậy trong real-time PCR định
lượng cần có hai loại phản ứng cho gen đích và cho gen tham chiếu. Đối với
phương pháp này thì hiệu quả nhân bản của các mẫu chuẩn và các mẫu nghiên cứu
được coi là như nhau.
Để dựng đường chuẩn của gen đích cần tách chiết ADN
tổng số của mẫu chuẩn (là ADN tách chiết từ vật liệu chuẩn đã được chứng nhận
như ADN của sinh vật biến đổi gen hay ADN plasmid mang trình tự gen đích) và mẫu
đối chứng âm (vật liệu chuẩn đã biết không chứa trình tự gen đích).
Ví dụ: trong phân tích định lượng ADN từ các
sản phẩm có nguồn gốc từ ngô chuyển gen Bt11, để dựng đường chuẩn của gen đích,
ADN tổng số của ngô chuyển gen Bt11 (100% Bt là mẫu chuẩn đã được chứng nhận hợp
lệ) và ngô không chuyển gen được tách chiết và định lượng. Pha loãng ADN của Bt11
thành các mẫu (M1-M6) mang số bản sao bộ gen đơn bội khác nhau như sau:
M1:20000; M2:5000; M3: 1250; M4: 312; M5: 78; và M6: 19 (được biết bộ gen đơn bội
của ngô có khối lượng 2,725 pg). Trộn ADN của Bt11 đã pha loãng với ADN của ngô
không chuyển gen để đảm bảo lượng ADN ở mỗi mẫu là bằng nhau. Để dựng đường chuẩn
của gen tham chiếu - adh1, ADN tổng số của ngô không chuyển gen được
tách chiết, định lượng và pha loãng thành các mẫu (S1-S6) mang số bản sao bộ
gen đơn bội khác nhau như sau: S1: 183486; S2: 61162; S3: 20387; S4: 6796; S5:
2265; và S6:755 (được biết bộ gen đơn bội của ngô có khối lượng 2,725 pg).
Hiệu chỉnh và tính toán kết quả
Bằng cách sử dụng các mẫu đã được pha loãng với nồng
độ đã biết để tạo ra một đường chuẩn cho cả gen chuẩn và gen đích. Đường chuẩn
này thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct và nồng độ ADN
ban đầu, căn cứ vào đó có thể xác định được nồng độ ADN của các mẫu nghiên cứu
căn cứ vào giá trị Ct của các mẫu này.
Đầu tiên, ta phải xây dựng được 2 đường chuẩn cho
gen chuẩn và gen đích. Trong đó một cột sẽ là nồng độ ADN, và cột còn lại sẽ là
số bản sao của gen đó.
Để định lượng tỷ lệ phần trăm sinh vật biến đổi gen
đối với một mẫu, cần thiết phải xác định được 2 giá trị là số bản sao của gen
đích và số bản sao của gen chuẩn.
Tỷ lệ phần trăm (%) sinh vật biến đổi gen (GM)
trong một mẫu là tỉ lệ % của số bản sao gen đích so với số bản sao gen chuẩn,
được tính bằng công thức sau:
Tỷ lệ % sinh vật biến đổi gen = (số bản sao của gen
đích/số bản sao của gen chuẩn) x 100./.
Thông tư 13/2013/TT-BTNMT Quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic do Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban hành
Văn bản này chưa cập nhật nội dung Tiếng Anh
Thông tư 13/2013/TT-BTNMT ngày 21/06/2013 Quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic do Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban hành
8.147
|
NỘI DUNG SỬA ĐỔI, HƯỚNG DẪN
Văn bản bị thay thế
Văn bản thay thế
Chú thích
Chú thích:
Rà chuột vào nội dụng văn bản để sử dụng.
<Nội dung> = Nội dung hai
văn bản đều có;
<Nội dung> =
Nội dung văn bản cũ có, văn bản mới không có;
<Nội dung> = Nội dung văn
bản cũ không có, văn bản mới có;
<Nội dung> = Nội dung được sửa đổi, bổ
sung.
Click trái để xem cụ thể từng nội dung cần so sánh
và cố định bảng so sánh.
Click phải để xem những nội dung sửa đổi, bổ sung.
Double click để xem tất cả nội dung không có thay
thế tương ứng.
