|
BỘ Y TẾ
-------
|
CỘNG HÒA XÃ HỘI
CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------
|
|
Số: 3123/QĐ-BYT
|
Hà Nội, ngày 02
tháng 10 năm 2025
|
QUYẾT ĐỊNH
VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ
THUẬT VỀ GIẢI PHẪU BỆNH”
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;
Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27/02/2025 của Chính phủ quy
định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;
Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ
trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;
Căn cứ Quyết định số 621/QĐ-BYT
ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng
chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Giải phẫu
bệnh”;
Căn cứ Biên bản họp ngày 08
tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình kỹ
thuật về Giải phẫu bệnh”; Công văn số 3270/BVK-KHTH ngày 25 tháng 08 năm 2025
của Bệnh viện K về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật
chuyên ngành Giải phẫu bệnh;
Theo đề nghị của Cục trưởng
Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.
QUYẾT ĐỊNH:
Điều 1.
Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn
“Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” – Tập 1, gồm 69 quy trình kỹ
thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).
Điều 2.
Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về
Giải phẫu bệnh” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Dựa trên tài
liệu chuyên môn này, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh có trách nhiệm xây dựng quy
trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám bệnh,
chữa bệnh.
Điều 3.
Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.
Điều 4.
Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản
lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc
các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc
trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu
trách nhiệm thi hành Quyết định này./.
|
Nơi nhận:
- Như Điều 4;
- Bộ trưởng (để báo cáo);
- Các Thứ trưởng;
- BHXNVN
- Bộ Tài chính;
- Cổng thông tin điện tử Bộ Y tế;
- Website Cục QLKCB;
- Tổng hội Y học Việt Nam và các hội y khoa;
- Lưu: VT, KCB.
|
KT. BỘ TRƯỞNG
THỨ TRƯỞNG
Trần Văn Thuấn
|
HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
VỀ GIẢI PHẪU BỆNH
(TẬP 1)
(Ban
hành kèm theo Quyết định số 3123/QĐ-BYT ngày 02 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng
Bộ Y tế)
|
Chỉ đạo biên soạn, thẩm định
|
|
|
GS.TS. Trần Văn Thuấn
|
Thứ trưởng Bộ Y tế
|
|
Chủ biên
|
|
|
PGS.TS. Trịnh Tuấn Dũng
|
Chủ tịch Hội Giải phẫu bệnh -
Tế bào bệnh học Việt Nam
|
|
TS. BS. Hà Anh Đức
|
Cục trưởng, Cục Quản lý Khám,
chữa bệnh
|
|
Tham gia biên soạn, thẩm định
|
|
|
PGS.TS. Trịnh Tuấn Dũng
|
Chủ tịch Hội Giải phẫu bệnh -
Tế bào bệnh học Việt Nam
|
|
TS.BS. Dương Huy Lương
|
Phó Cục trưởng, Cục Quản lý
Khám, chữa bệnh
|
|
TS.BS. Vương Ánh Dương
|
Phó Cục trưởng, Cục Quản lý
Khám, chữa bệnh
|
|
PGS.TS. Tạ Văn Tờ
|
Giám đốc Trung tâm Giải phẫu
bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K
|
|
TS. Nguyễn Văn Chi
|
Phó Cục trưởng, Cục Bà mẹ và
Trẻ em
|
|
TS.BS. Phạm Văn Tuyến
|
Giám đốc Trung tâm Giải phẫu
bệnh - Tế bào học, Bệnh Viện Bạch Mai
|
|
PGS.TS. Nguyễn Văn Chủ
|
Trưởng khoa Giải phẫu bệnh Bệnh
Viện K (K1).
|
|
TS.BS. Dương Hoàng Hảo
|
Trưởng Khoa Giải Phẫu Bệnh- Bệnh
viện Ung bướu Hà Nội
|
|
TS.BS. Nguyễn Công Trung
|
Trưởng Khoa Giải Phẫu Bệnh- Bệnh
viện E; Giảng viên Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Hà Nội
|
|
TS. BS. Nguyễn Khánh Dương
|
Trưởng khoa Giải phẫu bệnh, bệnh
viện Phụ Sản Trung ương
|
|
BS CKII. Nguyễn Bùi Ngọc Diệp
|
Phó khoa Giải phẫu bệnh lý, Bệnh
viện Chợ Rẫy
|
|
BS CKII. Đoàn Phước Thi
|
Phó trưởng khoa Giải phẫu bệnh,
Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế
|
|
PGS.TS. Đặng Công Thuận
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh
viện Đại học Y Dược Huế
|
|
TS.BS. Đoàn Thị Phương Thảo
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh
viện Đại học Y - Dược thành phố Hồ Chí Minh
|
|
TS. BS. Ngô Thị Minh Hạnh
|
Chủ nhiệm Khoa Giải phẫu bệnh,
Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
|
|
PGS.TS. BS CKII. Trần Ngọc
Dũng
|
Chủ nhiệm Bộ môn-Khoa Giải phẫu
bệnh - Pháp Y, Bệnh viện Quân y 103
|
|
TS.BS. Nguyễn Ngọc Dũng
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh -Tế
bào học – Viện Huyết học Truyền máu Trung ương
|
|
TS.BS. Hoàng Anh Tuấn
|
Trưởng khoa Xét nghiệm Bệnh
viện Mắt Trung ương
|
|
TS.BS. Trần Ngọc Minh
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh
viện Đại học Y Hà Nội; Giảng viên bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Hà Nội
|
|
TS.BS. Nguyễn Sỹ Lánh
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh
viện Hữu nghị Việt Đức
|
|
TS. BS. Hoàng Ngọc Thạch
|
Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện
Nhi Trung ương
|
|
BS CK II. Phó Hồng Điệp Phó
|
Trưởng khoa Khoa Giải phẫu bệnh
Bệnh viện Nhi Trung ương
|
|
BS CKII. Phạm Duy Đạt
|
Trưởng khoa Khoa Giải phẫu bệnh
lý, Bệnh viện đa khoa Xanh Pôn Hà Nội
|
|
PGS.TS.BS. Lê Trung Thọ
|
Giám đốc Trung tâm Giải phẫu
bệnh- Sinh học phân tử, Bệnh viện Phổi Trung ương; Giảng viên cao cấp Bộ môn
Giải phẫu bệnh, Đại học Y Hà Nội
|
|
ThS.BS. Đỗ Xuân Anh
|
Trưởng khoa Xét nghiệm tổng hợp,
bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương
|
|
TS.BS. Phạm Nguyên Cường
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh
viện TW Huế
|
|
BSCKII. Lê Thị Hải Yến Phó
|
Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh
viện Da liễu Trung ương
|
|
TS.BS.NCVCC. Tưởng Phi Vương
|
Viện trưởng, Viện 69
|
|
ThS.BS.NCVC. Lê Tài Thế
|
Chủ nhiệm khoa hình thái học,
Viện 69
|
|
Thư ký
|
|
|
ThS.BS. Đào Nguyên Minh
|
Trưởng phòng Quản lý chất lượng
và Chuyển giao kỹ thuật, Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
|
BS. CKII Nguyễn Thị Thanh Mai
|
Phó Giám đốc Trung tâm Giải
phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K
|
|
BS CKII. Trần Văn Chương
|
Phó Giám đốc Giám đốc Trung
tâm Giải phẫu bệnh - Tế bào học, Bệnh Viện Bạch Mai
|
|
ThS.KTY. Ninh Văn Quyết
|
Trung tâm Giải phẫu bệnh - Tế
bào học, Bệnh Viện Bạch Mai
|
|
BSCKII. Chử Quốc Hoàn
|
Trưởng phòng Kế hoạch Tổng hợp;
Bệnh viện K
|
|
ThS.BS. Nguyễn Cao Cường
|
Phòng Kế hoạch Tổng hợp; Bệnh
viện K
|
|
ThS.BS. Lê Sinh Quân
|
Chuyên viên, Phòng Quản lý chất
lượng và Chuyển giao kỹ thuật, Cục Quản lý Khám, chữa bệnh
|
LỜI NÓI ĐẦU
Ngành Giải phẫu bệnh đóng vai
trò hết sức quan trọng trong Hệ thống y tế hiện đại, được xem là tiêu chuẩn vàng
trong để chẩn đoán xác định nhiều bệnh, đặc biệt là các bệnh lý u và ung thư.
Việc chuẩn hóa các quy trình chuyên môn kỹ thuật trong lĩnh vực này là hết sức
cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng chẩn đoán, thống nhất trong thực hành, nâng
cao hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh.
Trên cơ sở các tiến bộ khoa học
kỹ thuật, cập nhật theo các hướng dẫn quốc tế và phù hợp với điều kiện thực tiễn
tại Việt Nam, Bộ Y tế tổ chức xây dựng tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy
trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tập 1”. Tài liệu này tổng hợp,
hệ thống hóa các quy trình kỹ thuật từ cơ bản đến chuyên sâu, áp dụng trong hoạt
động chuyên môn tại các cơ sở khám chữa bệnh có triển khai các xét nghiệm Giải
phẫu bệnh.
Tài liệu này là cơ sở quan trọng
cho các bác sĩ, kĩ thuật viên và nhân viên y tế trong việc thực hành các kỹ thuật
về Giải phẫu bệnh một cách khoa học, chính xác và hiệu quả. Đồng thời, đây cũng
là căn cứ để các cơ sở y tế xây dựng quy trình nội bộ, phục vụ công tác đào tạo,
kiểm tra và đánh giá chất lượng chuyên môn.
Bộ Y tế trân trọng cảm ơn các
chuyên gia, các nhà khoa học, các đơn vị y tế và các cá nhân đã đóng góp nhiều
công sức trong quá trình xây dựng tài liệu này.
Trong quá trình sử dụng, nếu có
khó khăn, vướng mắc hoặc góp ý hoàn thiện, đề nghị các đơn vị phản hồi về Bộ Y
tế để kịp thời cập nhật, bổ sung.
Trân trọng !
|
|
GS. TS. Trần Văn Thuấn
THỨ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
|
NGUYÊN TẮC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
1. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật
được xây dựng và ban hành theo từng chương, chuyên ngành; bao gồm các quy định
về chỉ định, chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị thực hiện kỹ thuật, đến các
bước thực hiện theo trình tự từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện kỹ thuật.
2. Tài liệu chuyên môn Hướng dẫn
quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào; Quyển 1 được xây dựng
và ban hành cho các kỹ thuật có trong Phụ lục số 02, Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ
trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh. Tài liệu
chuyên môn này được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng
07 năm 2026.
3. Quy định về thời gian thực
hiện kỹ thuật, nhân lực (chức danh chuyên môn nghề nghiệp, số lượng nhân lực),
thuốc, thiết bị y tế... trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ Y tế ban hành
dựa trên tính phổ biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.
Trong thực tế triển khai, căn cứ diễn biến lâm sàng, tình trạng người bệnh, căn
cứ vào điều kiện thực tế về hạ tầng, thiết bị, nhân lực các đơn vị quy định thời
gian tương ứng với điều kiện của đơn vị mình trong hướng dẫn quy trình của từng
đơn vị để làm căn cứ thực hiện.
4. Chỉ sử dụng các thuốc, thiết
bị y tế... được cấp phép theo quy định hiện hành.
5. Trong quá trình triển khai
áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, nếu thấy các bất cập hoặc nhu cầu cần sửa
đổi, bổ sung, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và ban hành Hướng
dẫn quy trình kỹ thuật, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục QLKCB) về việc
cập nhật để ban hành áp dụng trong cả nước.
