Chất phản ứng
|
Nồng độ cuối cùng
|
Thể tích từng
mẫu (ml)
|
Plasmit pSC17
|
10 000 bản
sao ~6 pg
|
2,0
|
Nước
|
|
31,8
|
Dung dịch đệm PCR 10x (không có MgCI2)
|
1x
|
5,0
|
Dung dịch MgCI2a, 25 mmol/l
|
2,5 mmol/l
|
5,0
|
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
|
0,2 mmol/l
|
1,0
|
Mồi M13 (-26), 5 mmol/l
|
0,25 mmol/l
|
2,5
|
Mồi M13 (-20), 5 mmol/l
|
0,25 mmol/l
|
2,5
|
Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml
|
1 đơn vị
cho một phản ứng
|
0,2
|
a Nếu dung
dịch đệm PCR chứa sẵn MgCl2, thì nồng độ cuối
cùng của MgCl2 trong hỗn
hợp phản ứng phải được điều chỉnh cho đúng 2,5 mmol/l.
|
A.5.1.2. Chương trình
thời gian nhiệt độ
Chương trình thời gian nhiệt độ được
nêu trong Bảng A.2.
Chương trình này có thể được thay
đổi theo kiểu loại máy chu trình và/hoặc enzym sử dụng.
Bảng A.2 -
Chương trình thời gian nhiệt độ
Biến tính
ban đầu
2 min/95 oC
Khuếch đại
10 s/95 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20 s/72 oC
Số chu trình
40
Kéo dài cuối cùng
2 min/72 oC
A.5.1.3. Tinh sạch sản
phẩm PCR và xác định kết quả
Một lượng 5 ml của sản phẩm PCR được
tách bằng điện di trên gel agarose và được nhuộm với etidi bromua để
hiển thị sản phẩm PCR. Số thể
tích sản phẩm còn lại sẽ được tinh sạch và kết quả được xác định bằng
đo quang phổ hoặc phương pháp phù hợp bất kỳ[2].
A.5.1.4. Chuẩn bị các nồng độ
khuôn mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các sản phẩm PCR được chuẩn bị trong
nước ở 3 dung dịch có nồng độ khác nhau: 1 000 bản sao/ml, 100 bản sao/ml và 10 bản sao/ml.
Các nồng độ ADN đích được mã hóa như sau:
- a = 1 000 bản sao/ml (tương ứng với 5
000 bản sao cho một PCR);
- b = 100 bản sao/ml (tương ứng với 500
bản sao cho một PCR);
- c = 10 bản sao/ml (tương ứng với 50
bản sao cho một PCR).
A.5.2. Kiểm tra máy
chu trình nhiệt
A.5.2.1. Cài đặt PCR
Phương pháp này sử dụng thể tích PCR
cuối cùng là 50 ml cho một
phản ứng. Chất phản ứng và nồng độ cuối được nêu trong Bảng A.3.
Sử dụng ít nhất 16 phản ứng PCR cho
máy chu trình nhiệt 96 giếng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- chuẩn bị hỗn hợp PCR;
- chia hỗn hợp PCR ra làm 3 phần và 1
kiểm soát âm tính;
- thêm ADN đích ở 3 nồng độ khác nhau
vào 3 phần để tạo hỗn hợp đích PCR.
- chia mỗi hỗn hợp đích PCR ra làm 5
phần sao chép và đưa tất cả vào đĩa đựng
mẫu trong máy chu trình nhiệt ở những vị trí xác định.
