Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10780-2:2015 về Vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - huyết thanh Salmonella

• Số hiệu: TCVN10780-2:2015
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2015

Cấy đâm sâu	màu vàng	glucose dương tính (sử dụng glucose)
	màu đỏ hoặc không đổi màu	glucose âm tính (không sử dụng glucose)
	màu đen	sinh khí hydro sulfua
	bọt khí hoặc vết nứt	sinh khí từ glucose
Cấy nghiêng trên bề mặt thạch	màu vàng	lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose)
	màu đỏ hoặc không đổi màu	lactose và sucrose âm tính (không sử dụng lactose và không sử dụng sucrose)

Các chủng cấy Salmonella spp. điển hình cho thấy tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng và tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và sinh khí hydro sulfua (thạch bị đen) (trong khoảng 90 % trường hợp) khi cấy đâm sâu, xem Bảng 1.

Biến thể Salmonella spp. dương tính với lactose có màu vàng trên bề mặt nghiêng của thạch TSI. Do đó, việc khẳng định sơ bộ các chủng cấy Salmonella không chỉ dựa trên kết quả của phép thử trên thạch TSI.

9.5.3.3. Thạch urê (5.2.6)

Cấy vạch trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ trong tủ ấm (6.3) ở 37 ^oC trong 24 h ± 3 h và kiểm tra thường xuyên.

Nếu phản ứng dương tính, thì có sự phân hủy urê thành amoniac, làm đổi màu phenol đỏ thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Phản ứng này thường xuất hiện sau 2 h đến 4 h.

Các chủng cấy Salmonella điển hình không thủy phân urê, do đó màu sắc của urê vẫn không thay đổi (màu vàng, xem Bảng 1).

9.5.3.4. Môi trường L-Lysin đã khử nhóm carboxyl (5.2.7)

Cấy truyền ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng. Ủ trong tủ ấm (6.3) ở 37 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Màu đục và màu đỏ tía sau khi ủ cho thấy phản ứng dương tính. Màu vàng cho thấy phản ứng âm tính. Hầu hết các chủng cấy Salmonella điển hình cho phản ứng dương tính (xem Bảng 1).

...

...

...

Nhìn chung, Salmonella cho thấy các phản ứng như trong Bảng 1. Nếu có các phản ứng này, có thể coi rằng mẫu có chứa Salmonella spp.

Bảng 1 - Giải thích các phép thử sinh hóa; các phản ứng điển hình của hầu hết các serovar của Salmonella (phần trăm nêu trong ngoặc)

Thạch TSI

Cấy đâm sâu

màu vàng

glucose dương tính (100 %)

màu đen

sinh khí hydro sulfua, H^2S (91,6 %)

bọt khí hoặc vết nứt

...

...

...

Cấy nghiêng trên bề mặt thạch

màu đỏ hoặc không đổi màu

lactose và/hoặc sucrose âm tính (tương ứng với 99,2 % và 99,5 %)

Thạch urê

-

màu vàng, không đổi màu môi trường

âm tính (100 %)

LDC

-

...

...

...

dương tính (94,6 %)

9.5.4. Khẳng định huyết thanh và kiểu huyết thanh

Các kết quả của phép thử sinh hóa có thể chỉ ra rằng khuẩn lạc phân lập được thuộc chi Salmonella. Đối với kiểu đầy đủ của các chủng Salmonella, thì có thể tiến hành khẳng định kiểu huyết thanh. Việc khẳng định huyết thanh cung cấp thêm thông tin về nhóm huyết thanh thuộc chủng phân lập. Đối với kiểu huyết thanh có thể tiếp tục phân lập đến mức serovar. Để biết thêm chi tiết, xem TCVN 4829 (ISO 6579) [5] và Tài liệu tham khảo [3].

10. Biểu thị kết quả

Đếm số lượng các giếng cho phản ứng khẳng định dương tính trên mỗi độ pha loãng. Tính số MPN từ số lượng các giếng khẳng định dương tính ở mỗi độ pha loãng.

Nếu tất cả các giếng âm tính, nhưng huyền phù ban đầu (ở độ pha loãng 10-1) được tìm thấy là dương tính với Salmonella spp. (sau khi khẳng định) thì kết quả có thể được báo cáo là: Salmonella spp. có mặt trong lượng mẫu thử nghiệm (ví dụ: 25 g), nhưng thấp hơn giới hạn phát hiện dưới của phương pháp mini-MPN (<1 cfu/g).