MỤC
LỤC
CHỮ VIẾT TẮT
PHẦN I. CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT
TẾ BÀO HỌC
1. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ
TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG
2. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ
TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA
SIÊU ÂM
3. CHỌC HÚT KIM NHỎ CÁC TỔN
THƯƠNG HOẶC U Ở VỊ TRÍ SÂU (Ổ BỤNG, TRUNG THẤT,…) DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM
4. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ
BÀO HỌC CÁC BỆNH PHẨM CHỌC HÚT KIM NHỎ, ÁP LAM
5. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ
BÀO HỌC DỊCH CƠ THỂ
6. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC,
GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ÁP (Impression Cytology – IC)
7. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC,
GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NẠO (Scraping cytology on the conjunctive and cornea)
8. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN
ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAPANICOLAOU
9. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HAI MÀU HEMATOXYLIN - EOSIN TIÊU BẢN TẾ BÀO HỌC
10. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ
BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (LIQUID – BASED CYOTLOGY)
11. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ
BÀO TRONG CÁC LOẠI DỊCH CƠ THỂ BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (Non Gyn)
13. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TẾ BÀO
TÌM TINH THỂ URAT QUA KÍNH HIỂN VI PHÂN CỰC PHẦN II. CÁC QUY TRÌNH NHUỘM MÔ BỆNH
HỌC – TẾ BÀO
28. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐỎ CONGO KIỀM (THEO PUCHTLER 1962)
29. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH ALCIAN
30. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 3 MÀU CỦA MASSON (1929)
31. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA CHO TUỶ XƯƠNG
32. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOUDAN III HOẶC IV
33. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM OIL RED O TRONG DUNG DỊCH ETHANOL
34. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐEN SOUDAN B TRONG DIACETIN
35. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GROCOTT
36. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH PHỔ PERL PHÁT HIỆN ION SẮT
37. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC WARTHIN – STARY PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI
38. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT CAO
39. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI CHO SỢI VÕNG
40. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN CẢI BIÊN THEO SHIKATA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN HbsAg
41. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN VIÊM GAN B (HbsAg) TRONG MÔ GAN
42. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MUCICARMIN
43. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA
44. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH TOLUIDINE
45. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH LUXOL/NISEELL
46. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
47. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NGẤM BẠC XEM DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT
48. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM TRICHROME BLUE
49. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI METHENAMINE SILVER
50. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT
51. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CHẤT ĐỒNG
52. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC CHO THẬN BẰNG PHƯƠNG PHÁP XANH JONES
53. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS (Periodic Acid Schiff)
54. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF DIASTATE (PAS – D)
55. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN EOSIN TRÊN TIÊU BẢN MÔ
56. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA TRÊN MẢNH CẮT MÔ PHÁT HIỆN HP
57. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS KẾT HỢP XANH ALCIAN
58. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DIFF - QUICK
59. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ
BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA
60. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ
BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI
61. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ
BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM RETICULINE
62. NHUỘM ZIEHL – NEELSEN TÌM
VI KHUẨN LAO TRONG TỔ CHỨC
63. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN
THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT
64. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN
THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRUYỀN QUA
PHẦN III. CÁC QUY TRÌNH
65. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH CHO MỘT DẤU ẤN
66. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH TỰ ĐỘNG CHO MỖI MỘT DẤU ẤN BẰNG MÁY
67. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH
68. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN ALK
69. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH
70. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN PD-L1 TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH
71. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MÔ MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI DẤU ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT
TIÊU BẢN
72. XÉT NGHIỆM HOÁ TẾ BÀO MIỄN
DỊCH TRÊN PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT TIÊU BẢN CHO MỘT DẤU ẤN
73. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA
MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI DẤU ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC TIÊU BẢN
75. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
76. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
77. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
78. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP CHO BỘ 6 KHÁNG THỂ
79. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP ĐỊNH LƯỢNG HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ
80. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP TÁCH MUỐI PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
81. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC HAI MÀU (DUAL-ISH)
82. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIRATION: ISH)
83. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAI TẠI CHỖ GẮN MÀU (CISH)
84. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAI TẠI CHỖ GẮN HUỲNH QUANG (FISH)
DANH MỤC KỸ THUẬT
|
STT
(cột 1)
|
STT của chương (cột 2)
|
Tên chương (cột 3)
|
Mã liên kết (cột 4)
|
Tên kỹ thuật (cột 5)
|
|
9009
|
1
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.13; 25.16
|
Chọc hút kim nhỏ 1 vị trí tổn
thương hoặc u của da, dưới da hoặc các cơ quan có vị trí nông
|
|
9010
|
2
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.1
|
Chọc hút kim nhỏ 1 vị trí tổn
thương hoặc u của da, dưới da hoặc các cơ quan có vị trí nông dưới hướng dẫn
của siêu âm
|
|
9011
|
3
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.1; 25.4; 25.6; 25.12; 25.16
|
Chọc hút kim nhỏ các tổn
thương hoặc u có vị trí sâu (ổ bụng, trung thất,…) dưới hướng dẫn của siêu âm
|
|
9012
|
4
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.89
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học các bệnh phẩm chọc hút kim nhỏ, áp lam
|
|
9013
|
5
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.20; 25.21; 25.22; 25.23; 25.24; 25.25; 25.26; 25.27
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học dịch cơ thể
|
|
9014
|
6
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học kết mạc, giác mạc bằng phương pháp áp (Impression cytology)
|
|
9015
|
7
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học kết mạc, giác mạc bằng phương pháp nạo (Scraping cytology on the
conjunctive and cornea)
|
|
9016
|
8
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.74
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học bằng phương pháp nhuộm Papanicolaou
|
|
9017
|
9
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.60
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm hai màu Hematoxyline - Eosin trên tiêu bản tế bào học
|
|
9018
|
10
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.78
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào học bằng phương pháp tế bào học chất lỏng (Liquid base Cytology)
|
|
9019
|
11
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.78
|
Xét nghiệm và chẩn đoán tế
bào trong các loại dịch cơ thể bằng phương pháp tế bào học chất lỏng (Non
Gyn)
|
|
9021
|
13
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm tìm tinh thể urat
qua kính hiển vi phân cực
|
|
9036
|
28
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.32
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm đỏ Congo kiềm (theo Puchtler 1962)
|
|
9037
|
29
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.36
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm xanh alcian
|
|
9038
|
30
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.38
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm 3 màu của Masson (1929)
|
|
9039
|
31
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.40
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm May - Grunwald - Giemsa cho tủy xương
|
|
9040
|
32
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.43
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Soudan III hoặc IV
|
|
9041
|
33
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.44
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Oil Red O trong dung dịch Ethanol
|
|
9042
|
34
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.45
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm đen Soudan B trong diacetin
|
|
9043
|
35
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.49
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Grocott
|
|
9044
|
36
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.50
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm xanh Phổ Perl phát hiện ion sắt
|
|
9045
|
37
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.51
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm bạc Warthin - Stary phát hiện Helicobacter pylori
|
|
9046
|
38
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.53
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm sắt cao
|
|
9047
|
39
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.54
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Gomori cho sợi võng
|
|
9048
|
40
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.57
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Orcein cải biên theo Shikata phát hiện kháng nguyên HBsAg
|
|
9049
|
41
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.58
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Orcein phát hiện kháng nguyên viêm gan B (HBSAg) trong mô
gan
|
|
9050
|
42
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.72
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Mucicarmin
|
|
9051
|
43
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.77
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm May Grunwald - Giemsa
|
|
9052
|
44
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Xanh Toluidine
|
|
9053
|
45
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Xanh LuXol/Nisell
|
|
9054
|
46
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Gram
|
|
9055
|
47
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm ngấm bạc xem dưới kính hiển vi điện tử quét
|
|
9056
|
48
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Trichrome blue
|
|
9057
|
49
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Gomori methenamine silver
|
|
9058
|
50
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm sắt
|
|
9059
|
51
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm đồng
|
|
9060
|
52
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm xanh jones
|
|
9061
|
53
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.35
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm PAS Periodic Acid Schiff
|
|
9062
|
54
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Periodic acid schiff - diastate (PAS- D)
|
|
9063
|
55
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.37
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm hai màu Hematoxyline - Eosin trên tiêu bản mô
|
|
9064
|
56
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.59
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Giemsa trên mảnh cắt mô phát hiện HP
|
|
9065
|
57
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.69
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm PAS kết hợp xanh Alcian
|
|
9066
|
58
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.75
|
Xét nghiệm và chẩn đoán bằng
phương pháp nhuộm Diff - Quick
|
|
9067
|
59
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.59
|
Xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh
học bằng phương pháp nhuộm Giemsa
|
|
9068
|
60
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.54
|
Xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh
học bằng phương pháp nhuộm Gomori
|
|
9069
|
61
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh
học bằng phương pháp nhuộm Reticuline
|
|
9070
|
62
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Nhuộm Ziehl - neelsen tìm vi
khuẩn lao trong tổ chức
|
|
9071
|
63
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Chuẩn bị mẫu mô và đọc tổn
thương trên kính hiển vi điện tử quét
|
|
9072
|
64
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Chuẩn bị mẫu mô và đọc tổn
thương trên kính hiển vi điện tử truyền qua
|
|
9073
|
65
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.61
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hoá
mô miễn dịch cho mỗi một dấu ấn
|
|
9074
|
66
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hóa
mô miễn dịch tự động cho mỗi một dấu ấn bằng máy
|
|
9075
|
67
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hoá
mô miễn dịch cho mỗi dấu ấn trong điều trị đích (ALK, TROP-2, ROS1, BRAF,…)
|
|
9076
|
68
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hóa
mô miễn dịch dấu ấn ALK
|
|
9077
|
69
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hoá
mô miễn dịch cho mỗi dấu ấn trong điều trị miễn dịch (PD-L1, CTLA-4,…)
|
|
9078
|
70
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hóa
mô miễn dịch dấu ấn PD-L1 trong điều trị miễn dịch
|
|
9079
|
71
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán hóa
mô miễn dịch đồng thời từ hai dấu ấn trở lên trên cùng một phiến đồ hoặc một
tiêu bản
|
|
9080
|
72
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm hóa tế bào miễn dịch
trên phiến đồ hoặc một tiêu bản
|
|
9081
|
73
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm hóa tế bào miễn dịch
đồng thời từ hai dấu ấn trở lên trên cùng một phiến đồ hoặc một tiêu bản
|
|
9083
|
75
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.62
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn
dịch huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên
|
|
9084
|
76
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.63
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn
dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện kháng nguyên
|
|
9085
|
77
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.64
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn
dịch huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng thể
|
|
9086
|
78
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.116
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn
dịch huỳnh quang cho bộ 6 kháng thể để chẩn đoán mô bệnh học
|
|
9087
|
79
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn
dịch huỳnh quang gián tiếp định lượng hiệu giá kháng thể
|
|
9088
|
80
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm và chẩn đoán miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp tách muối phát hiện kháng thể
|
|
9089
|
81
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.85
|
Xét nghiệm bằng phương pháp
lai tại chỗ hai màu (Dual- ISH)
|
|
9090
|
82
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.83
|
Xét nghiệm bằng phương pháp
lai tại chỗ (In situ - hybridization: ISH)
|
|
9091
|
83
|
29. Giải phẫu bệnh
|
25.84
|
Xét nghiệm bằng phương pháp
lai tại chỗ gắn màu (CISH)
|
|
9092
|
84
|
29. Giải phẫu bệnh
|
|
Xét nghiệm bằng phương pháp
lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH)
|
CHỮ VIẾT TẮT
|
AI:
|
Trí tuệ nhân tạo (Artificial
Intelligence)
|
|
BS:
|
Bác sĩ
|
|
CISH:
|
Lai tại chỗ gắn màu
(chromogenic in situ hybridization)
|
|
Dual ISH:
|
Lai tại chỗ gắn hai màu
|
|
FITC:
|
Fluorescence Isothiocynate
|
|
FNA:
|
Chọc hút kim nhỏ (Fine Needle
Aspiration)
|
|
GPB:
|
Giải phẫu bệnh
|
|
HE:
|
Hematoxylin - Eosin
|
|
HMMD:
|
Hoá mô miễn dịch
|
|
HTBMD:
|
Hoá tế bào miễn dịch
|
|
HVĐTTQ:
|
Hiển vi điện tử truyền qua
|
|
IHC:
|
Hoá mô miễn dịch
(Immunohistochemistry)
|
|
ISH:
|
Lai tại chỗ (Insitu
Hybridiration)
|
|
KHV:
|
Kính hiển vi
|
|
KN:
|
Kháng nguyên
|
|
KT:
|
Kháng thể
|
|
MDHQ:
|
Miễn dịch huỳnh quang
|
|
MDHQGT:
|
Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
|
|
MSDS:
|
Bảng chỉ dẫn an toàn hoá chất
(Material Data Safety Sheets)
|
|
PAP:
|
Papanicolaou
|
|
PAS:
|
Periodic Acid Schiff
|
|
TBS:
|
Dung dịch đệm duy trì PH
(Tris-Buffered Saline)
|
|
XN:
|
Xét nghiệm
|
|
WSI:
|
Hình ảnh toàn bộ tiêu bản (Whole
Slide Image)
|
PHẦN I. CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC
1. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI
DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện
lấy bệnh phẩm tế bào bằng kĩ thuật chọc hút kim nhỏ của các tổn thương hoặc các
khối u da, dưới da hoặc các cơ quan ở vị trí nông (như tuyến vú, hạch, tuyến nước
bọt, tuyến giáp,…); không có hướng dẫn của các thiết bị chẩn đoán hình ảnh; nhằm
lấy đúng vùng tổn thương, lấy được bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế
bào học cũng như các xét nghiệm khác (hoá tế bào, khối tế bào,…).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ
(FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào
vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có
gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên
lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp để phục vụ xét nghiệm chẩn đoán
tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.
Tế bào thu được sau chọc hút để
thực hiện xét nghiệm tế bào nhằm xác định các tổn thương viêm hoặc các tổn
thương u lành, u ác tính hoặc thực hiện các xét nghiệm khác như thực hiện kỹ
thuật khối tế bào, xét nghiệm các dấu ấn sinh học,...
2. CHỈ ĐỊNH
- Tổn thương u có thể sờ thấy bằng
khám lâm sàng.
3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
- Người bệnh có bệnh nặng toàn
thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;
- Người bệnh có rối loạn đông
máu;
4. THẬN TRỌNG
- Thận trọng với người bệnh có tiền
sử động kinh, cao huyết áp,…
- Thận trọng với các tổn thương
đang trong giai đoạn viêm, đặc biệt trong viêm cấp hoặc viêm nhiễm nặng tại chỗ.
- Người bệnh quá mức lo lắng,
không hợp tác.
5. CHUẨN BỊ
5.1. Người thực hiện
- Nhân lực trực tiếp:
+ Bác sĩ được hướng dẫn
hoặc đào tạo kỹ thuật: 01
+ Bác sĩ phụ: 01
+ Kỹ thuật y: 01
- Nhân lực hỗ trợ:
+ Nhân viên hành chính;
+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.
5.2. Thuốc, hoá chất
- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung
dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);
- Dung dịch cố định bệnh phẩm:
cồn tuyệt đối,…
- Gel sử dụng trong siêu âm;
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh;
- Dung dịch rửa tay thường quy;
- Nước cất;
- Các thuốc trong hộp chống sốc.
- Thuốc giảm đau bôi hoặc xịt
ngoài da.
5.3. Vật tư, dụng cụ
Vật tư tiêu hao:
- Bơm tiêm vô trùng 10ml hoặc
20ml;
- Kim tiêm loại 23G hoặc 27G;
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ
để ghi thông tin người bệnh;
- Lọ chứa dung dịch cố định để
chứa bệnh phẩm;
- Bông khô tiệt trùng;
- Băng dính y tế;
- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ
y tế;
- Giấy/khăn lau tay;
- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.
- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút
bi;
Dụng cụ:
- Dụng cụ gắn bơm tiêm;
- Pipet nhựa;
- Hộp inox đựng bông cồn, bông
khô có nắp đậy;
- Ống inox đựng phanh, kéo;
- Panh thẳng không mấu
- Kéo inox;
- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ,
vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;
- Hộp đựng bông cồn sát trùng
và hộp đựng bông khô tiệt trùng;
- Hộp bằng thép không rỉ đựng
bơm, kim tiêm sạch;
- Hộp chống sốc;
- Khay/giá để tiêu bản;
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm;
- Tấm phủ vô khuẩn;
- Túi rác thải y tế; túi rác thải
thông thường;
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng) và thông thường (màu xanh).
5.4. Trang thiết bị
- Ống nghe, máy đo huyết áp;
- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;
- Giường làm thủ thuật.
- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.
- Kính hiển vi quang học;
- Máy tính, máy in; máy quét mã
vạch.
5.5. Chuẩn bị người bệnh
- Giải thích cho người bệnh hoặc
người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người
bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.
- Khai thác tiền sử bệnh và các
triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.
- Khám người bệnh xác định vị
trí vùng cần thực hiện thủ thuật, màu sắc, số lượng, mật độ, kích thước, sự di
động.
5.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy
mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.
5.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kĩ thuật:
20 - 30 phút
5.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
- Phòng thủ thuật hoặc phòng
xét nghiệm tế bào học.
5.9. Kiểm tra hồ sơ
- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá
tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực
hiện kỹ thuật.
- Thực hiện bảng kiểm an toàn
thủ thuật;
- Hướng dẫn bệnh nhân tư thế đảm
bảo bộc lộ rõ vùng cần thực hiện thủ thuật và an toàn khi thực hiện. Bộc lộ vị
trí cần thực hiện thủ thuật.
6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT
6.1. Thực hiện thủ thuật lấy
bệnh phẩm
- Thủ thuật nên thực hiện sau
các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh.
- Giải thích người bệnh về thủ
thuật; kiểm tra kết quả chẩn đoán hình ảnh của bệnh nhân để đánh giá chính xác
u.
- Hướng dẫn người bệnh nằm hoặc
ngồi với tư thế phù hợp với vị trí yêu cầu thực hiện thủ thuật.
- Chuẩn bị dụng cụ thực hiện thủ
thuật, chuẩn bị lam kính và/hoặc lọ đựng bệnh phẩm viết tên, tuổi, mã số của bệnh
nhân. Sát khuẩn tay trước khi thực hiện thủ thuật.
- Bộc lộ vị trí cần chọc.
- Sát khuẩn vùng cần chọc, phủ
sand lỗ.
- (Có thể gây tê vùng da tại chỗ
bằng lidocain bôi hoặc xịt ngoài da. Nếu người bệnh dị ứng thuốc tê có thể giải
thích để không gây tê. Chờ 1 phút).
- Thực hiện thủ thuật: Cố định
vị trí cần chọc bằng 2 ngón tay trái, tay phải cầm bơm tiêm có kim. Đưa kim
tiêm chọc hút qua da vào ổ tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch hoặc tế bào
vào trong lòng kim. Rút nhanh kim qua da.
