|
BỘ Y TẾ
-----
|
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-------
|
|
Số: 3349/2001/QĐ-BYT
|
Hà Nội, ngày 31
tháng 7 năm 2001
|
QUYẾT
ĐỊNH
VỀ
VIỆC BAN HÀNH "THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
TRONG THỰC PHẨM"
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ theo Nghị định
số 68/ CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền
hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công
trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg
ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất
lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ
trưởng Vụ Pháp chế, Chánh thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất
lượng vệ sinh an toàn thực phẩm,
QUYẾT ĐỊNH
Điều
1.
Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật
định lượng Vibrio parahaemolyticus trong thực phẩm”.
Điều
2.
Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.
Điều
3.
Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng
các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng - Bộ Y tế; Cục trưởng Cục
Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các Tỉnh,Thành
phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu
trách nhiệm thi hành Quyết định này.
|
|
KT. BỘ TRƯỞNG BỘ Y
TẾ
THỨ TRƯỞNG
Lê Văn Truyền
|
THƯỜNG
QUY KỸ THUẬT
ĐỊNH
LƯỢNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM
(Ban hành kèm theo
Quyết định số 3349/2001 QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
I.
NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Vibrio
parahaemolyticus
phát triển được trong môi trường có nồng độ muối cao. Lựa chọn khuẩn lạc V.
parahaemolyticus xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.
II.
PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện các ô nhiễm
do Vibrio parahaemolyticus trong sản phẩm thuỷ sản và thức ăn chế biến
sẵn.
III.
DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Dụng cụ thiết bị
Các dụng cụ và thiết
bị thông thường trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.
2. Môi trường, thuốc
thử
- Thạch TCBS
(Thiosunfat - Citrat - Bile - Salt - Sucroza)
- Thạch Tryple sugar
iron (TSI)
- Thạch Wagatsuma
- Môi trường Clark - lubs
- Canh thang
Trypticase Soy (TSB)
- Thạch Trypticase
Soy (TSA)
- Canh thang muối
glucoza (GSTB)
- Canh thang Glucose
Hugh Leifson (HLGB)
- Môi trường di động
- Môi trường đường có
chỉ thị màu bromocresol
(Các đường manitol,
lactoza, sacaroza, arabinoza)
- Môi trường
decarboxylaza (ADH, LDC, ODC)
- Thuốc thử hoặc giấy
thử Oxidaza
- KOH, a naphton
- Dầu parafin vô
trùng
- Thuốc nhuộm Gram
Chú ý: tất cả các loại môi
trường phải có ít nhất 3% muối NaCl
IV.
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Chuẩn bị môi
trường
Môi trường nuôi cấy,
canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công
thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được
hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). ( Phụ
lục kèm theo)
2. Chuẩn bị mẫu và
dung dịch mẫu thử
2.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được
cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể
đồng nhất.
Lưu ý:
- Cá: Thịt cá, ruột
và mang cá.
- Sò, hến: Toàn bộ cơ
quan nội tạng.
- Tôm, cua : Thịt và
cơ quan nội tạng. Nếu cần có thể tách riêng xét nghiệm các bộ phận của chúng
(ruột, mang, gạch...).
Trước khi xét nghiệm,
phải làm tan băng.
2.2. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-1
- Cân chính xác 50 g
thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút chính xác 50ml thực phẩm lỏng) cho vào
bình nón chứa sẵn 450 ml nước đệm muối 3%.
- Lắc đều 2 - 3 phút.
Thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
2.3. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-2,10-3,10 -4...
- Hút chính xác 50ml
dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm
muối 3%.
- Lắc đều trong 2 -
3phút. Thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương
tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4,
10-5.... (theo sơ đồ )
3. Phương pháp tiến
hành
Bước 1:
- Lấy 10ml dung dịch
mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10 ml canh thang glucoza
muối (GSTB) đậm đặc gấp 2 lần và 1ml vào GSTB đậm độ thường. Mỗi đậm độ cấy 3
ống.
- Lấy 1ml dung dịch
mẫu thử từ 10-2, 10-3, 10-4 cho sang ống
nghiệm chứa sẵn 10ml GSTB đậm độ thường. Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống. ủ
ấm ở 350C/18-24 giờ.
- V. parahaemolyticus hiếu khí tuyệt đối,
phát triển tạo thành màng trên bề mặt ống canh thang, chuyển mầu môi trường
sang mầu vàng.
Bước 2:
- Lấy canh trùng từ
ống canh thang có đậm độ pha loãng thấp nhất vẫn có vi khuẩn phát triển cấy
sang các đĩa thạch TCBS. Ria cấy để tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ.