Để tính số MPN, có thể sử dụng các công thức được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218), vì không có sẵn các bảng số MPN "chuẩn" cho tất cả các độ pha loãng được sử dụng. Chương trình phần mềm sử dụng trong Excel1) có thể xử lý các mức 10 của các dãy pha loãng. Nên sử dụng chương trình này, vì tất cả các kết quả kết hợp cụ thể thu được từ ba độ pha loãng sẽ giống như các kết quả nêu trong các bảng của TCVN 6404 (ISO 7218). Các thông tin chi tiết về việc tính toán được nêu trong Tài liệu tham khảo [2] và các phần mềm là miễn phí có sẵn trên: http://standards.iso.org/iso/ts/6579/-2/

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn đến tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn cùng với các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nêu các kết quả cuối cùng, nếu kiểm tra độ lặp lại.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử và môi trường nuôi cấy

...

...

...

Thời hạn sử dụng của các môi trường nêu trong Phụ lục này đã được chỉ rõ trong một số nghiên cứu. Người sử dụng cần kiểm tra lại điều này với các điều kiện bảo quản cụ thể [xem TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1) và TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2)].

Phép thử hiệu năng về đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy được nêu trong A.8.

A.1 Nước đệm pepton (BPW)

A.1.1 Thành phần

Pepton^a   10,0 g

Natri clorua  5,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na₂HPO₄.12H₂O) 9,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5 g

Nước  1 000 ml

...

...

...

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng (không đun sôi) nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình (6.7) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho một phép thử.

Khử trùng 15 min ở 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Bảo quản ở 5 ^oC trong bình kín khí (6.5), đặt ở nơi tối đến 6 tháng.

Sử dụng pipet đa kênh (6.9), bằng kỹ thuật vô trùng chuyển 2 ml môi trường đã chuẩn bị vào từng giếng của đĩa 12 giếng (6.11). Chuẩn bị một đĩa 12 giếng có một hàng ba giếng thứ nhất rỗng.

A.2. Môi trường Rappaport-Vassiliadis nửa đặc cải biến (MSRV)

A.2.1. Môi trường cơ bản

...

...

...

Sản phẩm phân hủy từ mô động vật và thực vật bằng enzym 4,6 g

Sản phẩm thủy phân casein bằng axit 4,6 g

Natri clorua (NaCl)  7,3 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO4) 1,5 g

Magie clorua khan (MgCl₂) 10,9 g

Xanh malachit oxalat  0,04 g

Thạch  2,7 g

Nước  1 000 ml

A.2.1.2. Chuẩn bị

...

...

...

Đun đến sôi đồng thời khuấy trộn.

CHÚ Ý - Không sử dụng nồi hấp áp lực.

Không để môi trường ở nhiệt độ cao lâu hơn cần thiết.

Để nguội môi trường đến nhiệt độ từ 47 ^oC đến 50 ^oC.

A.2.2 Dung dịch novobiocin

A.2.2.1 Thành phần

Muối natri novobiocin 0,05 g

Nước  10 ml

A.2.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

Khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm.

Dung dịch cần được bảo quản ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5) đến 4 tuần hoặc chia thành các lượng nhỏ (ví dụ 2 ml) và được bảo quản ở −20 ^oC đến 1 năm.

A.2.3. Môi trường hoàn chỉnh

A.2.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (A.2.1) 1 000 ml

Dung dịch novobiocin (A.2.2) 2 ml

A.2.3.2. Chuẩn bị

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho 2 ml dung dịch novobiocin (A.2.2) vào 1 000 ml môi trường cơ bản (A.2.1) ở nhiệt độ từ 47 ^oC đến 50 ^oC. Trộn kỹ.

Nồng độ cuối của novobiocin là 10 mg/l môi trường MSRV.

...

...

...

Chuyển 2 ml (ví dụ: sử dụng pipet đa kênh 6.9) vào từng giếng trong đĩa 12 giếng (6.11).

Nếu cần, cũng rót vào các đĩa Petri có đường kính 90 mm (6.10) đến thể tích cuối từ 15 ml đến 20 ml. Để môi trường đặc lại trước khi di chuyển và xử lý cẩn thận.

Bảo quản các đĩa, với bề mặt hướng lên trên ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối, đến 2 tuần.

Không lật úp các đĩa do thạch nửa đặc quá lỏng.

Không sử dụng các đĩa thạch nửa đặc đã hóa lỏng hoặc bị phân mảng.

Ngay trước khi sử dụng, nếu có hơi ẩm đọng thì làm khô cẩn thận bề mặt đĩa thạch, ví dụ: mở nắp và để bề mặt thạch hướng lên rồi đặt vào tủ sấy thông khí. Tiến hành cẩn thận để không làm quá khô môi trường.