- Có thể hút nhiều vị trí tổn
thương nếu u > 1,5cm.
- Sát trùng lại vị trí chọc.
- Băng ép vết chọc.
6.2. Làm phiến đồ (Dàn bệnh
phẩm lên lam kính) và cố định bệnh phẩm
- Tháo kim ra khỏi bơm tiêm.
Kéo pittông xuống để lấy không khí vào bơm tiêm tạo áp lực. Lắp kim vào bơm
tiêm.
- Nhanh chóng bơm dịch trong
kim và bơm tiêm ra các lam kính đã ghi sẵn thông tin người bệnh.
- Dùng một lam kính khác dàn bệnh
phẩm trên các lam kính có bệnh phẩm để bệnh phẩm được dàn mỏng, đều. Có thể dàn
bằng kim nếu bệnh phẩm ít.
- Để khô lam kính tự nhiên
trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu
không khí có độ ẩm cao.
- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng
dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá
và không đánh giá đúng tổn thương.
- Nếu có các xét nghiệm có thể
bơm 1 phần bệnh phẩm vào lọ đựng bệnh phẩm có sẵn dung dịch bảo quản. Nắp lọ
kín tránh tràn đổ.
6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại
thể
- Yêu cầu kết quả của lam kính
chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.
- Lam kính bệnh phẩm không đạt:
+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi
hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều
máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.
+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá
dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và
nên dàn luôn ngay khi rút kim.
+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy
được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực
âm.
+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc
trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn
ngay.
- Các trường hợp đánh giá chưa
đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.
6.4. Kết thúc thủ thuật
- Đánh giá tình trạng người bệnh
sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh không để vùng thực hiện thủ thuật dính
nước trong 24 giờ.
- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh
phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm,
thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…
- Kiểm tra lại thông tin bệnh
nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm và phiếu chỉ định.
- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ
đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm
giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.
7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN
- Chảy máu tại vị trí chọc:
băng ép cầm máu..
- Người bệnh choáng sau chọc: Để
bệnh nhân nằm nghỉ và xử trí chống choáng.
- Nhiễm trùng tạo vị trí chọc:
Chuyển bác sĩ lâm sàng khám và kê đơn chống viêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đề cương tài liệu chuyên môn
hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.
2. Sigmon DF, Fatima S. Fine
Needle Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.
3. Dey, P. (2022). The Basic
Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory
Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.
2. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI
DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện
lấy bệnh phẩm tế bào bằng kĩ thuật chọc hút kim nhỏ của các tổn thương hoặc các
khối u da, dưới da hoặc các cơ quan ở vị trí nông (như tuyến vú, hạch, tuyến nước
bọt, tuyến giáp,…); có hướng dẫn của các thiết bị chẩn đoán hình ảnh; nhằm lấy
đúng vùng tổn thương, lấy được bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế bào học
cũng như các xét nghiệm khác (hoá tế bào, khối tế bào,…).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ
(FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào
vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có
gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên
lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp để phục vụ xét nghiệm chẩn đoán
tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.
Thực hiện lấy bệnh phẩm tế bào
dưới hướng dẫn của siêu âm là kỹ thuật FNA kết hợp cùng siêu âm tại vị trí nghi
ngờ nhằm xác định đúng tổn thương và hướng dẫn hướng đi của kim tiêm để nâng
cao độ chính xác.
2. CHỈ ĐỊNH
- Tổn thương u có thể sờ thấy bằng
khám lâm sàng hoặc không sờ thấy rõ trên khám lâm sàng.
3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
- Người bệnh có bệnh nặng toàn
thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;
- Người bệnh có rối loạn đông
máu;
4. THẬN TRỌNG
- Thận trọng với người bệnh có
tiền sử động kinh, cao huyết áp,…
- Thận trọng với các tổn thương
đang trong giai đoạn viêm, đặc biệt trong viêm cấp hoặc viêm nhiễm nặng tại chỗ.
- Người bệnh quá mức lo lắng,
không hợp tác.
- Các trường hợp tổn thương khu
trú tại gan, đặc biệt là những tổn thương nghi ngờ ung thư.
5. CHUẨN BỊ
5.1. Người thực hiện
- Nhân lực trực tiếp:
+ Bác sĩ được hướng dẫn
hoặc đào tạo kỹ thuật: 01
+ Bác sĩ phụ: 01
+ Kỹ thuật y: 01
- Nhân lực hỗ trợ:
+ Nhân viên hành chính;
+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.
5.2. Thuốc, hoá chất
- Thuốc gây tê tại chỗ;
- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung
dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);
- Dung dịch cố định bệnh phẩm:
cồn tuyệt đối,…
- Gel sử dụng trong siêu âm;
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh;
- Dung dịch rửa tay thường quy;
- Nước cất;
- Các thuốc trong hộp chống sốc.
5.3. Vật tư, dụng cụ
Vật tư tiêu hao:
- Kim chọc hút chuyên dụng;
- Bơm tiêm 10ml hoặc 20ml;
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ
để ghi thông tin người bệnh;
- Lọ chứa dung dịch cố định để
chứa bệnh phẩm;
- Bông khô tiệt trùng;
- Băng dính y tế;
- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ
y tế;
- Giấy/khăn lau tay;
- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.
- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút
bi;
Dụng cụ:
- Dụng cụ gắn bơm tiêm;
- Pipet nhựa;
- Hộp inox đựng bông cồn, bông
khô có nắp đậy;
- Ống inox đựng phanh, kéo;
- Panh thẳng không mấu
- Kéo inox;
- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ,
vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;
- Hộp đựng bông cồn sát trùng
và hộp đựng bông khô tiệt trùng;
- Hộp bằng thép không rỉ đựng
bơm, kim tiêm sạch;
- Hộp chống sốc;
- Khay/giá để tiêu bản;
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm;
- Tấm phủ vô khuẩn;
- Túi rác thải y tế; túi rác thải
thông thường;
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng) và thông thường (màu xanh).
5.4. Trang thiết bị
- Ống nghe, máy đo huyết áp;
- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;
- Giường làm thủ thuật.
- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.
- Kính hiển vi quang học;
- Máy tính, máy in; máy quét mã
vạch.
5.5. Chuẩn bị người bệnh
- Giải thích cho người bệnh hoặc
người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người
bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.
- Khai thác tiền sử bệnh và các
triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.
5.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy
mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.
5.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kĩ thuật:
30 phút
5.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
- Phòng thủ thuật hoặc phòng
xét nghiệm tế bào học.
5.9. Kiểm tra hồ sơ
- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá
tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực
hiện kỹ thuật.
- Thực hiện bảng kiểm an toàn
thủ thuật;
6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ
THUẬT
6.1. Siêu âm đánh giá lại tổn
thương
- Giải thích cho bệnh nhân về
thủ thuật.
- Người bệnh nằm theo đúng tư
thế có thể bộc lộ rõ vùng tổn thương.
- Người bệnh quá kích thích,
không nằm yên: cần cho thuốc an thần…
- Siêu âm đánh giá vị trí tổn
thương, mật độ, tính chất,…
- Đánh dấu vị trí tại da.
- Sát trùng da sau đó phủ khăn
phủ vô khuẩn có lỗ.
6.2. Lấy bệnh phẩm
- Chuẩn bị dụng cụ chọc, lam
kính viết tên, tuổi, mã số của bệnh nhân.
- Đặt đầu dò tìm vị trí chọc
kim thuận lợi nhất: tổn thương nằm giữa đường dẫn, đường đi không xuyên qua mạch
máu, đường đi ngắn nhất.
- Sát khuẩn đầu dò, bôi đủ gel
lên đầu dò, bọc đầu dò bằng găng vô khuẩn.
- Sát khuẩn lại vùng da vị trí
chọc.
- Gây tê tại chỗ.
- Nhân viên phụ cầm đầu dò vị
trí nghiêng, cố định tại vị trí có thể nhìn rõ u.
- Đưa kim tiêm chọc hút vào ổ tổn
thương theo đúng đường đã định trước, quan sát trên màn hình siêu âm điều chỉnh
đầu kim đúng tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch chọc chui vào trong lòng
kim. Rút nhanh kim qua da.
- Dùng áp lực của bơm tiêm, đưa
toàn bộ bệnh phẩm ra khỏi bơm kim tiêm lên lam kính và/hoặc cho vào lọ chứa
dung dịch cố định bệnh phẩm tế bào có sẵn.
- Nếu lấy bệnh phẩm lên lam
kính cần dàn mỏng ngay, lực dàn vừa phải. Có thể dùng kim dàn bệnh phẩm hoặc
dùng 2 lam kính dàn đều bệnh phẩm.
- Có thể hút nhiều vị trí tổn
thương nếu u > 1,5cm.
- Sát trùng lại và băng vị trí
chọc để tránh chảy máu.
6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại
thể
- Yêu cầu kết quả của lam kính
chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.
- Lam kính bệnh phẩm không đạt:
+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi
hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều
máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.
+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá
dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và
nên dàn luôn ngay khi rút kim.
+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy
được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực
âm.
+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc
trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn
ngay.
- Các trường hợp đánh giá chưa
đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.
6.4. Kết thúc kỹ thuật
- Đánh giá tình trạng người bệnh
sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh nằm tại giường nếu cần.
- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh
phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm,
thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…
- Kiểm tra lại thông tin bệnh
nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm. Nắp lọ kín tránh tràn đổ.
- Để khô lam kính tự nhiên
trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu
không khí có độ ẩm cao.
- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng
dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá
và không đánh giá đúng tổn thương.
- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ
đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm
giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.
7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN
- Chảy máu tại vị trí chọc hoặc
trong ổ bụng: chuyển ngoại khoa xử trí.
- Rỉ mật, dịch tiêu hoá vào ổ bụng:
chuyển ngoại khoa để phẫu thuật.
- Tràn khí màng phổi: chuyển cấp
cứu xử trí.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đề cương tài liệu chuyên môn
hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.
2. Sigmon DF, Fatima S. Fine
Needle Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.
3. Dey, P. (2022). The Basic
Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory
Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.
3. CHỌC HÚT KIM NHỎ CÁC TỔN THƯƠNG HOẶC U Ở VỊ TRÍ SÂU (Ổ BỤNG,
TRUNG THẤT,…) DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện
lấy bệnh phẩm tế bào các bộ phận ở vị trí sâu (gan, lách, hạch trung thất, tuỵ,
hạch ổ bụng,…) dưới hướng dẫn của siêu âm; để lấy đúng vùng tổn thương, lấy được
bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ
(FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào
vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có
gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên
lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp.
Các mô nằm sâu không thể kiểm
tra thấy trên lâm sàng, dễ chảy máu, vì vậy cần quan sát trên siêu âm để xác định
chính xác vị trí tổn thương, hướng dẫn hướng đi của kim tiêm nhằm lấy chính xác
tổn thương. Bệnh phẩm của chọc tế bào có thể sử dụng để chẩn đoán tế bào học và
các xét nghiệm khác.
2. CHỈ ĐỊNH
- Các trường hợp tổn thương khu
trú tại các vị trí sâu, đặc biệt là những tổn thương nghi ngờ ác tính.
3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
- Người bệnh có bệnh nặng toàn
thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;
- Người bệnh có rối loạn đông
máu.
4. THẬN TRỌNG
- Thận trọng với người bệnh có
tiền sử động kinh, cao huyết áp, cổ trướng,…
- Người bệnh quá mức lo lắng,
không hợp tác.
5. CHUẨN BỊ
5.1. Người thực hiện
- Nhân lực trực tiếp:
+ Bác sĩ được hướng dẫn
hoặc đào tạo kỹ thuật: 01
+ Bác sĩ phụ: 01
+ Kỹ thuật y: 01
+ Điều dưỡng: 01
- Nhân lực hỗ trợ:
+ Nhân viên hành chính;
+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.
5.2. Thuốc, hoá chất
- Thuốc gây tê tại chỗ;
- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung
dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);
- Dung dịch cố định bệnh phẩm:
cồn tuyệt đối,…
- Gel sử dụng trong siêu âm;
- Dung dịch sát khuẩn tay
nhanh;
- Dung dịch rửa tay thường quy;
- Nước cất;
- Các thuốc trong hộp chống sốc.
5.3. Vật tư, dụng cụ
Vật tư tiêu hao:
- Kim chọc hút chuyên dụng;
- Bơm tiêm 10ml hoặc 20ml;
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ
để ghi thông tin người bệnh;
- Lọ chứa dung dịch cố định để
chứa bệnh phẩm;
- Bông khô tiệt trùng;
- Băng dính y tế;
- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ
y tế;
- Giấy/khăn lau tay;
- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.
- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút
bi;
Dụng cụ:
- Dụng cụ gắn bơm tiêm;
- Pipet nhựa;
- Hộp inox đựng bông cồn, bông
khô có nắp đậy;
- Ống inox đựng phanh, kéo;
- Panh thẳng không mấu
- Kéo inox;
- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ,
vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;
- Hộp đựng bông cồn sát trùng
và hộp đựng bông khô tiệt trùng;
- Hộp bằng thép không rỉ đựng
bơm, kim tiêm sạch;
- Hộp chống sốc;
- Khay/giá để tiêu bản;
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm.
- Tấm phủ vô khuẩn;
- Túi rác thải y tế; túi rác thải
thông thường;
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng) và thông thường (màu xanh).
5.4. Trang thiết bị
- Ống nghe, máy đo huyết áp;
- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;
- Giường làm thủ thuật.
- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.
- Kính hiển vi quang học;
- Máy tính, máy in; máy quét mã
vạch.
5.5. Chuẩn bị người bệnh
- Giải thích cho người bệnh hoặc
người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người
bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.
- Khai thác tiền sử bệnh và các
triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.
5.6. Hồ sơ bệnh án
- Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy
mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.
- Phim cắt lớp vi tính, cộng hưởng
từ nếu có.
5.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kĩ thuật:
30 phút
5.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
- Phòng thủ thuật hoặc phòng
xét nghiệm tế bào học.
5.9. Kiểm tra hồ sơ
- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá
tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực
hiện kỹ thuật.
- Thực hiện bảng kiểm an toàn
thủ thuật;
6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ
THUẬT
6.1. Siêu âm đánh giá lại tổn
thương và chọn đường vào
- Tại phòng can thiệp: người bệnh
nằm, đặt đường truyền tĩnh mạch, lắp máy theo dõi nhịp thở, mạch, huyết áp, điện
tâm đồ, SpO2.
- Người bệnh quá kích thích,
không nằm yên: cần cho thuốc an thần…
- Siêu âm đánh giá vị trí tổn
thương, mật độ, tính chất,…
- Đánh dấu vị trí tại da.
- Sát khuẩn rộng vùng da bằng
dung dịch sát khuẩn tiêu chuẩn và phủ sand lỗ.
- Chuẩn bị dụng cụ chọc, lam
kính viết tên, tuổi, mã số của bệnh nhân.
- Tìm vị trí chọc kim thuận lợi
nhất: tổn thương nằm giữa đường dẫn, đường đi không xuyên qua mạch máu hoặc ống
tiêu hoá, đường đi ngắn nhất.