- Ủ ở 350C/18
- 24 giờ.
Bước 3:
- Quan sát và nhận
định khuẩn lạc trên thạch TCBS.
- V. parahaemolyticus có khuẩn lạc tròn,
lồi, bờ đều, đường kính 2 - 3mm trung tâm khuẩn lạc có màu xanh hoặc xanh lá
cây.
Bước 4: Tăng sinh thuần
chủng và xác định hình thể, tính chất bắt mầu
a) Tăng sinh thuần
chủng
- Trích khuẩn lạc
điển hình từ thạch TCBS cấy vào môi trường canh thang TSB hoặc canh thang
thường có NaCl 3% và ủ ấm 18 - 24 giờ/ 350C, thu được canh trùng
thuần nhất.
- Từ canh trùng thuần
nhất cấy vào Thạch TSI, TSA nghiêng có NaCl 3%;
ủ ấm 18 - 24 giờ/ 350C.
- Thử nghiệm Oxidaza:
Lấy khuẩn lạc trên môi trường TSA làm phản ứng oxidaza trên giấy thử hoặc
thuốc thử, oxidaza (+).
b) Hình thể và tính
chất bắt mầu
- Từ canh trùng thuần
nhất, nhuộm Gram xem hình thể: hình phẩy khuẩn, cong hoặc hình trụ, đầu tròn,
không bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr (-).
- Canh trùng được soi
tươi trên lam kính: phẩy khuẩn di động nhanh.
Bước 5: Tính chất sinh vật
hoá học
a) Tính chất lên men
các loại đường
- Thử tính chất lên
men đường glucoza, lactoza, sacaroza, khả năng sinh hơi, sinh H2S
trên môi trường TSI.
- Lên men đường
sacaroza, manitol, arabinoza.
- Dùng canh thang có
chỉ thị màu bromocresol để xác định tính chất lên men các loại đường. Để tủ ấm
350C/ 4 - 5 ngày rồi đọc kết quả.
b) Tính chất ưa muối
- Từ canh trùng thuần
nhất cấy vi khuẩn vào ống canh thang muối (STB) có NaCl từ: 0%; 6%; 8%, 10%. ủ
ấm ở 350C/24 giờ.
c) Thử nghiệm VP
- Từ canh thang TSB
cấy vào canh thang Clark-lubs, ủ ấm ở 350C/48 giờ. Nhỏ thuốc thử 0,2ml
KOH 40% và 0,6ml a napton.
- Để ở nhiệt độ
thường trong 1 giờ. Đọc kết quả.
d) Test ADH, LDC, ODC
- Dùng que cấy lấy vi
khuẩn từ thạch TSA cho vào 3 ống ADH, LDC, ODC (Các ống môi trường đã có
parafin vô trùng phủ dày 10mm). Nới lỏng nút bông, để ở nhiệt độ 350C/
24 giờ, kiểm tra hàng ngày, trong 4 ngày.
- Đọc kết quả: V.
parahaemolyticus LDC (+), ADH (-), ODC (+).
e) Test Kanagawa
- Xác định khả năng
làm tan máu thỏ dạng b (test phân biệt giữa
V.parahaemolyticus phân lập từ thuỷ sản): Cấy vi khuẩn sau khi nuôi cấy
18 giờ lên bề mặt thạch Wagatsuma có máu thỏ thành các chấm. Thử nghiệm phải có
chứng dương và chứng âm
- Ủ 350C
và đọc kết quả sau 24 giờ.
V.
TÍNH KẾT QUẢ
Khuẩn lạc điển hình
trên môi trường TCBS tương ứng với nồng độ pha loãng nhất của canh thang GSTB
còn có sự phát triển của V.parahaemolysticus. Tra bảng MPN ở nồng độ
tương ứng để tính số khuẩn lạc có trong mẫu thử.
Ví dụ:
Nồng độ 10-1:
có 3 ống (+);
Nồng độ 10-2:
có 1 ống (+);
Nồng độ 10-3:
có 0 ống (+)
Tra bảng MPN , xác
định trong 1g mẫu thử có 43 con vi khuẩn
Tiêu chuẩn xác định V.