A.3. Thạch deoxycolat lyzin xylose (thạch XLD)

A.3.1. Thành phần

Chất chiết nấm men 3,0 g

...

...

...

D(+)-Xylose 3,75 g

Lactose 7,5 g

Sucrose (sacarose) 7,5 g

L(+)-lysin hydroclorua 5,0 g

Natri thiosulfat (Na₂S₂O₃) 6,8 g

Sắt(III) amino xitrat 0,8 g

Đỏ phenol 0,08 g

Natri deoxycholat 1,0 g

Thạch từ 9 g đến 18 g^a

...

...

...

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

A.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước.

Đun nóng đồng thời khuấy liên tục cho đến khi môi trường bắt đầu sôi. Tránh quá nhiệt.

CHÚ Ý - Không sử dụng nồi hấp áp lực.

Điều quan trọng là tránh chuẩn bị các thể tích quá lớn vì quá trình đun nóng bị kéo dài.

Chỉnh pH đến 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Chuyển môi trường vào nồi cách thủy (6.4) ở nhiệt độ từ 47 ^oC đến 50 ^oC.

Ngay khi môi trường đã nguội, rót vào các đĩa Petri (6.10). Để cho đông đặc.

...

...

...

Ngay trước khi sử dụng, cần làm khô cẩn thận bề mặt đĩa thạch. Tiến hành cẩn thận để không làm quá khô môi trường.

A.4. Thạch dinh dưỡng

A.4.1. Thành phần

Chất chiết từ thịt 3,0 g

Pepton^a  5,0 g

Natri clorua (NaCl) (tùy chọn)  5,0 g

Thạch từ 9 g đến 18 g^b

Nước  1 000 ml

^a Ví dụ, sản phẩm phân hủy từ casein bằng enzym.

...

...

...

A.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng bằng 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào bình (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min ở 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Chuyển khoảng 15 ml môi trường đã tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng (6.10). Để cho đông đặc.

Bảo quản các đĩa đã rót (lật úp mặt thạch xuống) ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 4 tuần. Giữ cho các đĩa không bị khô.

Ngoài ra, có thể sử dụng các môi trường thạch không chọn lọc thích hợp khác.

A.5. Thạch sắt-ba đường (thạch TSI)

...

...

...

Chất chiết từ thịt 3,0 g

Chất chiết nấm men  3,0 g

Pepton 20,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g

Lactose 10,0 g

Sucrose 10,0 g

Glucose (dextrose) 1,0 g

Sắt(III) xitrat 0,3 g

Natri thiosulfat (Na₂S₂O₃) 0,3 g

Đỏ phenol 0,024 g

...

...

...

Nước 1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

A.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng bằng 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng 10 ml môi trường này vào các ống nghiệm, tốt nhất là ống có các nắp vặn.

Khử trùng 15 min ở 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Đặt nghiêng các ống để có độ sâu từ 2,5 cm đến khoảng 5 cm.

Các ống đã được đậy chặt bằng nắp vặn có thể bảo quản ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 3 tháng.

...

...

...

A.6.1. Môi trường cơ bản

A.6.1.1. Thành phần

Pepton^a  1,0 g

Glucose (dextrose) 1,0

Natri clorua (NaCl) 5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄) 2,0 g

Đỏ phenol  0,012 g

Thạch  từ 9 g đến 18 ga

Nước 1 000 ml

...

...

...

^b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

A.6.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng bằng 6,8 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Khử trùng 15 min ở 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Bảo quản các bình đã đậy kín khí ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 3 tháng.

A.6.2. Dung dịch urê

A.6.2.1. Thành phần

Urê  400 g

...

...

...

A.6.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan urê trong nước và khử trùng bằng cách lọc.

Bảo quản các bình đã đậy kín khí ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 3 tháng.

A.6.3. Môi trường hoàn chỉnh

A.6.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (A.6.1) 950 ml

Dung dịch urê (A.6.2) 50 ml

A.6.3.2 Chuẩn bị

Ở điều kiện vô trùng, cho dung dịch urê vào môi trường cơ bản đã làm tan chảy và để nguội đến nhiệt độ từ 47 ^oC đến 50 ^oC.

...

...

...

Các ống đã được đậy chặt bằng nắp vặn có thể bảo quản ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 3 tháng.

A.7. Môi trường L-Lysin đã khử nhóm cacboxyl (LDC)

A.7.1. Thành phần

L-Lysin monohydroclorua 5,0 g

Chất chiết nấm men 3,0 g

Glucose 1,0 g

Đỏ tía bromocresol 0,015 g

Nước 1 000 ml

A.7.2. Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng từ 2 ml đến 5 ml môi trường này vào các ống nghiệm (6.7), tốt nhất là ống có nắp vặn.