- Mỗi cơ quan khuyến cáo vị trí
khác nhau: Với lách, thường sử dụng ở khoảng gian sườn 10 đến 12 trên đường nách
giữa để tránh chọc vào màng phổi.
- Sát khuẩn đầu dò, bôi đủ gel
lên đầu dò, bọc đầu dò bằng găng vô khuẩn.
- Sát khuẩn lại vùng da vị trí
chọc.
- Gây tê tại chỗ: Gây tê theo hướng
vào khối u từ da đến phúc mạc, gây tê dưới bao lách. Chờ 1 phút cho thuốc tê có
hiệu lực.
- Nhân viên phụ cầm đầu dò vị
trí nghiêng, cố định tại vị trí có thể nhìn rõ u.
- Đưa kim tiêm chọc hút vào ổ tổn
thương theo đúng đường đã định trước, quan sát trên màn hình siêu âm điều chỉnh
đầu kim đúng tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch chọc chui vào trong lòng
kim. Rút nhanh kim qua da.
- Dùng áp lực của bơm tiêm, đưa
toàn bộ bệnh phẩm ra khỏi bơm kim tiêm lên lam kính và/hoặc cho vào lọ chứa
dung dịch cố định bệnh phẩm tế bào có sẵn.
- Nếu lấy bệnh phẩm lên lam
kính cần dàn mỏng ngay, lực dàn vừa phải. Có thể dùng kim dàn bệnh phẩm hoặc
dùng 2 lam kính dàn đều bệnh phẩm.
- Lấy thêm bệnh phẩm làm xét
nghiệm tế bào theo quy trình sinh thiết bệnh phẩm làm xét nghiệm giải phẫu bệnh.
- Sát trùng lại và băng vị trí
chọc để tránh chảy máu.
6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại
thể
- Yêu cầu kết quả của lam kính
chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.
- Lam kính bệnh phẩm không đạt:
+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi
hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều
máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.
+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá
dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và
nên dàn luôn ngay khi rút kim.
+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy
được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực
âm.
+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc
trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn
ngay.
- Các trường hợp đánh giá chưa
đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.
6.4. Kết thúc kỹ thuật
- Đánh giá tình trạng người bệnh
sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh nằm tại giường trong 6 giờ, theo dõi mạch,
huyết áp và thành bụng trong 24 giờ.
- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh
phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm,
thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…
- Kiểm tra lại thông tin bệnh
nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm. Nắp lọ kín tránh tràn đổ.
- Để khô lam kính tự nhiên
trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu
không khí có độ ẩm cao.
- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng
dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá
và không đánh giá đúng tổn thương.
- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ
đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm
giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.
7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN
- Chảy máu tại vị trí chọc hoặc
trong ổ bụng: chuyển ngoại khoa xử trí.
- Tràn khí màng phổi: chuyển cấp
cứu xử trí.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đề cương tài liệu chuyên môn
hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.
2. Sigmon DF, Fatima S. Fine Needle
Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.
3. Dey, P. (2022). The Basic
Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory
Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.
4. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC CÁC BỆNH PHẨM CHỌC HÚT
KIM NHỎ, ÁP LAM
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
nhuộm và chẩn đoán tế bào học trên bệnh phẩm tế bào chọc hút kim nhỏ hoặc áp
lam.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Bệnh phẩm tế bào của quá trình
chọc tế bào hoặc bệnh phẩm tế bào bong, tế bào lấy từ cạo hoặc áp lam tổn
thương được dàn trên lam kính, sau đó được nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt
để đánh giá hình thái tế bào và chẩn đoán tế bào học.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
- Găng tay vô trùng, khẩu
trang.
- Pipet nhựa.
- Lam kính.
- Giá đựng lam kính.
- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh,
vị trí chọc hút.
- Các dụng cụ để nhuộm: khay, cốc
pha thuốc nhuộm, ống hút.
- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và
tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người
thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.
- Dung dịch cố định phù hợp.
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl -
Neelsen…).
- Các dung dịch sát khuẩn.
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên lam kính.
2.3. Trang thiết bị
- Bàn sấy tiêu bản.
- Kính hiển vi quang học (nên
có gắn camera chụp ảnh vi thể);
- Máy tính, máy in; đầu quét mã
vạch;
- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ
sơ;
- Thùng rác đựng rác thải y tế
và rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được
thực hiện theo Quy trình chọc hút kim nhỏ (FNA) (có thể có hoặc không dưới hướng
dẫn của siêu âm).
Yêu cầu: bệnh phẩm hút ra được
dàn lên lam kính, để khô tự nhiên, sau đó cố định phiến đồ theo đúng hướng dẫn.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh
phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 30 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm đủ tiêu chuẩn.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Bước 1: Cố định phiến đồ:
- Cố định bằng dung dịch phù hợp
lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định
tuỳ phương pháp nhuộm).
Bước 2: Nhuộm các phiến đồ
- Theo một trong các phương
pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl
– Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin (tham khảo các phương pháp nhuộm tại Phần
III).
4.2. Nhận định kết quả
Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi
Bác sĩ Giải phẫu bệnh Tế bào, từ
đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ
thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Phiến đồ bị mất tế bào trong
quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Tế bào thoái hóa, tan rã,
không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải
làm xét nghiệm ngay.
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị
dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
5. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC DỊCH CƠ THỂ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học các loại mẫu dịch lấy từ cơ thể.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Trong các loại dịch của cơ thể
như dịch phế quản, dịch màng phổi, dịch khớp, dịch ổ bụng, nước tiểu… có thể có
các tế bào bong ra, tế bào u từ các tổn thương ở đó. Vì vậy, cần lấy được các tế
bào này và nhận định loại tế bào, hình thái, số lượng tế bào trong dịch, sự sắp
xếp tế bào, nền phiến đồ dưới kính hiển vi quang học để chẩn đoán bệnh.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
- Găng tay vô trùng, khẩu
trang.
- Ống hút tự động.
- Pipet nhựa
- Lọ đựng dịch ly tâm
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.
- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh
phẩm.
- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh,
vị trí chọc hút.
- Các dụng cụ để nhuộm: khay,
giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.
- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và
tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người
thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.
- Dung dịch cố định phù hợp
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl -
Neelsen…).
- Các dung dịch sát khuẩn.
2.3. Trang thiết bị
- Máy ly tâm;
- Bàn sấy tiêu bản;
- Kính hiển vi quang học;
- Máy tính, máy in; đầu quét mã
vạch;
- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ
sơ;
- Thùng rác đựng rác thải y tế
và rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được
thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu
bệnh.
Yêu cầu: dịch hút ra phải cho
vào các lọ đựng bệnh phẩm sạch không có chất bảo quản, có đầy đủ thông tin về bệnh
nhân trên nhãn dán.
Bệnh phẩm được vận chuyển ngay
đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh hoặc bảo quản trong nhiệt độ 2-8°C nếu chưa
vận chuyển ngay.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh
phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 1 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Bước 1: Tập trung tế bào
- Ly tâm dịch bằng máy ly tâm.
- Gạn bỏ phần trong bên trên, lấy
phần lắng cặn tế bào bên dưới (1-2ml)
Bước 2: Làm phiến đồ:
- Dùng pipet hút dịch cặn dàn đều
lên các lam kính đã ghi sẵn mã người bệnh.
- Dùng một lam kính sạch khác đặt
lên trên cặn, dàn nhẹ, đều bệnh phẩm giữa hai lam kính để bệnh phẩm được dàn mỏng,
đều
Bước 3: Cố định phiến đồ:
- Cố định bằng dung dịch phù hợp
lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định
tuỳ phương pháp nhuộm).
Bước 4 Nhuộm các phiến đồ
- Theo một trong các phương
pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl
– Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học.
- Lưu ý: Đối với các bệnh phẩm
đã được các khoa lâm sàng chọc hút và áp nhuộm phết lam kính rồi thì cần được gửi
ngay lên Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh để thực hiện xét nghiệm, và tiến hành
quy trình xét nghiệm từ bước cố định phiến đồ.
4.2. Nhận định kết quả
Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ
thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Phiến đồ bị mất tế bào trong
quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn
tuyệt đối.
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Tế bào thoái hóa, tan rã,
không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải
làm xét nghiệm ngay.
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian.
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị
dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017
6. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ÁP
(Impression Cytology – IC)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm tế bào học kết mạc,
giác mạc bằng phương pháp áp (test áp) nhằm đánh giá hình thái của một vài lớp
tế bào bề mặt của kết mạc/giác mạc; được chỉ định để chẩn đoán một số bệnh ở bề
mặt nhãn cầu như: hội chứng khô mắt, viêm kết mạc vùng rìa, thiếu tế bào nguồn
vùng rìa, tổn thương hắc tố ở kết mạc, u biểu mô kết giác mạc,...
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật test áp dùng giấy lọc
cellulose acetate đặt lên bề mặt nhãn cầu để lấy khoảng 2-3 lớp tế bào bề mặt của
biểu mô kết – giác mạc; nếu muốn lấy được các lớp tế bào sâu hơn thì áp lại tại
cùng một vị trí tổn thương.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ
- Kỹ thuật Y, Điều dưỡng
2.2. Vật tư, hoá chất
- Bông hấp tiệt trùng;
- Panh giác mạc và thìa nạo
(Curette) đã hấp tiệt trùng;
- Giấy lọc cellulose acetate
kích thước lỗ từ 0,22 µm - 0,44µm;
- Lam kính sạch một đầu mài mờ,
bút viết kính, giá cắm lam;
- Đèn cồn;
- Pipet nhựa;
- Găng tay sạch, mũ, khẩu
trang;
- Hộp đựng bông cắt nhỏ vô
trùng, hộp đựng dụng cụ lấy bệnh phẩm bằng inox;
- Các dung dịch sát khuẩn;
- Hộp đựng dụng cụ sắc nhọn;
- Cốc pha thuốc nhuộm;
- Thuốc nhỏ mắt gây tê bề mặt
nhãn cầu (Alcaine/dicain,...);
- Nước muối sinh lý 0,9% vô
trùng/dung dịch thuốc nhỏ mắt sát khuẩn.;
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ (Hematoxylin Eosin/Giemsa/Diff - Quick/ Papanicolaou/Ziehl –
Neelsen,…);
- Dung dịch cố định phù hợp (Ví
dụ: cồn etylic, axit axetic, formol,…);
- Dầu soi kính: điều kiện bảo
quản nhiệt độ phòng.
2.3. Trang thiết bị
- Giường lấy bệnh phẩm, đèn
soi;
- Bàn để dụng cụ, ghế ngồi cho
Bác sĩ và kỹ thuật viên;
- Bàn có mặt phẳng rộng để đặt
kính hiển vi;
- Tủ bảo quản hoá chất sinh phẩm;
- Tủ ấm 56°C;
- Kính hiển vi quang học;
- Sổ ghi kết quả, hộp thuốc chống
sốc, ống nghe, máy đo huyết áp;
- Máy tính, máy in; đầu quét mã
vạch;
- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ
sơ;
- Thùng đựng rác thải y tế, thùng
đựng rác thải thông thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Chuẩn bị người bệnh:
+ Người bệnh được giải thích về
quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích để người bệnh yên tâm và hợp
tác làm xét nghiệm.
+ Khai thác tiền sử người bệnh
có yếu tố dị ứng.
+ Hướng dẫn người bệnh phối hợp
để lấy mẫu theo đúng yêu cầu.
+ Người bệnh ở tư thế thoải
mái, phù hợp với cách lấy bệnh phẩm.
- Loại mẫu bệnh phẩm: Các tế
bào bong ở một vài lớp tế bào bề mặt của biểu mô kết mạc và/hoặc giác mạc.
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo
quản: Panh giác mạc và thìa nạo (Curette), Giấy lọc cellulose acetate kích thước
lỗ từ 0,22 µm - 0,44µm, lam, kính.
- Điều kiện bảo quản và vận
chuyển mẫu bệnh phẩm: Bảo quản, vận chuyển mẫu ở nhiệt độ phòng.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: có
các tế bào của các lớp bề mặt nhãn cầu tại vùng lấy mẫu dính vào Giấy lọc
cellulose acetate.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm có đầy đủ các mục: họ tên, tuổi, số gường (đối với người bệnh đang điều
trị nội trú), khoa, chẩn đoán, vị trí lấy bệnh phẩm, số lượng,...
- Kiểm tra người bệnh: Đúng người
bệnh, đúng chỉ định, đúng mắt cần làm xét nghiệm
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 45 – 60 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật.
Khoa Xét nghiệm hoặc Khoa Giải
phẫu bệnh – tế bào bệnh học (bước lấy bệnh phẩm có thể lấy ở khoa lâm sàng).
3. AN TOÀN
- Áp dụng các biện pháp
an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn
xét nghiệm.
- Tất cả các mẫu bệnh phẩm được
xem như là nguồn nhiễm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Tra thuốc gây tê bề mặt
1-2 lần, mỗi lần 1-2 giọt cách nhau khoảng 2 phút vào kết mạc cùng đồ dưới của
mắt cần lấy bệnh phẩm.
4.1.2. Đặt vành mi hoặc dùng
ngón tay cái và ngón tay trỏ vành mắt của người bệnh.
4.1.3. Thấm nhẹ phần thuốc gây
tê và nước mắt còn thừa.
4.1.4. Dùng mảnh giấy lọc
Cellulose acetate đã cắt sẵn theo kích thước phù hợp đặt lên bề mặt vùng tổn
thương ở kết mạc hoặc giác mạc và dùng đầu của curette ấn nhẹ lên mảnh giấy, giữ
như vậy trong khoảng từ 5-10 giây.
4.1.5. Dùng panh giác mạc nhẹ
nhàng nhấc mảnh giấy ra khỏi bề mặt kết - giác mạc.
4.1.6. Cố định bệnh phẩm trong
dung dịch cố định (cồn etylic 95° hoặc hỗn hợp axit axetic, formol 37% và cồn
etylic theo tỷ lệ 1:1:20,..).
4.1.7. Nhuộm tiêu bản bằng phương
pháp Hematoxylin-Eosin hoặc Giemsa hoặc PAS hoặc Papanicolaou,… (đôi khi phải
phối hợp nhuộm nhiều phương pháp).
4.2. Nhận định kết quả
- Nhận định kết quả trên kính
hiển vi quang học
+ Các phiến đồ giàu tế bào, đều,
các tế bào không chồng chất lên nhau.
+ Hình thái các tế bào được bảo
tồn tốt.
+ Các tế bào bắt màu rõ ràng,
phân biệt được rõ hình thái của nhân, bào tương hoặc các thành phần khác tùy
vào phương pháp nhuộm.
- Kết luận sau khi phân tích
hình thái tế bào, loại tế bào; đôi khi còn có thể đánh giá cả cấu trúc mô.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả chính xác, ghi
chép rõ ràng kết quả và các thông tin theo quy định vào phiếu trả lời kết quả
và sổ kết quả xét nghiệm.
- Lưu kết quả theo quy định của
Bộ Y tế.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Người bệnh không hợp tác:
thuyết phục, giải thích.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật:
- Người bệnh bị đau, chảy nhiều
nước mắt, mắt không cố định nên khó thực hiện kỹ thuật: do lượng thuốc tê chưa
đủ hoặc thời gian tra thuốc cho người bệnh đến khi thực hiện kỹ thuật nhanh,
tra thêm thuốc tê hoặc tra thuốc tê theo đúng thời gian quy định.