parahaemolysticus trong thực phẩm
Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza:
(+) VP: (-) Di động: (+)
NaCl 0%; (-), NaCl
6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-)
Glucoza (+), Lactoza
(+) Sacaroza(-), Hơi (+); H2S: (-)
ADH: (-) ODC:
(+) LDC: (+) Kanagawa (-)
Sơ đồ định lượng
V. parahaemolyticus
Thạch TCBS
5. Xác định tính chất
sinh vật hóa học
6. Tiêu chuẩn xác
định V. parahaemolyticus
Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza:
(+) VP: (-) Di động: (+)
NaCl 0%; (-), NaCl
6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-)
Glucoza (+), Lactoza
(+) Sacaroza:(-), Hơi (+); H2S: (-)
ADH: (-) ODC:
(+) LDC: (+) Kanagawa (-)
PHỤ
LỤC
MỘT
SỐ MÔI TRƯỜNG CHÍNH ĐỂ XÁC ĐỊNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG V. PARAHAEMOLYTICUS
1. Môi trường Glucose
Salt Teepol Broth (GSTB)
- Cao thịt bò: 3g
- Pepton: 10g
- NaCl: 30g
- Glucoza: 5g
- Tím methyl: 0,002g
- Teepol: 4ml
- Nước cất: 1lít
* Đối với canh thang
đậm đặc thì trọng lượng mỗi thành phần tăng gấp 2 lần
(trừ nước): San ra các ống nghiệm loại 20x150mm, mỗi ống 10ml.
* Đối với canh thang
loãng: San ra các ống nghiệm loại 18x150mm, mỗi ống 10ml.
Nếu định lượng mẫu
xét nghiệm 25 g, dùng bình có nắp chứa 225 ml canh thang loãng. Hấp ướt 15
phút/1210C, pH = 7,4 ±
0,2.
2. Môi trường thạch
đĩa Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose(TCBS agar)
- Men thủy phân: 5g
- Pepton: 10g
- Sacaroza: 20g
- Natrithiosunfat. 5H2O:
20g
- Natri citrat.2H2O:
10g
- Natri cholat: 3g
- Oxgall: 5g
- NaCl: 10g
- Iron citrat: 1g
- Xanh bromothymol: 0,04g
- Xanh thymol: 0,04g
- Agar: 15g
- Nước cất: 1lít
Đun từ từ cho môi
trường chảy. Đun sôi 1 - 2 phút. Không được hấp ướt. San ra các đĩa 20 ml (loại
đĩa 15 x 100mm), pH = 8,6.
3. Thạch máu
Wagatsuma
- Men thủy phân: 3 g
- Pepton: 10 g
- NaCl: 70 g
- K2HPO4:
5 g
- Mannitol: 10 g
- Tím crystal: 0,01 g
- Agar: 15 g
- Nước cất: 1 lít
Đun từ từ cho tan các
chất. Chỉnh pH đến 8,0 ± 0,2. Đun sôi 30 phút
(không được hấp ướt). Để nguội xuống còn 500C. Rửa máu người hoặc
máu thỏ 3 lần bằng NMSL. Cho máu vào thạch với tỉ lệ 5% máu. Lắc và đổ đĩa. Các
đĩa thạch phải được dùng ngay sau khi chuẩn bị.
4. Môi trường HLGB (
Hugh Leifson Glucose Broth)
- Pepton: 2g
- Men thủy phân: 0,5g
- NaCl: 30g
- Dextroza: 10g
- Bromo cresol
purpose: 0,015g
- Agar: 3g
- Nước cất: 1lít
* Đun cho các chất
hòa tan trong thạch, pH =7,2 ±
0,2.
* Hấp ướt ở 1210C/15
phút.
5. Môi trường canh
thang muối trypticase (STB)
- Trypticase: 10g
- Men thủy phân: 3g
- Nước cất: 1 lít
Cho vào mỗi lít môi
trường này 0g, 60g, 80g, 100g NaCl để canh thang có nồng độ 0, 6, 8 và 10%
NaCl. Hấp ướt 1210C/15 phút, pH =7,5 ± 0,2.
6. Môi trường
Trypticase (Tryptic) Soy Agar (TSA)
- Trypticase pepton: 15g
- Phytone pepton: 5g
- NaCl: 5g
- Agar: 15g
- Nước cất: 1 lít
Đun nóng chảy các hóa
chất trên. Đun sôi 1 phút. San môi trường ra các ống nghiệm hoặc bình cầu. Hấp
ướt 1210C/15 phút, pH=7,3 ±
0,2. Khi dùng để xác định, V. parahaemolyticus phải cho thêm NaCl với
nồng độ 25g/l.
7. Canh thang
Trypticase Soy Broth (TSB)
- Trypticase pepton: 17g
- Phytone pepton: 3g
- NaCl: 5g
- K2HPO4: 2,5g
- Glucoza: 2,5g
- Nước cất: 1lít
* Chỉnh pH=7,3 ± 0,2
* Đun cho tan hoàn
toàn. San 225ml hỗn dịch này vào các bình 500ml. Hấp ướt ở 1210C/15phút.
Cho thêm NaCl với nồng độ 25g/l để xác định V. parahaemolyticus.