|
BỘ
Y TẾ
-----
|
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-------
|
|
Số: 3348/2001/QĐ-BYT
|
Hà
Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2001
|
QUYẾT ĐỊNH
VỀ VIỆC BAN HÀNH "THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM"
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ theo Nghị định số
68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn
và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công
trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg
ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng
vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh Văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng
Vụ Pháp chế, Chánh Thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ
sinh an toàn thực phẩm,
QUYẾT ĐỊNH
Điều 1.
Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật định
lượng Clostridium perfringens trong thực phẩm”.
Điều 2.
Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.
Điều 3.
Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng
các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng - Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản
lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố
trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách
nhiệm thi hành Quyết định này.
|
|
KT. BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
THỨ TRƯỞNG
Lê Văn Truyền
|
THƯỜNG QUY KỸ THUẬT
ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM
(Ban
hành kèm theo Quyết định số 3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng
Bộ Y tế )
I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Vi khuẩn C. perfringens
(trong môi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC)) trong điều kiện
kỵ khí sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có màu đen. Chọn khuẩn lạc điển hình,
xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện ô nhiễm Clostridium
perfringens trong nước, thực phẩm và thức ăn chế biến sẵn.
III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Dụng cụ, thiết bị
- Nồi cách thủy.
- Bình nuôi cấy kỵ khí.
- Pipet chia độ 1, 5, 10 ml.
2. Môi trường, thuốc thử
- Thạch Tryptose Sulfide
Cycloserin (TSC agar).
- Môi trường Iron - Milk.
- Môi trường Lactoza gelatin.
- Canh thang gan cục hoặc canh
thang thịt.
- Canh thang nuôi cấy nha bào.
- Dung dịch thioglycolat.
- Dung dịch đệm glycerin - salt.
- Nước muối đệm Pepton 9‰.
- Thuốc nhuộm Gram.
IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy, canh thang,
nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được pha chế theo công thức. Các
môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt
trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút)
2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu
thử
2.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc
xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
Lưu ý: Mẫu thực phẩm nếu
xét nghiệm sau 8 giờ phải được bảo quản trong dung dịch muối đệm - glycerin
(Buffer glycerin Salt Solution - BGS) bằng cách: ngâm thực phẩm trong dung dịch
BGS theo tỷ lệ 1:1 và bảo quản trong điều kiện lạnh - 20oC.
Trước khi xét nghiệm, phải làm
tan băng.
2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu
thử 10-1
Cân chính xác 25 g thực phẩm đã
được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn
225 ml nước muối đệm pepton (BPW) 9‰.
Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được
dung dịch mẫu thử 10-1
2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu
thử 10- 2,10- 3,10- 4...
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu
thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối đệm pepton 9‰. Lắc
đều trong 2-3phút. Thu được dung dịch 10-2.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy,
ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4,
10-5.... (theo sơ đồ ).
3. Phương pháp tiến hành
A. Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch
Bước 1:
- Rót 6 - 7 ml thạch TSC vào mỗi
đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ pha loãng. Lắc cho thạch láng đều mặt đĩa.
- Khi thạch đông chặt, lấy
pippet hút chính xác 1 ml ở mỗi nồng độ pha loãng dung dịch mẫu thử nhỏ lên mặt
thạch. Mỗi nồng độ cấy trong hai đĩa petri tương ứng.
- Rót tiếp 15 ml thạch TSC vào mỗi
đĩa petri đã được láng mẫu thử. Lắc trộn đều sao cho thạch phủ đều khắp bề
mặt đĩa petri.
- Khi thạch đông chặt, lật ngược
đĩa, đặt vào bình kỵ khí (ví dụ các túi hóa chất tạo kỵ khí hoặc tủ ấm
nuôi vi khuẩn kỵ khí).
Đặt bình kỵ khí vào tủ ấm 350C/20
-24 giờ.
Bước 2: Đọc kết quả
sơ bộ sau 24 giờ
- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, có
màu đen..
- Tính số lượng vi khuẩn C.
perfringens /1 g thực phẩm bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy
cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng.
* Ghi chú :
- Chỉ đếm các đĩa thạch có khoảng
20 - 200 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Nếu các khuẩn lạc phân bố trên
đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại.
Bước 3: Xác định
hình thể và tính chất bắt mầu
a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất
Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc
điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường
canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục và canh thang nha bào.
Ủ ấm 350C/18 - 24 giờ.
Thu được canh trùng thuần nhất.
b) Hình thể và tính chất bắt mầu
- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm
Gram để xem hình thể và tính chất bắt mầu. C. perfringens là
trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr ( +).