- Người bệnh không hợp tác:
thuyết phục, giải thích.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Quá ít tế bào hoặc không lấy
được tế bào: do vị trí đặt giấy áp ướt, có nhiều nước mắt và/hoặc thời gian đặt
giấy áp nhanh quá.
- Cố định kém làm tế bào thoái
hóa không nhận định được hình thái nhân và bào tương: giải thích cho người bệnh
lấy bệnh phẩm làm lại xét nghiệm, cố định ngay sau khi dàn tiêu bản.
- Cặn thuốc nhuộm còn trên phiến
đồ: cần lọc thuốc nhuộm trước khi dùng, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy.
- Các tế bào bắt màu quá kém:
do thuốc nhuộm pha chưa đúng tỷ lệ hoặc không nhuộm đủ thời gian. Kiểm tra lại
thuốc nhuộm, nhuộm đủ thời gian.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật
chuyên ngành Giải phẫu bệnh, Tế bào học (Ban hành kèm theo Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25 tháng 12 năm 2013 của Bộ trưởng
Bộ Y tế).
2. Đề cương quy trình kỹ thuật
xét nghiệm (Ban hành kèm theo Quyết định số 3376/QĐ-BYT
ngày 30 tháng 8 năm 2023 của Bộ trưởng Bộ Y tế).
3. Diagnostic technologies in
Ophthalmology. Bentham Books, 2012.
7. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NẠO
(Scraping cytology on the conjunctive and cornea)
1. ĐẠI CƯƠNG
Xét nghiệm Tế bào học chất nạo
kết mạc, giác mạc là một phần quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh
lý viêm loét giác mạc, viêm kết mạc,... giúp xác định được nguyên nhân, đặc biệt
trong các trường hợp nghi ngờ tác nhân là virus, dị ứng.
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học mẫu bệnh phẩm chất nạo kết mạc, giác mạc.
Xét nghiệm tế bào học trong các
bệnh ở kết mạc, giác mạc (viêm kết mạc, viêm giác mạc, loét giác mạc..) bằng
phương pháp nạo là xác định về sự có mặt, tỉ lệ và phân tích sự biến đổi hình
thái của các tế bào, có trong bệnh phẩm nhằm hỗ trợ công tác chẩn đoán, theo
dõi và điều trị bệnh.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Tế bào trong các chất nạo kết mạc,
giác mạc được phết lên lam kính tạo thành một lớp mỏng, cố định ngay bằng cồn
90-99°C (cố định ướt) hoặc để khô trong không khí (cố định khô) và nhuộm bằng
phương pháp Giemsa.
Nguyên lý của nhuộm Giemsa là dựa
trên nhóm phophat của phẩm nhuộm gắn với liên kết adenin - thymin, liên kết có
nhiều ở DNA trong tế bào. Phản ứng oxy hóa sẽ tạo ra màu xanh của metylen ở
nhân tế bào, bào tương tế bào có thể bắt màu xanh hoặc hồng. Quan sát tiêu bản
nhuộm bằng kính hiển vi quang học để nhận định sự thay đổi về số lượng, hình dạng,
kích thước, nhân và nguyên sinh chất, phát hện ra các Chlamydia, thể vùi virus,
tế bào bạch cầu toan, vi khuẩn....
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ
- Kỹ thuật Y, Điều dưỡng
2.2. Vật tư, hoá chất
- Bông hấp tiệt trùng;
- Dao mổ số 15 (dùng một lần)/thìa
nạo (Curette)/kimura spatula vô trùng hoặc đã được hấp tiết trùng;
- Lam kính sạch một đầu mài mờ,
bút viết kính, giá cắm lam;
- Đèn cồn;
- Pipet nhựa;
- Găng tay sạch, mũ, khẩu
trang;
- Hộp đựng bông cắt nhỏ vô
trùng, hộp đựng dụng cụ lấy bệnh phẩm bằng inox;
- Các dung dịch sát khuẩn;
- Hộp đựng dụng cụ sắc nhọn;
- Cốc pha thuốc nhuộm;
- Thuốc nhỏ mắt gây têbề mặt
nhãn cầu (Alcaine hoặc thuốc tương đương);
- Nước muối sinh lý 0,9% vô
trùng;
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến
đồ (Giemsa/Diff - Quick/Hematoxylin Eosin/Papanicolaou/Ziehl – Neelsen,…);
- Dung dịch cố định phù hợp(Cồn
cố định 90-99°C,...);
- Dầu soi kính: điều kiện bảo
quản nhiệt độ phòng.
2.3. Trang thiết bị
- Giường lấy bệnh phẩm, đèn
soi;
- Bàn để dụng cụ, ghế ngồi cho
Bác sĩ và kỹ thuật viên;
- Bàn có mặt phẳng rộng để đặt
kính hiển vi;
- Kính hiển vi quang học;
- Sổ ghi kết quả, hộp thuốc chống
sốc, ống nghe, máy đo huyết áp;
- Máy tính, máy in; đầu quét mã
vạch;
- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ
sơ;
- Thùng đựng rác thải y tế,
thùng đựng rác thải thường.
2.4. Người bệnh
- Người bệnh được giải thích về
quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích để người bệnh yên tâm và hợp
tác làm xét nghiệm;
- Khai thác tiền sử người bệnh
có yếu tố dị ứng;
- Hướng dẫn người bệnh phối hợp
để lấy mẫu theo đúng yêu cầu;
- Người bệnh ở tư thế thoải
mái, phù hợp với cách lấy bệnh phẩm.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm có đầy đủ các mục: họ tên, tuổi, số giường (đối với người bệnh nội trú),
khoa, chẩn đoán, vị trí lấy bệnh phẩm, số lượng;
- Kiểm tra người bệnh: Đúng người
bệnh, đúng chỉ định, đúng mắt cần làm xét nghiệm.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: khoảng 45 – 60phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Thực hiện tại khoa Xét nghiệm hoặc khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào bệnh
học.
3. AN TOÀN
- Áp dụng các biện pháp an toàn
chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.
- Xem tất cả các mẫu bệnh phẩm
như là nguồn nhiễm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện:
Bước 1: Lấy bệnh phẩm
- Người bệnh nằm trên giường lấy
bệnh phẩm.
- Tra 1-2 giọt thuốc gây tê bề
mặt nhãn cầuhoặc thuốc tương đương vào kết mạc cùng đồ dưới mắt cần lấy bệnh phẩm
trước lúc làm xét nghiệm từ 1 đến 2 phút.
a. Lấy bệnh phẩm kết mạc
- Bộc lộ kết mạc mi trên.
- Dùng curette vô trùng nạo nhẹ
kết mạc. Khi nạo để lấy được tế bào biểu mô, kết mạc phải hơi trắng tránh để chảy
máu nhiều.
b. Lấy bệnh phẩm giác mạc
- Đặt vành mi hoặc dùng ngón
tay cái và ngón tay trỏ vành mắt của người bệnh.
- Dùng Curette vô trùng hoặc
dao mổ số 15 hoặc Kimura,s spatula nạo nhẹ từ bờ ổ loét vào trung tâm hoặc đáy ổ
loét tuỳ theo yêu cầu của bác sĩ chỉ định và tính chất của tổn thương.
Bước 2: Làm phiến đồ:
- Phết bệnh phẩm lên lam kính sạch
tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn cồn đã ghi sẵn tên người bệnh.
- Dàn bệnh phẩm theo đường xoắn
ốc từ trong ra ngoài, đảm bảo bệnh phẩm được dàn mỏng, đều.
Bước 3: Cố định phiến đồ
Cố định bằng dung dịch phù hợp
lên toàn bộ lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định tuỳ
phương pháp nhuộm).
Bước 4: Nhuộm phiến đồ
Theo một trong các phương pháp
nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl –
Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học.
4.2. Nhận định kết quả
- Nhận định kết quả trên kính
hiển vi quang học
+ Các phiến đồ giàu tế bào, được
giàn mỏng, đều, các tế bào không chồng chất lên nhau.
+ Hình thái các tế bào được bảo
tồn tốt.
+ Các tế bào bắt màu rõ ràng,
phân biệt được rõ hình thái của nhân và bào tương.
+ Bạch cầu đoạn trung tính có
những hatk to nhỏ không đều màu xanh lơ tới đỏ, Bạch cầu ái toan màu đỏ.
+ Các loại tế bào khác nhân màu
tím đỏ, bào tương xanh nhạt.
+ Các thể vùi Chlamydia, vi khuẩn,
nấm và Acanthamoeba bắt màu xanh tím.
- Kết luận sau khi phân tích
hình thái tế bào.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả chính xác ghi
chép rõ ràng kết quả và các thông tin quy định vào phiếu trả lời kết quả và sổ
kết quả xét nghiệm.
- Lưu kết quả theo quy định của
Bộ Y tế.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật
- Người bệnh không hợp tác:
thuyết phục, giải thích.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật:
- Người bệnh bị đau, chảy nhiều
nước mắt, mắt không cố định nên khó thực hiện kỹ thuật: do lượng thuốc tê chưa đủ
hoặc thời gian tra thuốc cho người bệnh đến khi thực hiện kỹ thuật nhanh, tra
thêm thuốc tê hoặc tra thuốc tê theo đúng thời gian quy định.
- Người bệnh không hợp tác:
thuyết phục, giải thích.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Quá ít tế bào hoặc không lấy
được tế bào của tổn thương: do ổ loét giác mạch quá mỏng hoặc dọa thủng.
- Tiêu bản dàn quá dày hoặc phết
quá mạnh làm các tế bào chồng chất hoặc bị kéo dài, nát: dàn nhẹ nhàng đều tay.
- Cố định kém làm tế bào thoái
hóa không nhận định được hình thái nhân và bào tương: giải thích cho người bệnh
lấy bệnh phẩm làm lại xét nghiệm, cố định ngay sau khi dàn tiêu bản.
- Cặn thuốc nhuộm còn trên phiến
đồ cần lọc thuốc nhuộm trước khi dùng, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy.
- Các tế bào bắt màu quá kém:
do cố định không tốt, do thuốc nhuộm pha chưa đúng tỷ lệ, hoặc không nhuộm đủ
thời gian. Kiểm tra lại thuốc nhuộm, nhuộm đủ thời gian.
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị
dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi sinh vật y học (2016), Bộ
Y tế.
2. Thực tập Vi sinh vật Y học,
Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Hà Nội.
3. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật
xét nghiệm Vi sinh lâm sàng ban hành kèm theo quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017.
4. Bộ Y tế (2016), Quy trình kỹ
thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh, Tế bào học các quy trình kỹ thuật tế bào học,
Nhà xuất bản Y học, trang 379-457.
5. Ocular Microbiology. Aravind
Eye Hospitals and Postgraduate Insitute of Ophthalmology Madurai, India.
6. Diagnostic technologies in
Ophthalmology. Bentham Books, 2012.
8. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG
PHÁP NHUỘM PAPANICOLAOU
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phương pháp nhuộm tế bào được sử
dụng đặc biệt trong sàng lọc ung thư cổ tử cung và trong chẩn đoán ở mức độ tế bào
của các bướu đặc. Phương pháp này cho phép đánh giá chi tiết cấu trúc tế bào,
bào tương và nhân, từ đó hỗ trợ quá trình chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh
lý.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Nhuộm Papanicolaou còn được gọi
là “nhuộm PAP”, là một loại kỹ thuật Tế bào học nhuộm đa sắc, dùng để phân biệt
tế bào trên phiến đồ được lấy từ các dịch hoặc từ tế bào bong của cơ thể. Dạng
kinh điển của nhuộm PAP gồm 5 loại phẩm màu, được pha thành 3 dung dịch:
- Hematoxylin (phẩm nhuộm
base): nhuộm nhân tế bào
- Orang G (gồm acid
photphotungstic và OG-5, OG-8): nhuộm chất keratin có trong tế bào.
- Phẩm EA (Eosin Azure): gồm 3
loại phẩm (EA-36, EA-50, EA-65). Eosin Y nhuộm các tế bào vảy bề mặt, hạt nhân,
hồng cầu. Xanh lá cây nhạt SF (Light Green). Ánh vàng dùng để nhuộm bào tương của
các loại tế bào khác (tế bào vảy không sừng hóa). Nâu Bismarck Y do không nhuộm
thành phần nào nên trong công thức nhuộm hiện tại, một số phòng xét nghiệm đã bỏ
đi.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư, hóa chất:
- Dung dịch cố định bệnh phẩm:
Cồn tuyệt đối, cồn ete…
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
PAP, EA50, Orange...
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên phiến kính.
- Bể nhuộm, khay đựng tiêu bản,
lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính...
2.3. Trang thiết bị:
- Máy nhuộm tiêu bản tự động.
- Kính hiển vi quang học, bàn
có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi
- Sổ hoặc máy tính ghi lại
thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.
- Thùng rác thải y tế, rác thải
thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Lấy bệnh phẩm:
+ Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
+ Phiến đồ được cố định ngay
trong cồn tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và
tên người bệnh, vị trí lấy bệnh phẩm, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ
thuật, số lượng phiến đồ...
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 60 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn
phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
+ Chuyển liên tục trong các bể
cồn 80º, 70º rồi 50º, mỗi bể 5 lần nhúng
+ Rửa nước cất
+ Nhuộm nhân trong hematoxylin
Harris: 3 - 6 phút
+ Rửa nước cất
+ Nhúng 5 - 6 lần trong dung dịch
acid HCl 0,25%
+ Rửa nước chảy trong 6 phút rồi
qua nước cất khoảng 30 giây
+ Chuyển liên tục trong các bể
cồn 50º, 70º, 80º rồi 95º: mỗi bể 5 lần nhúng
+ Nhỏ Orange G phủ kín bệnh phẩm:
khoảng 1 - 3 phút
+ Chuyển liên tục qua 2 bể cồn
95º: mỗi bể 5 lần nhúng
+ Nhuộm trong hỗn hợp đa sắc
“EA50” trong khoảng 1 - 4 phút
+ Chuyển liên tục trong các bể
cồn 95º rồi 100º: mỗi bể 5 lần nhúng
+ Khử nước bằng cồn 95° và 100°
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
+ Gắn lá kính bằng bôm như thường
lệ.
- Kết quả
+ Nhân: xanh xám hoặc tím
+ Bào tương tế bào ưa acid: đỏ
hồng, đỏ tươi hoặc vàng da cam
+ Các tế bào ưa base: xanh nhạt,
đôi khi xanh ve nhạt.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống
phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phiến đồ bị mất tế bào vào
trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
9. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HAI MÀU
HEMATOXYLIN - EOSIN TIÊU BẢN TẾ BÀO HỌC
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm HE (Hematoxylin –
Eosin) trên phiến đồ tế bào học.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phương pháp nhuộm này áp dụng
cho tất cả các phiến đồ tế bào học chọc hút kim nhỏ, tế bào bong và phiến đồ áp
nhuộm thường quy, phiến đồ tế bào học dịch. Tương tự như quy trình nhuộm HE
trên mẫu mô, đây cũng là phương pháp nhuộm phối hợp đơn giản hai phẩm màu liên
tiếp, một phẩm màu có tính baze là Hematoxylin để nhuộm nhân, một phẩm màu có
tính acid là Eosin để nhuộm bào tương.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Hóa chất, Vật tư:
- Cồn methanol
- Xylen (toluen)
- Hematoxylin, Eosin
- Acid HCL, Lithiumcarbonat
- Keo gắn lamen
- Lam kính, lamen
- Găng tay vô trùng, khẩu
trang.