Bảng A.3 - Chất phản ứng bổ sung
Thuốc thử
Nồng độ cuối cùng
Thể tích
cho một mẫu (ml)
Thể tích khuyến cáo cho
16 mẫu (ml)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
24,78
401,48b
Dung dịch đệm PCR 10x
(không chứa MgCl2)
1x
5,0
80,0
Dung dịch MgCI2a, 25 mmol/l
3 mmol/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
96,0
Dung dịch dNTP, 10 mmol/l
0,2 mmol/l
1,0
16,0
Mồi VAL1, 5mmol/l
0,4 mmol/l
4,0
64,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,4 mmol/l
4,0
64,0
Taq-ADN-polymerase, 5 U/ml
1,1 đơn vị
cho một phản ứng
0,22
3,52
a Nếu dung dịch đệm
PCR đã chứa MgCl2, thì nồng độ
cuối cùng của MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng phải được điều chỉnh đến 3
mmol/I.
b Thay nước
cho 16 phản ứng và 5 ml cho kiểm chứng
dương (5 ml khuôn mẫu
được thay thế bởi 5 ml nước).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hình A.2 - Sơ
đồ các ống PCR để kiểm tra máy chu trình nhiệt 96 giếng
A.5.2.2. Chương trình
thời gian nhiệt độ
Chương trình thời gian nhiệt độ nêu
trong Bảng
A.4.
Bảng A.4 -
Chương trình thời gian nhiệt độ
Biến tính ban đầu
2 min/95 oC
Khuếch đại
10 s/95 oC
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
20 s/63 oC
20 s/72 oC
Số chu trình
40
Kéo dài cuối cùng
5 min/72 oC
A.5.3. Phát hiện
A.5.3.1. Yêu cầu
chung
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.5.3.2. Chuẩn bị
thạch agarose, điện di và nhuộm
Cân một lượng agarose thích hợp (A.3.8) trộn
với dung dịch đệm điện di (A.3.19 hoặc A.3.20) để có được nồng độ cuối cùng ρ = 20 g/l.
Lớp gel không được dày quá 1cm.
Trộn 5 ml từng sản phẩm PCR với khoảng 1 ml dung dịch đệm
để chạy mẫu (A.3.21) và cho vào gel.
Cho marker khối lượng phân tử vào một
giếng riêng.
Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng. Sử
dụng điện thế phù hợp để giữ điện thế ổn định tối đa là 5 V/cm giữa
các điện cực.
Sau khi điện di hoàn tất, ủ gel ít nhất 30 min
trong dung dịch etidi bromua (A.3.22) ở nhiệt độ phòng, ở nơi tối.
Có thể sử dụng các phương
pháp nhuộm gel agarose khác nếu cho kết quả tương đương.
Chuyển thạch gel vào để soi bằng đèn
cực tím (A.4.4). Bật đèn cực tím và ghi lại huỳnh quang của ADN bằng việc chụp
ảnh hoặc quay phim.
A.6. Diễn giải
kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nếu trong tất cả các mẫu thử phát hiện
được sản phẩm khuếch đại là các cặp base 116, thì sai số nhiệt độ gắn
mồi ở 63 oC là nhỏ hơn 3 oC. Nếu không thấy sản phẩm nào,
thì hoặc là có
sự vượt quá nhiệt
độ hoặc biến tính không đủ. Cả hai
trường hợp này là do việc kiểm soát chương trình nhiệt độ trong máy chu trình
nhiệt không được tốt.
Việc diễn giải kết quả được nêu trong
Bảng A.5.
Bảng A.5 -
Diễn giải kết quả
Số lượng bản sao
Hiệu năng chấp nhận
được: sản phẩm phát hiện
thấy
Hiệu năng
không chấp nhận được: sản
phẩm không phát hiện
5 000
5 trên 5
< 5 trên 5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5 trên 5
< 5 trên
5
50
£ 5 trên 5a
a Các phản ứng với
50 bản sao cho 1 phản ứng có thể cho ra các dải ADN nhạt
Trong trường hợp kết quả hiệu năng
không chấp nhận được (xem bảng A.5), thì cần kiểm tra lại. Nếu kết quả được xác nhận,
thì hiệu năng
của máy chu trình nhiệt là có vấn đề và
thiết bị phải được kiểm tra hiệu năng vật lý.