- Phát hiện khả năng sinh nha
bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy: trực khuẩn ngắn, tròn đầu, giữa
có khoảng trắng sáng không bất mầu thuốc nhuộm.
Bước 4: Thử tính chất
sinh vật hoá học
a) Thử nghiệm Iron - Milk
- Lấy 1ml canh trùng thuần nhất
cho vào ống nghiệm môi trường Iron - Milk
- Đun cách thuỷ 46oC/2giờ.
- C.perfringen làm đông sữa
nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo ra lớp nhũ tương ở trên.
b) Thử tính chất lên men đường
và hoá lỏng gelatin
- Từ canh trùng thuần nhất cấy
vào môi trường lactoza gelatin. Sau 24 giờ ở 350C , nhận định
khả năng lên men đường Lactoza, và khả năng sinh hơi. Đặt ống nghiệm vào 50C/1
giờ - Đọc kết quả sơ bộ khả năng hóa lỏng gelatin..
- Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc,
ủ thêm 24 giờ/ 350C.
c) Khả năng chuyển hoá nitrat
thành nitrit:
- Từ canh trùng thuần nhất cấy
vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35oC/24 giờ. Nhỏ 0,25ml thuốc thử A và B.
- Quan sát mầu môi trường chuyển
sang mầu cam hoặc tím (+)/10 phút.
Tiêu chuẩn để xác định C.
perfringen
|
Trực khuẩn ngắn:
Gr (+)
|
Có nha bào
|
Khuẩn lạc mầu đen trên TSC
|
|
Nitrit: (+)
|
Lactoza: (+)
|
Hơi: (+)
|
|
Iron-milk: (+)
|
Gelatin: (+)
|
|
B. Phương pháp nuôi cấy trong ống thạch
B.1. Môi trường thuốc thử
- Thạch Wilson Blair hay thạch Perfringens
selective được đổ vào mỗi ống nghiệm ( mỗi ống nghiệm khoảng 30ml thạch)
- Dung dịch natri sunfit 20%.
- Dung dịch ferrous amon sunfat
5% (dung dịch phèn sắt 5%).
B.2. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu và dung dịch
mẫu thử như trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của mẫu mà pha loãng đến đậm độ
dùng nuôi cấy.
- Đun chảy thạch Wilson Blair hoặc
thạch Perfringens selective, để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml
dung dịch mẫu thử. Mỗi nồng độ cấy trong 2 ống. Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch
Na2SO3 20% và 5giọt phèn sắt 5%. Lắc trộn đều.
- Đun cách thủy 750C/15phút.
Làm đông nhanh thạch.
- Để 370C/18-24h.
B.3. Đọc kết quả:
Khuẩn lạc vi khuẩn C. perfringens tròn, đen, có đường kính ³ 3mm.
V. TÍNH KẾT QUẢ
Tính số vi khuẩn có trong
1g mẫu bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ C.
perfringens có trong hai đĩa thạch hoặc ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ
nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.
Ví dụ: Độ pha loãng 10-2
:
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1
có: 10 khuẩn lạc
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2
có: 14 khuẩn lạc
- Số khuẩn lạc có trong 1g thực
phẩm được tính
|
X
=
|
10
+ 14
|
x 100 = 120
|
|
2
x 10
|
Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm
có 1,2 ´ 10 2 vi khuẩn C.perfringens
Sơ
đồ định lượng C. perfringens
1. Đồng nhất mẫu
Thạch
Tryptose – Sunfit – Cycloserin (TSC)
3. Đổ thạch
4. Ủ ấm
Bình kỵ khí để trong điều kiện
350C/20-24 giờ
5. Nhận định kết quả sơ bộ: Chọn
đĩa có 20-200 khuẩn lạc đen để đếm
6. Xác định hình thể, tính chất
bắt mầu và khả năng sinh nha bào
7. Xác định tính chất sinh vật
hoá học
Trực khuẩn ngắn
Có nha
bào
Mầu đen trên môi trường TSC
Lactoza:
(+)
Hơi: (+)
Iron – milk: (+)
Làm lỏng gelatin
PHỤ LỤC
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DÙNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG C.
PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM
1. Thạch Tryptose - Sulfide -
Cycloserine (TSC agar)
|
Tryptose (Difco)
|
15g
|
|
Men thủy phân
|
5g
|
|
Soyton
|
5g
|
|
Sắt ammonium citrat
|
1g
|
|
Natri metabisunfit
|
1g
|
|
Agar
|
20g
|
|
Nước cất
|
900ml
|
- Đun tan môi trường TSC.
- pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng,
để môi trường ở 500C.
- Dung dịch D-cycloserine : Pha
1gam D-cycloserin (tinh thể trắng) vào 200ml nước cất. Khử trùng bằng cách lọc
và bảo quản 40C trước khi dùng.