- Ống hút tự động.
- Ống đựng mẫu ly tâm
- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh
phẩm.
- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh,
vị trí chọc hút.
- Các dụng cụ để nhuộm: khay,
giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy ly tâm
- Kính hiển vi quang học, bàn
có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi
- Máy tính, máy in.
- Máy đo pH.
- Máy nhuộm tiêu bản tự động
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Lấy bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm
được thu thập từ các kỹ thuật chọc hút kim nhỏ, áp lam tế bào bong hoặc trên
các dịch cơ thể.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản cố định bằng cồn tuyệt
đối hoặc cồn ete, để khô
+ Rửa nước: nhúng 15 lần.
+ Nhuộm nhân bằng Hematoxylin:
3-5 phút hoặc lâu hơn.
+ Rửa nước chảy: 5-10 phút.
+ Kiểm tra màu của nhân qua
kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
+ Rửa nước chảy: 1 phút.
+ Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.
+ Rửa nước chảy: 1 phút.
+ Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º -
100º, mỗi bể 15 lần nhúng.
+ Qua 3 bể toluen, bể I và II
nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.
+ Gắn lamen
- Ngoài ra, tiêu bản sau khi cố
định, để khô có thể nhuộm bằng máy nhuộm tiêu bản tự động theo quy trình cài đặt
sẵn.
- Kết quả:
Nhân tế bào: xanh đến xanh đen
Bào tương tế bào: hồng đến đỏ
Hồng cầu: hồng đậm
Sợi tạo keo: hồng nhạt
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi
Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng
và chẩn đoán cho người bệnh:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ
thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Bào tương và nhân đều
bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.
- Nhân nhạt màu: tăng thời
gian nhuộm nhân.
- Nhân đậm màu quá mức:
tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
10. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ
BÀO HỌC CHẤT LỎNG (LIQUID – BASED CYOTLOGY)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán xét nghiệm và chẩn đoán kỹ thuật tế bào học chất lỏng trong đó bao
gồm cả bệnh phẩm tế bào học các loại dịch cơ thể và tế bào bong như tế bào cổ tử
cung – âm đạo.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phương pháp này nhằm nâng cao
hiệu quả phát hiện sớm các tế bào tiền ung thư, ung thư cổ tử cung. Đây là kỹ
thuật tế bào không ảnh hưởng đến môi trường, thiết bị đơn giản, có thể lưu trữ
bệnh phẩm để xét nghiệm lại khi cần (không phải mời người bệnh đến lấy lại bệnh
phẩm tế bào như các phương pháp khác), có thể sử dụng bệnh phẩm cho phân tích
các thụ thể, gen, các tác nhân gây bệnh, hóa miễn dịch tế bào… chỉ trong 1 lần
lấy bệnh phẩm. Dùng các hóa chất hòa tan chất nhầy và hồng cầu để các thành phần
này không che lấp các tế bào cần quan sát, cũng như dùng chất dính để các tế
bào như được dán lên lam kính, không bị trôi khi nhuộm. Các tế bào không bị chồng
chất lên nhau, nên rất dễ quan sát, do đó tăng độ nhạy, độ chính xác, giảm tỷ lệ
âm tính giả.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
- Các ống ly tâm, lọ đựng bệnh
phẩm có chất cố định.
- Ống hút tự động loại 20 đến
200µ và loại 500 đến 6000µ.
- Dung dịch làm sạch.
- Lam kính có gẵn sẵn chất chống
bong, lamen sạch.
- Hộp đựng phiến đồ
- Cồn 50°, 70°, 80°, 90°. 95°,
100°.
- Dung dịch cố định phù hợp
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến
đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin&Eosin/ Papanicolaou, Ziehl -
Neelsen…).
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên lam kính.
2.3. Trang thiết bị
- Máy ly tâm, tốc độ từ
100°-2000 vòng/phút.
- Máy tách chiết tế bào tự động
(Thinprep, Surethin, Surepath…)
- Ống hút tự động loại 20 đến
200µ và loại 500 đến 6000µ.
- Kính hiển vi quang học (có gắn
camera).
- Dụng cụ sấy tiêu bản;
- Hệ thống máy tính, máy in, đầu
quét mã vạch;
- Tủ lưu tiêu bản, lưu hồ sơ;
- Thùng rác đựng rác thải y tế
và rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 60 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Bước 1: Kỹ thuật tập trung tế
bào: Bệnh phẩm sau khi nhận sẽ được trộn đều, ly tâm và hút tế bào phết trên
lam kính chống bong. Việc thực hiện tự động trên hệ thống tách chiết tế bào,
theo hướng dẫn của từng hệ thống.
Yêu cầu: Tế bào lấy được phải đảm
bảo đủ số lượng và thành phần, loại trừ một phần hồng cầu hoặc tế bào viêm, tạo
chất.
Bước 2: Cố định phiến đồ:
- Cố định bằng dung dịch phù hợp
lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (tuỳ phương pháp
nhuộm).
Bước 3: Nhuộm phiến đồ Theo
một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May
Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin).
4.2. Nhận định kết quả
Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ
thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định tại cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
Cần xem xét lượng tế bào nhiều
hay ít để pha dung dịch chất dính (cell base). Nếu mật độ tế bào thấp, cần dùng
ít dung dịch cell base để có đủ tế bào chẩn đoán.
Lưu ý thời gian nhuộm nhân,
không để quá dài, vì nếu nhuộm nhân lâu sẽ làm tăng sắc, có thể dẫn đến nhận định
sai.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
11. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO TRONG CÁC LOẠI DỊCH CƠ THỂ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (Non Gyn)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm Tế bào học các loại dịch trong cơ thể bằng kĩ thuật tế bào học chất
lỏng (Liquid base cytology).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Tế bào học chất lỏng là một
phương pháp xét nghiệm tế bào thay vì phết trực tiếp bệnh phẩm trên lam kính
như xét nghiệm tế bào truyền thống thường, mẫu bệnh phẩm trong xét nghiệm tế
bào học chất lỏng được lấy vào các lọ có chứa dung dịch bảo quản có sẵn, chất lỏng
được xử lí loại bỏ chất nhày và hồng cầu. Tại phòng xét nghiệm sẽ sử dụng hệ thống
thiết bị có màng lọc, chất dính tế bào để phết một lớp tế bào lên lam kính để
xét nghiệm. Các tế bào không bị trôi hoặc chồng chất lên nhau, nên rất dễ quan
sát, do đó tăng độ nhạy, độ chính xác, giảm tỷ lệ âm tính giả.
Phương pháp này nhằm nâng cao
hiệu quả phát hiện sớm các tế bào tiền ung thư, ung thư. Đây là kỹ thuật tế bào
không ảnh hưởng đến môi trường, thiết bị đơn giản, có thể dùng bệnh phẩm để làm
nhiều xét nghiệm khác (như phân tích các thụ thể, gen, các tác nhân gây bệnh,
hóa miễn dịch tế bào…) chỉ trong 1 lần lấy bệnh phẩm. Đồng thời có thể lưu trữ
bệnh phẩm để xét nghiệm lại khi cần (không phải mời người bệnh đến lấy lại bệnh
phẩm tế bào như các phương pháp khác).
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Nhân lực trực tiếp
+ Bác sĩ: 01
+ Kỹ thuật y: 01.
- Nhân lực hỗ trợ:
+ Nhân viên hành chính;
+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Hoá chất
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ (Giemsa/Diff - Quik/HE/ Papanicoulou, Ziehl - Neelsen…);
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên phiến kính;
- Cồn 80°, 90° và cồn tuyệt đối;
- Dung dịch rửa tay thường quy.
2.2.2. Vật tư tiêu hao
Vật tư tiêu hao:
- Lam kính sạch có chất chống
bong, một đầu mài mờ để ghi thông tin người bệnh;
- Lamelle (lá kính);
- Bộ lấy mẫu bệnh phẩm chuyên dụng:
lọ chứa dung dịch đựng bệnh phẩm (có sẵn chất cố định và chất làm sạch), chổi
quét lấy mẫu.
- Bơm tiêm vô trùng 10ml hoặc
20ml và Kim tiêm loại 23G hoặc 27G (các trường hợp lấy dịch trong các tổn
thương dạng nang);
- Bộ dụng cụ nhuộm lam kính;
- Ống hút tự động loại 20 đến
200µ và loại 500 đến 6000µ;
- Các ống ly tâm;
- Bông khô tiệt trùng;
- Băng dính y tế;
- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ
y tế;
- Giấy/khăn lau tay;
- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.
- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút
bi;
Dụng cụ:
- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ,
vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;
- Hộp đựng bông cồn sát trùng
và hộp đựng bông khô tiệt trùng;
- Hộp bằng thép không rỉ đựng
bơm, kim tiêm sạch;
- Hộp chống sốc;
- Khay/giá để tiêu bản;
- Túi rác thải y tế; túi rác thải
thông thường;
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng) và thông thường (màu xanh).
2.3. Trang thiết bị
- Máy ly tâm, tốc độ từ
100°-2000 vòng/phút.
- Máy tách chiết tế bào tự động.
- Ống hút tự động loại 20 đến
200µ và loại 500 đến 6000µ.
- Kính hiển vi quang học (có gắn
camera).
- Dụng cụ sấy tiêu bản;
- Hệ thống máy tính, máy in, đầu
quét mã vạch;
- Tủ lưu tiêu bản, lưu hồ sơ;
- Thùng rác đựng rác thải y tế
và rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
2.4.1. Lấy mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm tế bào một số vị
trí như cổ tử cung – âm đạo, khoang miệng, tế bào bong ở da,… có thể dùng dụng
cụ lấy mẫu chuyên dụng (chổi quét) để lấy mẫu, nhúng vào lọ đựng dung dịch cố định.
- Các loại dịch như dịch màng
phổi, dịch màng bụng, dịch não tủy,… được lấy tại các phòng thủ thuật, chứa
trong các lọ đựng, bảo quản lạnh nếu chưa được vận chuyển đến phòng tế bào.
- Các mẫu phẩm tế bào khác có
thể được lấy mẫu bằng các kĩ thuật chọc hút tế bào tại phòng thủ thuật hoặc
phòng xét nghiệm tế bào; cho mẫu dịch vào các lọ chứa dung dịch cố định.
2.4.2. Bàn giao mẫu
- Các mẫu bệnh phẩm được bàn giao
đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh tế bào ngay trong ngày.
- Trên các lọ chứa mẫu phẩm ghi
đầy đủ thông tin người bệnh: tên, tuổi, mã số, mã vạch. Các thông tin phù hợp với
chỉ định xét nghiệm.
- Các lọ bệnh phẩm được đóng nắp,
không tràn lắc bệnh phẩm. Nếu tràn lắc bệnh phẩm cần lấy lại bệnh phẩm để thực
hiện xét nghiệm.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Ghi đầy đủ thông tin bệnh
nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh
nhân, thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, phương pháp lấy mẫu, vị
trí, số lượng mẫu.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến khoa xét nghiệm.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 40 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh
– tế bào
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm:
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Làm tiêu bản
- Khởi động hệ thống.
- Đặt lọ chứa bệnh phẩm vào vị
trí quy định trên máy.
- Đặt lam kính vào giá cài trên
máy.
- Cài màng lọc.
- Chọn chương trình.
- Ấn start.
- Sau khi chạy xong chương
trình , nhấc lam kính ra và nhuộm theo quy trình.
- Bỏ lọ đựng bệnh phẩm vào vị
trí lưu trữ và hủy bỏ theo quy trình quy định.
4.2. Nhuộm lam kính tế bào
- Theo một trong các phương
pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl
– Neelsen hoặc HE).
- Lựa chọn phương pháp nhuộm tuỳ
mục đích làm xét nghiệm.
4.3. Nhận định kết quả
- Tiêu bản sau khi nhuộm màu
xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ Giải phẫu bệnh.
- Đánh giá chất lượng tiêu bản:
màu sắc, mật độ tế bào trên tiêu bản nhuộm.
Tiêu bản chất lượng tốt.
+ Các tế bào tập trung chủ yếu ở
trung tâm tiêu bản, lớp tế bào mỏng đều.
+ Các tế bào bắt màu rõ nhân và
bào tương: nhân tím xanh, bào tương hồng nhạt, hồng cầu xanh nhạt.
- Đọc và nhận định kết quả:
+ Đánh giá loại tế bào, hình
thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm
+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn
thương u lành, u ác tính, phân típ,...
+ Một số vị trí có thể chẩn
đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo như tuyến giáp, cổ tử
cung có hệ thống phân loại Bethesda, ....
+ Phiên giải kết quả cần kết hợp
với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh
án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào
phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.
4.4. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Báo cáo kết quả: vào kết quả
trên phần mềm máy tính, in và ký kết quả bản cứng.
- Lọ chứa mẫu bệnh phẩm và tiêu
bản thực hiện xét nghiệm lưu trữ đúng vị trí và hủy theo quy định.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Sai sót về tủ tục hành chính:
Phiếu và lọ xét nghiệm không khớp tên, thiếu thông tin bệnh phẩm.... Cần kiểm
tra đầy đủ thông tin họ tên đầy đủ, tuổi của bệnh nhân đối chiếu mẫu bệnh phẩm
trước khi thực hiện xét nghiệm và liên hệ với bác sĩ lâm sàng.
- Sai phiếu chỉ định xét nghiệm:
Nhân viên phòng xét nghiệm kiểm tra đúng loại phiếu, nếu sai cần báo cho bác sĩ
và người thực hiện.
5.2. Trong quá trình thực
hiện kỹ thuật
- Sự cố do máy: máy rung lắc mạnh,
kêu...Vận hành máy đúng quy trình.
- Phiến đồ bị mất tế bào trong
quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn
tuyệt đối.
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Tế bào thoái hóa, tan rã,
không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải
làm xét nghiệm ngay.
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị
dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.
- Nhầm tiêu bản giữa các bệnh
nhân: Cần đối chiếu đúng tên người bệnh trên lam kính.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
Nhầm bệnh nhân khi vào kết quả
xét nghiệm : Kiểm tra kỹ phiếu chỉ định và tiêu bản của bệnh nhân, ghi mô tả/
chẩn đoán trên phiếu chỉ định trước khi vào kết quả trên máy.
Nếu có 2 bệnh nhân trùng tên
toàn bộ, cần đối chiếu thêm thông tin khác (tuổi, địa chỉ, mã y tế).
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh giá
kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
13. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TẾ BÀO TÌM TINH THỂ URAT QUA KÍNH HIỂN
VI PHÂN CỰC
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học tìm tinh thể urat qua kính hiển vi phân cực
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Xét nghiệm dịch khớp, quan sát
phát hiện tinh thể urat giúp bác sĩ chẩn đoán chính xác bệnh Gout. Xét nghiệm
này giúp đánh giá tổn thương các khớp, từ đó xác định mức độ viêm và có biện
pháp xử lý kịp thời.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
- Găng tay vô trùng, khẩu
trang.