PHỤ LỤC B
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
KIỂM TRA HIỆU NĂNG VẬT LÝ
B.1. Yêu cầu chung
Đây là phương pháp để kiểm tra chính
xác nhiệt độ máy chu trình nhiệt trong các điều kiện hoạt động. Việc kiểm tra
này ghi lại nhiệt độ chất lỏng trong ống mẫu.
B.2. Nguyên tắc
Nhiệt độ được đo bằng cặp nhiệt điện
hay thiết bị khác có khả năng đo được nhiệt độ ở trong lọ có chứa nước.
Quy trình kiểm tra vật lý được tiến
hành trong các điều kiện đang chạy PCR. Theo đó thì quá trình kiểm tra sẽ bao
gồm loạt 3 cấp độ nhiệt độ được sử dụng để biến tính, gắn mồi và kéo dài mồi.
Nếu như máy chu trình nhiệt có nắp
đậy, thì việc đo phải
tiến hành khi nắp được đậy.
B.3. Chất phản
ứng
B.3.1. Nước
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
B.4.1. Máy chu
trình nhiệt
B.4.2. Thiết bị ghi
nhiệt độ:
đầu dò ghi nhiệt độ, dây dẫn và các thiết bị đo nhiệt độ.
Định kỳ hiệu chuẩn bộ phận đo nhiệt độ
đối với dải nhiệt
độ sử dụng.
B.5. Cách tiến
hành
B.5.1. Bố trí phép
thử
Đặt đầu dò nhiệt độ tại các vị trí đại
diện cho dải kiểm soát nhiệt độ. Việc chọn vị trí tới hạn phải được cân nhắc cẩn thận. Khi
không xác định được vị trí tới hạn thì đặt ngẫu nhiên các cảm biến trong các
giếng.
Ví dụ : Đối với máy chu trình 96 giếng, chia số
giếng thành 6 vùng bằng nhau. Đặt ít nhất 2 đầu dò nhiệt độ tại mỗi vùng. Do đó có ít nhất 12 điểm
nhiệt độ được ghi[1].
B.6. Ghi các giá
trị nhiệt độ
Cần cài đặt tần suất ghi nhiệt độ sao cho ít
nhất 1 giá trị nhiệt độ được ghi lại cho một vị trí trong một giây [1].
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cho mỗi vị trí kiểm tra, tính trung
bình giữa điểm nhiệt độ cao nhất và thấp nhất ở điểm thời gian to (điểm thời
gian khi chương trình nhiệt độ bắt đầu) và tx (điểm thời
gian lúc chương trình nhiệt độ kết thúc) cho các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài [1].
B.7. Giải thích kết quả
Khảo sát nghiên cứu nhiệt độ ở vị trí
cao nhất và thấp nhất. Cả 2 nhiệt độ này phải hoặc nằm trong dải nhiệt độ ghi của
máy hoặc nếu không có quy định về độ chính xác của nhiệt độ, thì không được sai lệch
lớn hơn 0,5 oC
so với nhiệt độ chương trình. Nhiệt độ phải nằm trong dải quy định đối với mỗi
bước trong chu trình và trong quá trình chạy.
Không sử dụng các máy chu trình nhiệt
không đảm bảo được các điều kiện trên.
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
[1] SCHODER D., SCHMALWIESER A., SCHAUBERGER
G., KUHN M.,
HOORFAR J. and WAGNER M. Physical characteristics of six new
thermocyclers. Clin. Chem., 49, 6, 2003, pp. 960-963
[2] HEATON P.A. Quantification of
total DNA by spectroscopy. In: Analytical Molecular Biology: Quality and
Validation, ed. Sauders G. S and Parker H.C., RCS publications, 1999, UK
1) Đây là ví
dụ về
sản phẩm
thich hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thuận
tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng sản phẩm này.
Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng
nếu cho kết quả tương đương.