Mồi
|
Trình tự
|
Sản phẩm
|
7171 F
|
5'- CGA CAG TTG GAC
ATC TAG TG -3'
|
341 bp
|
7511 R
|
5'- GAG CTT CAG ACT
GCA AGT TC -3'
|
5.1.2
Dung dịch mồi
Dùng
dung dịch đệm TE (5.1.3) để pha loãng mồi đến nồng độ 25 mM.
5.1.3 Dung dịch đệm TE
(Tris - EDTA)
Chuẩn
bị dung dịch
chứa
Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH
7,6.
5.2
Thuốc thử tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm
5.2.1 Dung dịch
đệm ly giải
Chuẩn bị 25
ml dung dịch gồm: guanidin-HCl 4,5 M, natri phosphat 100 mM, pH 6,6. Bảo quản ở
25 oC.
5.2.2 Dung dịch
đệm I (DNAaza I)
Chuẩn bị 500
µl dung dịch DNAaza I gồm enzym DNAaza 5 U/µl và dung dịch đệm rửa giải
(5.2.6), trộn kỹ, bảo quản ở –15 oC đến –25 oC.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chuẩn bị 10 ml dung dịch gồm NaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, MnCl2 10
mM, có pH 7,0. Bảo quản ở 25 oC.
5.2.4 Dung
dịch đệm rửa I
Chuẩn bị 33
ml dung dịch gồm guanidin-HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm 20 ml etanol
tinh khiết. Bảo quản ở 25 oC.
5.2.5 Dung
dịch đệm rửa II
Chuẩn bị 10
ml dung dịch gồm NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5. Thêm 40 ml etanol
tinh khiết. Bảo quản ở 25 oC.
5.2.6 Dung dịch đệm
rửa giải
Chuẩn bị 30 ml nước cất hai
lần vô trùng và đã được khử enzym nucleaza.
CHÚ
THÍCH Tách
chiết RNA được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, nhưng để đạt được kết
quả mong muốn có thể sử dụng một số kit tách chiết RNA thương mại có bán sẵn. Nên sử dụng
thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành
bộ chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới
đây.
5.3
Hỗn hợp phản ứng RT-PCR
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thành phần
25 µl/ống phản ứng
Nồng độ cuối
Nước thêm vào
6,5 µl
Dung dịch đệm EZ
đậm đặc 5 lần
5,0 µl
1X
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3,0 µl
300 µM mỗi loại
Mồi ngẫu nhiên pd
(T)12-18
1,0 µl
0,62 µM
Mồi 7171 F
1,0 µl
0,62 µM
Mồi 7511 R
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,62 µM
Mn(OAc)2
2,5 µl
2,5 mM
Enzym rTth DNA polymeraza
1,0 µl
2,5 U
DNA đích
4,0 µl
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.4
Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric -
EDTA 10X)
Hòa
tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Thêm 40 ml EDTA 0,5 M
(5.5) và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng, pha loãng dung dịch với nước thành dung
dịch 1X.
5.5
Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M
Hòa
tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4
M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo
quản ở nhiệt độ phòng.
5.6
Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần
Chuẩn
bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol
FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM [sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M (5.5)].
Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.
5.7
Dung dịch DEPC
Dung
dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để
qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.
5.8
Thạch agaroza 1,5 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.9
Bảng thạch agaroza
Chuẩn
bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, đổ thạch agaroza (5.8) vào khuôn với bề dày từ 3 mm đến 5 mm. Để nguội
và đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt thạch agaroza vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch
phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE 1X cho ngập mặt thạch
agaroza trước khi cho sản phẩm khuếch đại
vào để điện di.
5.10
Dung dịch etidi bromua (ethidium bromide)
Hút
5 µl dung dịch etidi bromua (10 mg/ml) hoà tan trong 100 ml nước. Bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn –20 °C.
5.11
Thang DNA
Sử dụng thang
đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 341 bp. Có thể sử dụng sản
phẩm khuếch đại có kích thước 341 bp đã biết trước.
6. Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng các
thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như
sau:
6.1 Máy chu
trình nhiệt,
có thể thực hiện chính xác và lặp lại chu trình thời gian và nhiệt độ được quy
định trong 7.4.5.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3 Máy ly
tâm lạnh,
có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 13 000 r/min.
6.4 Hệ thống
phát hiện các sản phẩm PCR, bao gồm:
a) bộ điện di;
b) khuôn,
khay, lược dùng để tạo bảng thạch agaroza;
c) bàn đọc
kết quả, với tia UV bước sóng 302 nm;
d) bộ phận
chụp ảnh để lưu kết quả, ví dụ: máy đọc Gel- Doc (nếu có).
6.5 Tủ đông, có
thể hoạt động ở nhiệt độ không lớn hơn –20 oC.
6.6 Tủ lạnh, có
thể hoạt động ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 oC.
6.7 Tủ thao
tác vô trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.9 Micropipet, dung tích 10 µl, 20
µl, 100 µl và 1000 µl; có đầu típ (với dung tích
không lớn hơn 10
µl phải sử dụng đầu típ có lọc).
6.10 Ống phản
ứng,
chuyên dùng cho PCR, dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.
6.11 Ống lọc
tinh,
dạng ống nhựa có 2 lớp màng lọc polypropylen, để chứa dịch mẫu.
6.12 Ống góp, dùng bọc
ngoài ống lọc tinh.
7. Cách
tiến hành
7.1 Chuẩn bị mẫu
7.1.1 Đối với
mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae)
Lượng mẫu
dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan
tuỵ.
7.1.2 Đối với
mẫu tôm bố mẹ
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.1.3 Đối với
mẫu tôm thương phẩm
Lượng mẫu cần
dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy ở phiến mang tôm, hoặc chân
bơi, chân bò hoặc phần cơ hoặc dịch bạch huyết của tôm khoảng 100 µl.
7.2
Tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm
Cho
mẫu (7.1) vào các ống phản ứng dung tích 1,5 ml, thêm 400 µl
dung dịch đệm ly giải (5.2.1), nghiền mẫu bằng chày
nghiền vô trùng.
Ly
tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, nhằm loại bỏ mô chưa thủy phân.
Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang các ống phản ứng dung
tích 1,5 ml chứa 200 µl etanol tinh khiết, trộn đều.
Gắn
ống lọc tinh (6.11) vào ống góp (6.12), chuyển toàn bộ dung dịch trên vào ống
lọc tinh. Ly tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 30 s. Loại bỏ phần nước
chứa trong ống góp, gắn ống góp mới vào ống lọc tinh.
Thêm
90 µl dung dịch đệm ủ DNA polymeraza (5.2.3) và 10 µl dung dịch đệm DNA
polymeraza I (5.2.2) vào ống lọc tinh, để 15 min ở nhiệt độ phòng.
Thêm
500 µl dung dịch đệm rửa I (5.2.4) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000
r/min trong 15 s, loại bỏ dịch trong ống góp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thêm 300 µl dung dịch đệm rửa II (5.2.5) vào ống lọc tinh, ly tâm
với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, loại bỏ dịch trong ống góp. Ly tâm các ống
góp chứa ống lọc tinh ở tốc độ cao nhất (có thể) trong 20 s để loại bỏ hoàn
toàn dung dịch đệm rửa.
Gắn
ống lọc tinh sang một ống phản ứng mới, dung tích 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch
đệm rửa giải (5.2.6) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1
min.
Loại
bỏ ống lọc tinh, sản phẩm RNA được chứa trong ống phản ứng 1,5 ml. Dịch tách
chiết RNA sử dụng ngay cho phản ứng khuếch đại hoặc bảo quản ở nhiệt độ –20
oC.
7.3
Chuẩn bị các kiểm chứng cho phản ứng RT-PCR
7.3.1
Mẫu kiểm soát
Nước
cất hai lần hoặc dung dịch DEPC.
7.3.2
Mẫu kiểm chứng âm tính
Mẫu
tôm không bị bệnh đã biết trước.