- Pipet nhựa
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.
- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh
phẩm.
- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh,
vị trí chọc hút.
- Các dụng cụ để nhuộm: khay,
giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.
- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và
tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người
thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.
- Dung dịch cố định phù hợp
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ (Giemsa/Diff – Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl -
Neelsen…).
- Các dung dịch sát khuẩn.
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên lam kính.
2.3. Trang thiết bị
- Bàn sấy tiêu bản;
- Kính hiển vi quang học (có gắn
camera chụp ảnh vi thể);
- Máy tính, máy in; đầu quét mã
vạch;
- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ
sơ;
- Thùng rác đựng rác thải y tế
và rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được
thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu
bệnh.
Yêu cầu: dịch hút ra được dàn
lên lam kính, để khô tự nhiên, sau đó cố định
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh
phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 30 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Bước 1: Cố định phiến đồ:
- Cố định bằng dung dịch phù hợp
lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (tuỳ phương pháp
nhuộm).
Bước 2: Nhuộm các phiến đồ
- Theo một trong các phương
pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl
– Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học).
4.2. Nhận định kết quả
- Phiến đồ sau khi nhuộm màu
xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng
và chẩn đoán cho người bệnh.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định tại co sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Phiến đồ bị mất tế bào vào
trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Tế bào thoái hóa, tan rã,
không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải
làm xét nghiệm ngay hoặc phải tiền cố định.
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị
dập nát: cần dàn đúng kỹ thuật.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
PHẦN II. CÁC QUY TRÌNH NHUỘM MÔ BỆNH HỌC – TẾ BÀO
28. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐỎ CONGO
KIỀM (THEO PUCHTLER 1962)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm đỏ
Congo kiềm (theo Puchtler 1962)
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đỏ Congo là phẩm nhuộm acid
nhóm diazo, gồm hai nửa giống nhau, trong đó, mỗi nửa có vòng phenol gắn với
nhóm phân tử naphtalen nhờ nhóm diazo. Hai nhómphenyl gắn với nhau bằng liên kết
diphenyl. Tuy nhiên, việc nhuộm chất dạng tinh bột (amyloid) bằng đỏ Congo là
nhờ liên kết hydrogen khác với liên kết hóa điện tử được tạo ra giữa phẩm nhuộm
và hầu hết các thành phần mô được nhuộm. Trong dung dịch nước, đỏ Congo nhuộm
nhiều thành phần mô khác nhau, mặc dù ái lực với chất dạng tinh bột lớn hơn đối
với thành phần khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
Vật tư, hóa chất dùng cho
nhuộm tự động
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính có chất chống bong
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm đỏ Congo
Vật tư, hóa chất dùng cho
nhuộm tay
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính sạch
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
- Dung dịch A lưu trữ: Chlorit
sodium bão hòa trong 80% etanol.
- Dung dịch B lưu trữ: đỏ Congo
bão hòa trong 80% etanol được bão hòa bằng chlorit sodium.
- 1% dung dịch nước hydroxit
sodium. Dung dịch làm việc
- 100 ml dung dịch A lưu trữ
thêm 1 ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.
- 100ml dung dịch B lưu trữ
thêm 1ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Kính hiển vi quang học
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Nhuộm máy:
- Bước 1: Tiêu bản sau
khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy
trình nhuộm
- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa
chất cho máy và bộ kit nhuộm
- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa
và dán barcode để máy có thể nhận biết được
- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng
nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động
Nhuộm tay:
- Bước 1: Tẩy parafin mảnh cắt
bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
- Bước 2: Chuyển vào các bể cồn
100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
- Bước 3: Rửa trong nước cất 3
– 5phút
- Bước 4: Nhuộm nhân trong alun
hematoxylin, biệt hóa và làm xanh
- Bước 5: Nhúng trong dung dịch
chlorit sodium kiềm x 20 phút
- Bước 6: Chuyển ngay sang dung
dịch đỏ Congo kiềm x 20 phút
- Bước 7: Đẩy nước bằng cồn 95°
và 100°
- Bước 8: Làm trong bằng 3 bể
toluen sạch
- Bước 9: Gắn lá kính.
Kết quả:
Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích
kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:
+ Chất dạng tinh bột, sợi chun,
hạt bạch cầu ưa toan: đỏ
+ Nhân: xanh
4.2. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ theo
quy định tại cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá.
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
+ Mặc dù dung dịch lưu trữ có
khả năng ổn định khoảng 2 tháng, nhưng để có màu sắc tốt, không nên để lưu dung
dịch làm việc mà chỉ sử dụng trong khoảng 20 phút sau chuẩn bị.
+ Để bão hòa trong 100ml etanol
80%, cần sử dụng 0,2g phẩm đỏ Congo. Lưu giữ dung dịch trong tủ lạnh
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
29. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH
ALCIAN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm xanh Alcian
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đây là kỹ thuật nhuộm xác định các
loại chất nhầy khác nhau (loại acid, trung tính hoặc kiềm, thường được áp dụng
cho các tổn thương đường tiêu hóa). Nguyên lý dựa vào tính chất thuốc nhuộm
cation và hình thành các liên kết với các anion nhất định trong mô mang nhóm
carboxyl hoặc nhóm sunfat, tạo nên các liên kết tĩnh điện cationanion. Gốc
photphat của acid nhân không sẵn sàng liên kết với thuốc nhuộm xanh alcian. Có
thể nhuộm xanh alcian ở các độ pH khác nhau để phân biệt các chất nhầy acid.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
Vật tư, hóa chất nhuộm tự động:
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính có chất chống bông
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm đỏ xanh Alcian
Vật tư, hóa chất nhuộm tay:
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính sạch
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
- Pha dung dịch xanh alcian 1%
trong acid acetic 3% (pH 2,5)
+ Xanh alcian 1g
+ Acid acetic 3% 100ml
Hòa tan xanh alcian trong acid
acetic. Lọc trước khi sử dụng.
- Pha dung dịch xanh alcian 1%
trong acid hydrochloric 0,1M (pH 1,0)
+ Xanh alcian 1g
+ Acid hydrochloric 0,1M 100ml
Hòa tan xanh alcian trong acid
hydrochloric. Lọc trước khi sử dụng.
- Pha dung dịch natri carbonat
0,3%
+ Natri cacbonat 0,3 g
+ Nước cất 100ml
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Kính hiển vi quang học
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy nhuộm đặc biệt
- Máy đo pH
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Nhuộm máy:
- Bước 1: Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa
chất cho máy và bộ kit nhuộm
- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa
và dán barcode để máy có thể nhận biết được
- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng
nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động
Nhuộm tay:
- Bước 1: Tẩy nến trong toluen
3 lần, mỗi lần 2 phút
- Bước 2: Chuyển vào bể cồn
100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
- Bước 3: Rửa nước chảy 5 phút
- Bước 4: Đặt trong dung dịch
acid acetic 3% trong 2 phút
- Bước 5: Nhuộm trong dung dịch
xanh alcian 1%: 30 phút
- Bước 6: Rửa nước chảy 5 phút
- Bước 7: Để trong dung dịch
natri carbonat 0,3% trong 30 phút
- Bước 8: Rửa nước chảy 5 phút
- Bước 9: Nhuộm nhân trong
Hematoxylin Mayer: 7 phút
- Bước 10: Rửa nước chảy 5 phút
- Bước 11: Loại nước bằng cồn
80°, 95°, 100°.
- Bước 12: Làm trong qua 3 bể
toluen.
- Bước 13: Gắn lá kính
Kết quả nhuộm:
Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích
kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học: Chất nhầy acid: màu xanh ngọc
Nhân tế bào: màu xanh nhạt
4.2. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ theo
quy định tại cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Mảnh cắt bị bong, gấp quá nhiều:
+ Có thể do cố định bệnh phẩm
không tốt: không khắc phục được hoặc phải lấy bệnh phẩm mới và làm lại kỹ thuật.
+ Do cắt dày hoặc dán mảnh cắt
không tốt: cắt và dán lại mảnh cắt, nhuộm lại.
+ Mảnh cắt bị rách, nhăn hoặc
giãn quá mức: do cắt bị vấp hoặc do dàn mảnh cắt quá mức hoặc bàn hơ quá nóng.
Cần điều chỉnh nhiệt độ và cắt nhuộm lại nếu cần.
- Nhân tế bào và chất nhày bắt
màu yếu: tăng thời gian nhuộm.
- Nhiều bọt khí, hơi nước trong
tiêu bản:gắn lá kính thật nhanh, ngay khi nhấc qua bể toluen, thực hiện kỹ thuật
trong phòng khô (có điều hòa, máy hút ẩm, đặc biệt vào những khi thời tiết có độ
ảm cao).
- Mảnh cắt bị khô, bay mất thuốc
nhuộm, không đánh giá được: cần phủ kín mảnh cắt bằng lá kính, gắn đủ bôm hoặc
chất gắn lá kính.
- Chất nhầy acid không bắt màu:
kiểm tra lại để đánh giá chính xác độ pH của thuốc nhuộm.
- Tùy thuộc chất nhày acid loại
nào sẽ bắt màu ở các độ pH 1 hay 2,5, nên phải đánh giá sự bắt màu chất nhày
theo loại mô được nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
30. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 3 MÀU CỦA
MASSON (1929)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm nhuộm ba màu theo Masson (1929)
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật nhuộm Masson được sử dụng
để nhuộm mô liên kết, nơi nó cho phép phân biệt giữa các thành phần của mô như
collagen, cái sợi cơ, và các thành phần khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
Vật tư, hóa chất nhuộm tự động
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính có chất chống bong
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm 3 màu Masson
- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
- Keo gắn
Vật tư, hóa chất nhuộm tay:
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính sạch
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
- Cồn – acid 1%
- Hematoxylin
- Ione, sodium thiosulfat.
a. Dung dịch A
Acid fuchsin 0,5g
Acid acetic (rất lạnh) 0,5ml
Nước cất 100ml
b. Dung dịch B
Acid Photphomolybdic 1,0g
Nước cất 100ml
c. Dung dịch C
Xanh metyl 2,0g
Acid acetic rất lạnh 2,5ml
Nước cất 100ml
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Kính hiển vi quang học
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Nhuộm tự động:
- Bước 1: Tiêu bản sau
khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy
trình nhuộm
- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa
chất cho máy và bộ kit nhuộm
- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa
và dán barcode để máy có thể nhận biết được
- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng
nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động
Nhuộm tay:
- Bước 1: Tẩy parafin bằng
3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.
- Bước 2: Chuyển vào các bể cồn
100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.
- Bước 3: Rửa Bước trong nước cất
3 - 5 phút
- Bước 4: Loại bỏ vết thủy ngân
(nếu có) trong mảnh cắt bằng iodine, sau đó bằng sodium thiosunfat.
- Bước 5: Rửa dưới vòi nước chảy.
- Bước 6: Nhuộm nhân bằng
hematoxylin.
- Bước 7: Biệt hoá bằng cồn -
acid 1%.
- Bước 8: Rửa kỹ dưới vòi nước
chảy.
- Bước 9: Nhuộm bằng dung dịch
A (acid fuchsin) x 5 phút.
- Bước 10: Rửa bằng nước cất.
- Bước 11: Xử lý bằng dung dịch
B (acid photphomolybdic) x 5 phút.
- Bước 12: Làm ráo nước.
- Bước 13: Nhuộm bằng dung dịch
C (xanh metyl) x 2-5 phút.
- Bước 14: Rửa bằng nước cất.
- Bước 15: Xử lý bằng acid
acetic 1% x 2 phút.
- Bước 16: Đẩy nước bằng cồn
95° và 100°
- Bước 17: Làm trong tiêu bản bằng
3 bể toluen sạch
- Bước 18: Gắn lá kính
Kết quả:
Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích
kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:
- Nhân: Xanh da trời- đen
- Bào tương, sợi cơ và hồng cầu:
Đỏ
- Sợi tạo keo: Xanh da trời
4.2. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ bằng
theo quy định tại cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
+ Khả năng bắt màu phẩm nhuộm tốt
trong trường hợp mảnh cắt mô được cố định trong clorua thủy ngân hoặc trong acid
picric.
+ Nếu mảnh cắt mô được cố định
trong dung dịch formol trung tính, dung dịch Bouin, có khả năng nhuộm màu do hoạt
động như chất gắn màu.
+ Nếu mảnh cắt bắt màu quá đỏ,
cần biệt hóa trong dung dịch acid acetic 1% được hòa lẫn với 0,7g acid photphotungstic
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection & Transport
guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
31. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY –
GRUNWALD – GIEMSA CHO TUỶ XƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm May – Grunwald – Giemsa cho tủy
xương
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đây là sự kết hợp giữa hai
phương pháp nhuộm Giemsa và May-Grünwald. Hỗn hợp thuốc nhuộm Giemsa và
May-Grünwald là sự kết hợp của hỗn hợp có tính acid và kiềm của eosin lẫn xanh
metylen. Độ pH là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng phiến đồ, bất kỳ
sự thay đổi pH nào đều có thể dẫn đến tính chất bắt màu của các tế bào bị sai lệch,
do đó, độ pH thích hợp được khuyến cáo là từ 6,5 - 6,8.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
Vật tư, hóa chất nhuộm tự động
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính có chất chống bong
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm May – Grunwald –
Giemsa
- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
Vật tư, hóa chất nhuộm tay
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính sạch.
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°
- Xylen hoặc Toluen
- Dung dịch May-Grünwald mẹ (giữ
được 2 tuần):
+ Eosin - xanh metylen 1g
+ Cồn tuyệt đối (metanol) 100ml
- Dung dịch khi nhuộm:
+ May - Grünwald mẹ: 40ml
+ Cồn metanol tuyệt đối: 20ml
- Pha dung dịch Giemsa:
+ Giemsa mẹ: 10ml
+ Nước cất: 90ml
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Kính hiển vi quang học
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy nhuộm đặc biệt
- Máy đo pH
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Nhuộm tự động:
- Bước 1: Tiêu bản
sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành
quy trình nhuộm
- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa
chất cho máy và bộ kit nhuộm
- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa
và dán barcode để máy có thể nhận biết được
- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng
nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động
Nhuộm tay:
- Bước 1: Tiêu bản tẩy paraffin
bằng xylen và cồn
- Bước 2: Rửa nước
- Bước 3: Dung dịch May -
Grünwald: 5 phút
- Bước 4 Nước chảy: 1 phút
- Bước 5: Dung dịch Giemsa: 10
-20 phút
- Bước 6: Để khô tự nhiên
- Bước 7: Gắn bôm
Kết quả:
Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích
kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:
- Các thành phần có tính acid của
tế bào bắt màu xanh (xanh metylen).
- Các thành phần kiềm của tế
bào bắt màu đỏ da cam.
- Hồng cầu: màu hồng tím đến
trung bình, không có màu xám hoặc màu xanh.
- Bạch cầu đa nhân trung tính
màu xanh đậm, nhân tím hay đỏ tím hoa cà, bào tương màu hồng nhạt.
- Bạch cầu ái toan: màu xanh đến
màu xanh đậm với nhân màu tím, bào tương màu xanh
- Bạch cầu ái kiềm: có thể bắt
màu tím đến xanh đậm, nhân màu đen.