Tắt so sánh [X] để
trở về trạng thái rà chuột ban đầu.
FILE ĐƯỢC ĐÍNH KÈM THEO VĂN BẢN
FILE ATTACHED TO DOCUMENT
|
|
|
Địa chỉ:
|
17 Nguyễn Gia Thiều, P. Võ Thị Sáu, Q.3, TP.HCM
|
Điện thoại:
|
(028) 3930 3279 (06 lines)
|
E-mail:
|
info@ThuVienPhapLuat.vn
|
Mã số thuế:
|
0315459414
|
|
|
TP. HCM, ngày 31/05/2021
Thưa Quý khách,
Đúng 14 tháng trước, ngày 31/3/2020, THƯ VIỆN PHÁP LUẬT đã bật Thông báo này, và nay 31/5/2021 xin bật lại.
Hơn 1 năm qua, dù nhiều khó khăn, chúng ta cũng đã đánh thắng Covid 19 trong 3 trận đầu. Trận 4 này, với chỉ đạo quyết liệt của Chính phủ, chắc chắn chúng ta lại thắng.
Là sản phẩm online, nên 250 nhân sự chúng tôi vừa làm việc tại trụ sở, vừa làm việc từ xa qua Internet ngay từ đầu tháng 5/2021.
Sứ mệnh của THƯ VIỆN PHÁP LUẬT là:
sử dụng công nghệ cao để tổ chức lại hệ thống văn bản pháp luật,
và kết nối cộng đồng Dân Luật Việt Nam,
nhằm:
Giúp công chúng “…loại rủi ro pháp lý, nắm cơ hội làm giàu…”,
và cùng công chúng xây dựng, thụ hưởng một xã hội pháp quyền trong tương lai gần;
Chúng tôi cam kết dịch vụ sẽ được cung ứng bình thường trong mọi tình huống.
THÔNG BÁO
về Lưu trữ, Sử dụng Thông tin Khách hàng
Kính gửi: Quý Thành viên,
Nghị định 13/2023/NĐ-CP về Bảo vệ dữ liệu cá nhân (hiệu lực từ ngày 01/07/2023) yêu cầu xác nhận sự đồng ý của thành viên khi thu thập, lưu trữ, sử dụng thông tin mà quý khách đã cung cấp trong quá trình đăng ký, sử dụng sản phẩm, dịch vụ của THƯ VIỆN PHÁP LUẬT.
Quý Thành viên xác nhận giúp THƯ VIỆN PHÁP LUẬT được tiếp tục lưu trữ, sử dụng những thông tin mà Quý Thành viên đã, đang và sẽ cung cấp khi tiếp tục sử dụng dịch vụ.
Thực hiện Nghị định 13/2023/NĐ-CP, chúng tôi cập nhật Quy chế và Thỏa thuận Bảo về Dữ liệu cá nhân bên dưới.
Trân trọng cảm ơn Quý Thành viên.
Tôi đã đọc và đồng ý Quy chế và Thỏa thuận Bảo vệ Dữ liệu cá nhân
Tiếp tục sử dụng
![](https://cdn.thuvienphapluat.vn/images/icon_gototop.png)
Cảm ơn đã dùng ThuVienPhapLuat.vn
- Bạn vừa bị Đăng xuất khỏi Tài khoản .
-
Hiện tại có đủ người dùng cùng lúc,
nên khi người thứ vào thì bạn bị Đăng xuất.
- Có phải do Tài khoản của bạn bị lộ mật khẩu
nên nhiều người khác vào dùng?
- Hỗ trợ: (028) 3930.3279 _ 0906.229966
- Xin lỗi Quý khách vì sự bất tiện này!
Tài khoản hiện đã đủ người
dùng cùng thời điểm.
Quý khách Đăng nhập vào thì sẽ
có 1 người khác bị Đăng xuất.
Tài khoản của Quý Khách đẵ đăng nhập quá nhiều lần trên nhiều thiết bị khác nhau, Quý Khách có thể vào đây để xem chi tiết lịch sử đăng nhập
Có thể tài khoản của bạn đã bị rò rỉ mật khẩu và mất bảo mật, xin vui lòng đổi mật khẩu tại đây để tiếp tục sử dụng
|
|