- Khi dùng : cho 20 ml dung dịch
D-cycloserin vào 250 ml thạch nêu trên. Trộn đều đổ đĩa.
Trong trường hợp cần thạch TSC
có lòng đỏ trứng gà, sau khi cho D-cycloserin vào, cho thêm 20 ml dung dịch
lòng đỏ trứng gà. Trộn đều đổ đĩa trước khi dùng.
2. Canh thang thyoglycolat
|
L.cystin
|
0,5g
|
|
Agar
|
0,75 g
|
|
NaCl
|
2,5 g
|
|
Dextroza
|
5 g
|
|
Men thủy
phân
|
5 g
|
|
Trypton
|
15 g
|
|
Natri thioglycolat hoặc axit thioglycolat
|
0,5g
|
|
Resazurin natri
solution(1:1000) mới pha
|
1ml
|
|
Nước cất
|
1 lít
|
Pha L- cystin, NaCl, dextroza,
men thủy phân và tryptose trong 1 lít nước. Đun cách thủy cho tan. Pha thêm
natri thioglycolat hoặc axit thioglycolic, pH = 7,1 ± 0,2. Cho thêm dung dịch
Natri resazurin, trộn rồi hấp ướt 1210C/20 phút. Có thể san ra các ống
nghiệm trước khi sấy ướt.
2. Môi trường Iron - Milk cải tiến
|
Sữa tươi toàn phần
|
1 lít
|
|
Sắt sunfat.7H2O
|
1 g
|
|
Nước cất
|
50ml
|
Hòa sắt sunfat vào trong 50 ml
nước cất. Cho từ từ 1 lít sữa, vừa cho vừa quấy đều bằng máy khuấy từ (hoặc bằng
đũa thủy tinh). Hút 11ml môi trường vào ống nghiệm 16 x 150 mm. Hấp ướt 1180C/15
phút. Môi trường này pha chế nên sử dụng ngay.
4. Môi trường lactoza -
gelatin
|
Tryptose
|
15g
|
|
Men thủy phân
|
10g
|
|
Lactoza
|
10g
|
|
Đỏ phenol
|
0,05 g
|
|
Gelatin
|
120g
|
|
Nước cất
|
1 lít
|
Đun cho tan Tryptose, men thủy
phân và lactoza trong 400ml nước. Hòa tan gelatin trong 600ml nước nóng 50 - 600C
cho tan. Trộn 2 hỗn dịch trên lại, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. Cho thêm chỉ thị màu
đỏ phenol. San ra các ống nghiệm 16 x 150mm. Hấp ướt ở 1210C/10phút.
Trong vòng 8 giờ nếu chưa dùng cần để nóng 50 - 700C/ 2 - 3 giờ trước
khi tiến hành xét nghiệm.
5. Môi trường canh thang bào tử
(Sporulation broth)
|
Polypepton
|
15g
|
|
Men thủy phân
|
3 g
|
|
Starch, soluble
|
3 g
|
|
MgSO4 khan
|
0,1g
|
|
Natri thioglycolat
|
1 g
|
|
Na2HPO4
|
11g
|
|
Nước cất
|
1lít
|
Chỉnh pH 7,8 ± 0,1. San ra các ống
nghiệm. Hấp ướt 1210C/15 phút.
6. Môi trường di động nitrat
|
Cao thịt
bò
|
3 g
|
|
Pepton (Difco)
|
5 g
|
|
KNO3
|
1 g
|
|
Na2HPO4
|
2,5g
|
|
Thạch
|
3 g
|
|
Galactoza
|
5 g
|
|
Glycerin
|
5 ml
|
|
Nước cất
|
1 lít
|
Hòa các chất trên trừ thạch. Chỉnh
pH 7,3 ± 0,1. Cho thêm thạch và đun đến khi tan. San ra các ống 11 ml. Hấp ướt
1210C/15 phút. Nếu trong vòng 4 giờ chưa sử dụng thì trước khi tiến
hành xét nghiệm phải đun sôi cách thủy 10 phút, sau đó làm lạnh ngay bằng nước.
7. Dung dịch đệm glycerin muối
|
Glycerin
|
100ml
|
|
K2HPO4
|
12,4g
|
|
KH2PO4
|
4g
|
|
NaCl
|
4,2g
|
|
Nước cất
|
900ml
|
Hòa tan NaCl trong bình có 900ml
nước cất. Cho glycerin và phosphat chỉnh pH=7,2. Hấp ướt 1210C/15phút.
Trong trường hợp dùng dung dịch glycerin đậm đặc (20%) , cho 200ml glycerin
trong 800ml nước cất.