7.3.3
Mẫu kiểm chứng dương tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.4
Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA một bước
7.4.1
Mẫu thử
Hút
5 µl dịch RNA của mẫu vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).
7.4.2
Mẫu kiểm soát
Hút
5 µl dung dịch nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC vào ống hỗn hợp phản ứng
RT-PCR (5.3).
7.4.3
Mẫu kiểm chứng âm tính
Hút
5 µl dịch RNA của mẫu tôm đã biết trước không bị bệnh vào ống hỗn hợp phản ứng
RT-PCR (5.3).
7.4.4
Mẫu kiểm chứng dương tính
Hút
5 µl dịch RNA của mẫu tôm nhiễm TSV đã biết trước hoặc plasmid của TSV vào ống
hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.4.5 Đặt
các ống vào máy chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên
mã ngược (RT-PCR) theo chu kỳ luân nhiệt như sau:
Số chu kỳ
Nhiệt độ, oC
Thời gian
Bước
1
42
15 min
Tổng hợp cDNA
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2 min
Biến tính ban đầu
39
94
45 s
Biến tính
60
45 s
Lai/ bắt cặp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
45 s
Kéo dài mạch
1
72
1 min
Kéo dài mạch
4
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.4.6 Giữ
các sản phẩm khuếch đại ở 4,0 0C cho đến khi điện di.
7.5
Điện di
7.5.1 Cho
từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.6) vào các ống sản phẩm khuếch đại
(7.4.6) trộn đều.
7.5.2 Hút
từ 5 µl đến 7 µl dịch tương ứng từ các ống (7.5.1), theo thứ tự: thang DNA, các
mẫu thử, mẫu kiểm chứng âm tính và mẫu kiểm chứng dương tính, nhỏ vào từng
giếng trên bảng thạch agaroza (5.9).
7.5.3 Điện
di với hiệu điện thế từ 70 V đến 120 V. Kiểm tra bằng cách quan sát các bóng
khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện.
CHÚ
THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm của xanh
bromophenol; màu xanh nhạt của xylen xyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của
thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình
điện di. Sau đó, lấy thạch agaroza từ buồng điện di ra để nhuộm với etidi
bromua.
7.5.4 Nhuộm
etidi bromua: Đặt bảng thạch agaroza vừa điện di vào
khay nhựa sạch, đổ dung dịch etidi bromua (5.10) ngập
bảng thạch.
7.5.5 Lắc
nhẹ trong khoảng 20 min. Vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa bằng nước
cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.
7.5.6 Đặt
bảng thạch trên bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc chụp hình ảnh
bằng máy Gel- Doc (nếu có).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7.6.1 Dưới
ánh sáng của tia UV, các đoạn cDNA có gắn etidi bromua phát quang tạo thành
vạch sáng.
7.6.2 Đối
chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu kiểm chứng
dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.
7.6.3 Cách
đọc kết quả
Giếng
Vạch 341 bp
Kết quả
Thang DNA
Các vạch sáng rõ
ràng
Điện di tốt
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Không
Không ngoại nhiễm
Có
Bị ngoại nhiễm
Mẫu kiểm chứng dương tính
Có
Hỗn hợp phản ứng
RT-PCR tốt
Không
Mẫu kiểm chứng
dương tính hỏng hoặc enzym hỏng
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Có
Dương tính với TSV
Không
Âm tính với TSV
8. Diễn
giải kết quả
8.1 Kết quả âm tính với TSV
Kết quả được coi là âm tính khi:
a) mẫu thử không có vạch sáng kích thước 341 bp hoặc vạch sáng kích
thước khác với mẫu kiểm chứng dương tính;
b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.
8.2 Kết quả dương tính với TSV
Kết quả được coi là dương tính khi:
a) mẫu thử có vạch sáng kích thước 341 bp;
b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;
c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;
d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.
9 Báo cáo
thử nghiệm
Báo
cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu có);
– phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
– mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những
điều kiện được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có thể ảnh hưởng tới kết
quả (nếu có);
– kết quả thử nghiệm thu được.