Khử trùng 15 min ở 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1).

Các ống đã được đậy chặt bằng nắp vặn có thể bảo quản ở 5 ^oC trong tủ lạnh (6.5), đặt ở nơi tối đến 3 tháng.

A.8. Phép thử hiệu năng về đảm bảo chất lượng của môi trường nuôi cấy

Thông tin về phép thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được nêu trong Bảng A.1 của TCVN 10780-2 (ISO 5579-2). Đối với các định nghĩa về tính chọn lọc và hiệu suất, xem TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1) và TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2).

Bảng A.1 - Phép thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

Môi trường

Tham số

...

...

...

Chủng kiểm chứng^a

Tiêu chí^c

BPW

Hiệu suất

18 h ở 37 ^oC

Salmonella Typhimurium WDCM 00031^b

Salmonella Enterididis WDCM 00030

Độ đục (từ 1 đến 2)

MSRV

...

...

...

(2x) 24 h ở 41,5 ^oC

Salmonella Typhimurium WDCM 00031^b

Salmonella Enterididis WDCM 00030

Vùng màu trắng xám, màu đục lan ra ngoài giọt cấy. Sau 24 h đến

48 h, vùng màu đục sẽ (hầu hết) bị dịch chuyển khắp đĩa

Tính chọn lọc

(2x) 24 h ở 41,5 ^oC

Escherichia coli WDCM 00012^b

Escherichia coli WDCM 00012^b

...

...

...

Enterococcus faecalis WDCM 00009^b

Enterococcus faecalis WDCM 00087

Không phát triển

XLD

Hiệu suất

24 h ở 37 ^oC

Salmonella Typhimurium WDCM 00031^b

Salmonella Enterididis WDCM 00030

Các khuẩn lạc phát triển tốt (2) có tâm màu đen và vùng màu hơi đỏ nhạt do sự đổi màu của môi trường

...

...

...

24 h ở 37 ^oC

Escherichia coli WDCM 00012^b

Escherichia coli WDCM 00013

Các khuẩn lạc màu vàng phát triển hoặc bị ức chế một phần (từ 0 đến 1)

Enterococcus faecalis WDCM 00009^b

Enterococcus faecalis WDCM 00087

Bị ức chế toàn bộ (0)

Thạch dinh dưỡng

Hiệu suất

...

...

...

Salmonella Typhimurium WDCM 00031

Phát triển tốt (2)

^a Đối với thông tin về số lượng chủng cấy và các chi tiết liên hệ, nên tham khảo danh mục chủng có sẵn trên http://refs.wdcm.org/home.htm (WDCM: Trung tâm Dữ liệu về Vi sinh vật Thế giới).

^b Chủng sử dụng được lựa chọn bởi phòng thử nghiệm cuối cùng (tối thiểu).

^c Sự phát triển được phân hạng như sau: 0 - không phát triển; 1 - phát triển yếu; 2 - phát triển tốt [xem TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1) và TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2)].

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Sơ đồ quy trình

...

...

...

Hình B.1 - Sơ đồ biểu diễn quy trình mini-MSRV

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] FRAVALO, P., HASCOET, Y., LE FELLIC, M., QUEGUINER, S., PETTON, J., SALVAT, G. Convenient method for rapid and quantitative assessment of Salmonella enterica contamination: The mini-MSRV MPN technique. J. Rapid Meth. Automat. Micribiol. 2003, 11, pp. 81-88.

[2] JARVIS, B., WILRICH, C., WILRICH, P.-T. Reconsideration of the derivation of most proble numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. J. Appl. Microbiol. 2010, 109, pp, 1660-1667.

[3] GRIMONT,P.A.D., WEILL, F.-X.Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9 thedition, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Paris: Institut Pasteur, 2007. 166 p. Available (viewed 2012-10-15) at: http://www.pastuer.fr/ip/portal/action/Webdrive ActionEvent/oid/01s-000036-089.

[4] VOOGT, N., RAES, M., WANNET, WJB., HENKEN, A.M., VAN DE GIESSEN, A.W. Comparison of selective enrichment media for the detection of Salmonella in poultry faeces. Lett. Appl. Mocrobiol. 2001, 32, pp, pp.89 - 92.

[5] TCVN 4829:2005 sửa đổi 1:2008 (ISO 6579: 2002, Cor 1: 2004, Amd 1: 2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella spp. trên đĩa thạch.

1) Excel là tên thương mại của sản phẩm do Microsoft cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.