- Lymphô bào và bạch cầu đơn
nhân: màu tím đậm, bào tương màu xanh da trời.
- Tiểu cầu: màu tím.
- Các tế bào biểu mô: nhân màu
xanh, bào tương hồng hay phớt hồng.
- Các vi khuẩn: màu xanh.
4.2. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định tại cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
- Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
- Tuân thủ đúng độ pH của phẩm
nhuộm từ 6,5 - 6,8. Nếu độ pH kiềm quá hay acid quá đều gây sai lạc tính chất bắt
màu của các tế bào. Bởi vậy, cần kiểm tra độ pH trước khi nhuộm. Nếu độ pH thấp,
cần điều chỉnh bằng dung dịch đệm có pH 7,2.
- Cần tuân thủ thời gian nhuộm,
nếu thời gian nhuộm ngắn hoặc quá dài đều ảnh hưởng đến chất lượng chẩn đoán. Nếu
sử dụng Giemsa R (nhanh), thời gian nhuộm khoảng 10 phút.
- Phiến đồ nếu dàn không đều sẽ
làm ảnh hưởng đến kết quả nhuộm ở những vùng tế bào chồng chất nhau, do vậy,
phiến đồ cần dàn mỏng, đều trước khi nhuộm.
- Cồn dùng để vệ sinh tay có thể
gây tan hồng cầu.
- Không để phiến đồ bị khô ở bất
kỳ bước nhuộm nào.
- Rửa phiến đồ không đúng cách
sẽ gây ra các dấu hiệu giả (artifacts), do đó cần rửa phiến đồ dưới vòi nước chảy.
- Độ pH của nước rửa có thể ảnh
hưởng mạnh tới tính chất bắt màu của các tế bào. Nếu độ pH kiềm quá, sẽ làm
tăng màu xanh và nếu độ pH acid, sẽ làm tăng màu hồng đỏ của các tế bào khi nhuộm.
- Phẩm nhuộm May-Grünwald -
Giemsa rất dễ cháy và độc với da, đường hô hấp, đường tiêu hóa (nếu chẳng may
nuốt phải). Bởi vậy, phải đóng kín miệng lọ phẩm nhuộm, tránh xa lửa, không hút
thuốc trong khi nhuộm. Khi tiến hành nhuộm, cần có khẩu trang, găng tay bảo hộ.
Nếu chẳng may khi tiếp xúc, cảm thấy nguy hiểm cần khám và tư vấn bác sĩ.
- Không sử dụng phẩm nhuộm khi
đã hết hạn sử dụng, do vậy, cần kiểm tra hạn dùng của phẩm nhuộm trước khi tiến
hành nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
32. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOUDAN III
HOẶC IV
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm Soudan III hoặc IV trong dung dịch
Ethanol
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nhận dạng các lipid kỵ nước ở
trạng thái lỏng theo cơ chế vật lý vật chuyển một thể có màu (lysochrom) từ
dung môi hoà tan (cồn, diacetin, propylen, ethylen glycol,v.v…) vào trong lipid
ở trạng thái lỏng
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ : 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lam kính sạch
- Lamen
- Giấy thấm, gạc sạch
- Bút chì để ghi tên tuổi bệnh
nhân
- Chổi lông mềm
- Phẩm nhuộm Soudan III hoặc IV
trong Ethanol
Soudan III hoặc IV: 1g
Etanol 70%: 50ml
Aceton: 50ml
Bảo quản trong lọ nút kín, lọc
trước khi sử dụng
- Gel cắt lạnh
- Cồn tuyệt đối
- Gắn lá kính: Glycerogel hoặc
siro Apathy
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lạnh ở trạng thái sẵn
sàng hoạt động
- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi
cơ thể phải gửi ngay đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)
- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi
thông tin.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn Phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Bước 1: Làm lạnh mẫu bệnh phẩm
và cắt mảnh
- Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc
lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của
máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.
- Mẫu mô sau khi đông cứng được
cắt lát mỏng dày 10-15µm
- Cố định mảnh mô (để giữ
nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm): cố định bằng cồn tuyệt đối
Bước 2: Tiến hành nhuộm
- Mảnh cắt rửa trong nước cất
- Ngâm mảnh cắt vào ethanol 70%
vài giây.
- Ngâm vào trong dung dịch bão
hoà Soudan trong cồn 70% trong 5 phút (có thể dùng dung dịch Herxheimer).
- Ngâm nhiều lần trong ethanol
70% cho đến khi không còn vết của phẩm nhuộm thôi ra nữa.
- Rửa nước cất.
- Nhuộm nhân bằng Hemalun hoặc
xanh lơ toluidin 0,5%.
- Rửa nước cất.
- Gắn glyxerogel hoặc sirô
Apathy
4.4. Diễn giải và báo cáo
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.2. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ bằng
File mềm và sổ sách tại Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh thực hiện
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Mảnh cắt bị co lại:
nhiệt độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành
nhanh
- Thời gian nhuộm điều chỉnh
sao cho phù hợp
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
33. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM OIL RED O
TRONG DUNG DỊCH ETHANOL
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Oil red O để phát hiện chất
béo.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Oil red O là một thuốc nhuộm
nhóm Diazo có khả năng hoà tan cao trong chất béo. Oil red O được hoà tan trong
dung dịch cồn khi tiếp xúc với mô giàu chất béo, thuốc nhuộm này rời khỏi dung
môi và di chuyển đến mô mỡ. Kỹ thuật nhuộm này thực hiện trên bệnh phẩm tươi do
chất béo sẽ bị mất đi trong quá trình xử lý mô thông thường. Kỹ thuật nhuộm Oil
red O cho phép nhuộm cả nhân của tế bào tổn thương, nên rất có lợi cho việc nhận
định cấu trúc mô học.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen, lam kính
- Giấy thấm, gạc sạch
- Bút chì để ghi tên tuổi bệnh
nhân
- Chổi lông mềm
2.2.2 Hóa chất
- Dung dịch Oil red O
-Isopropyl.
Oil red O: 0.5g
Cồn isopropyl tuyệt đối 100ml
Để dung dịch này qua đêm
- Dung dịch Dextrin
Dextrin: 1g
Nước cất: 100ml
- Hóa chất nhuộm:
Dung dịch Oil red O -Isopropyl:
60ml
Dextrin: 40ml
- Dung dịch gắn Lamen thích hợp.
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lạnh
- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
- Các bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi
cơ thể phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)
- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi
thông tin.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 1,5 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1 Các bước thực hiện
4.1.1 Phẫu tích bệnh phẩm
- Bác sĩ quan sát, mô tả
một số đặc điểm của bệnh phẩm (số lượng, kích thước, tính chất...), xác định
vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.
4.1.2 Làm lạnh mẫu bệnh phẩm
và cắt mảnh
- Đặt mẫu bệnh phẩm vào giá đúc
lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của
máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.
- Mẫu mô sau khi đông cứng được
lấy mặt phẳng bởi các lát cắt 10-15µm, sau đó điều chỉnh độ dày về 2-5micromet.
- Kết hợp với chổi lông mềm dàn
mảnh mô lên phiến kính.
- Cố định mảnh mô: để khô ở nhiệt
độ phòng
4.1.3 Nhuộm mảnh cắt
- Đặt các mảnh cắt lạnh trực tiếp
vào dung dịch Oil red O -Isopropyl trong 20 phút.
- Rửa tiêu bản trong nước chảy.
- Nhuộm đối màu bằng Gill II
Hematoxylin x 30 giây
- Rửa tiêu bản trong nước chảy
- Gắn lamen bằng dung dịch gắn.
Kết quả:
+ Chất béo: đỏ
+ Nhân: xanh
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ theo quy
định tại cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Mảnh cắt bị co lại:
nhiệt độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành
nhanh
- Màu sắc nhân và chất béo quá
đậm hoặc quá nhạt: Điều chỉnh thời gian nhuộm sao cho phù hợp.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
34. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐEN SOUDAN
B TRONG DIACETIN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm đen Soudan B trong Diacetin
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nhận dạng các lipid kỵ nước ở
trạng thái lỏng theo cơ chế vật lý vật chuyển một thể có màu (lysochrom) từ
dung môi hoà tan (cồn, diacetin, propylen, etylen glycol, v.v…) vào trong lipid
ở trạng thái lỏng
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Chổi lông mềm
- Lam kính sạch, lamen
- Bút chì (để ghi tên tuổi bệnh
nhân)
- Giấy thấm, gạc sạch
- Gel cắt lạnh
- Găng tay, khẩu trang, mũ
2.2.2 Hóa chất
- Cồn tuyệt đối
- Phẩm nhuộm Đen Soudan B trong
diacetin, Kernechtrol
- Dung dịch gắn lamen.
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lạnh.
- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
- Các bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi
cơ thể phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)
- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi
thông tin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1 Các bước thực hiện
4.1.1 Phẫu tích bệnh phẩm
- Bác sĩ quan sát, mô tả
một số đặc điểm của bệnh phẩm (số lượng, kích thước, tính chất...), xác định
vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.
4.1.2 Làm lạnh mẫu bệnh phẩm
và cắt mảnh
- Đặt mẫu bệnh phẩm vào giá đúc
lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của
máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.
- Mẫu mô sau khi đông cứng được
lấy mặt phẳng bởi các lát cắt 10-15µm, sau đó điều chỉnh độ dày về 2-5micromet.
- Kết hợp với chổi lông mềm dàn
mảnh mô lên phiến kính.
- Cố định mảnh mô: để khô ở nhiệt
độ phòng
4.1.3 Nhuộm mảnh cắt
- Chuyển các mảnh cắt lạnh vào
dung dịch nước 50% diacetin, trong 30 giây và lắc đều.
- Nhuộm trong dung dịch Đen
Soudan B vừa mới lọc trong một giờ.
- Biệt hoá nhanh (30 giây)
trong dung dịch nước 50% diacetin.
- Rửa nước cất.
- Nhuộm nhân bằng Kernechtrol.
- Rửa nước cất.
- Gắn trong glycerogel hoặc
sirô Apathy.
Kết quả:
+ Lipid ở trạng thái lỏng
(triglycerit không bão hoà, cholesterit không bão hoà, acid béo không bão hoà,
glycolipid và photpholipid) bắt màu đen.
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: Lipid ở trạng thái lỏng (triglycerit không bão
hoà, cholesterit không bão hoà, acid béo không bão hoà, glycolipid và
photpholipid) bắt màu đen.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định tại cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
- Mảnh cắt bị co lại: nhiệt
độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành nhanh
- Thời gian nhuộm điều chỉnh
sao cho phù hợp
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
35. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GROCOTT
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Grocott
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng để phát hiện
nấm, pneumocystis carinii dựa theo nguyên lý kỹ thuật Gomori trong bạc –
methenamine. Nguyên lý chung của phản ứng gần giống với nguyên lý trong phản ứng
PAS: nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc permanganate sẽ tạo
ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng
thủy phân phức chất bạc - methenamine.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2 Hóa chất
* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ
công:
- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay
toluen…)
- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)
- Dung dịch acid chromic 5%
- Dung dịch bisunfit Na 1%
- Dung dịch bạc – methenamin
- Dung dịch chlorua vàng
- Dung dịch hyposunfit Na 2%
- Dung dịch Vert lumière
- Dung dịch bạc – methenamin
- Keo gắn lamen
* Hoá chất dùng cho nhuộm máy
- Bộ kít nhuộm Grocott dành cho
máy nhuộm tự động
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ an toàn sinh học.
- Máy nhuộm đặc biệt tự động
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được vùi trong
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày
giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố
định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công
+ Các mảnh cắt được tẩy parafin
qua 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút
+ Rửa trong nước cất 3 - 5 phút
+ Oxy hóa trong dung dịch acid
chromic 5% trong 1giờ
+ Rửa nước chảy 2 - 3 phút
+ Rửa trong dung dịch bisunfit
Na 1% trong 1phút
+ Rửa qua nước chảy: 5 - 10
phút
+ Rửa trong 3 - 4 bể nước cất:
mỗi bể 5 lần nhúng
+ Ngâm trong dung dịch bạc -
methenamin ở nhiệt độ 58º khoảng 30 - 60 phút cho đến khi mảnh cắt có màu vàng
nâu
+ Lấy mảnh cắt ra, ngâm trong
nước cất. Kiểm tra màu sắc dưới kính hiển vi.
+ Rửa trong 6 bể nước liên tiếp,
mỗi bể 5 lần nhúng.
+ Thúc trong dung dịch chlorua
vàng trong 2 - 5 phút
+ Rửa trong nước cất
+ Loại bỏ bạc thừa bằng dung dịch
hyposunfit Na 2% trong 2 - 5 phút
+ Rửa nước thật kỹ
+ Nhuộm nền bằng xanh lá cây
sáng: 30 - 50 giây
+ Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
+ Gắn lamen bằng chất gắn
* Đối với quy trình nhuộm máy tự
động
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm ( nếu sử dụng máy nhuộm tự động)
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
Kết quả:
Bác sĩ giải phẫu bệnh đánh giá
kết quả trên kính hiển vi quang học:
+ Nấm: màu nâu đen - đen
+ Chất nền: xanh nhạt
+ Chất nhầy: màu ghi đậm.
4.2. Nhận định kết quả.
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Khi nhuộm, cần có mảnh cắt chứng
đã có thành phần nấm dương tính với phẩm nhuộm này. Nếu mảnh cắt âm tính giả,
nên kiểm tra hạn dùng của dung dịch bạc – methenamin để thay dung dịch mới hoặc
để thời gian nhuộm lâu hơn.
+ Trong bước 9 của quy trình
nhuộm, dung dịch methenamin được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng và cần hâm
nóng đến 58°C bằng cách nhanh nhất, mảnh cắt sẽ được tráng màu nâu vàng bằng
dung dịch bạc - methenamin và được kiểm tra mức độ bắt màu.
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá.
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
36. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH PHỔ
PERL PHÁT HIỆN ION SẮT
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Xanh Perl
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phản ứng Perl là một trong phản
ứng hóa mô kinh điển đầu tiên. Mảnh mô được xử lý bằng dung dịch acid
ferrocyanit sẽ bộc lộ ion sắt dưới dạng hydroxide [Fe(OH)3] bằng cách hòa tan
acid hydrochloric. Sau đó, ion sắt phản ứng với dung dịch ferrocyanide kali để
tạo ra phức màu xanh không hòa tan là ferrocyanide sắt (màu xanh phổ)
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2. Hóa chất
* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ
công:
- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay
toluen…)
- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)
- 1% dung dịch nước ferrocyanid
kali
- 2% dung dịch nước acid
hydrochloric
- dung dịch (fast red) 0,1%.
- Nước cất
- Keo gắn lamen
* Hoá chất dùng cho nhuộm máy
- Bộ kít nhuộm Grocott dành cho
máy nhuộm tự động
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ an toàn sinh học.
- Máy nhuộm đặc biệt tự động
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Tiến hành kỹ thuật
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công
+ Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể
toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút
+ Rửa trong nước cất 3 - 5 phút
+ Xử lý mảnh cắt bằng dung dịch
acid ferrocyanid mới pha x 30 phút
+ Rửa kỹ trong nước cất
+ Nhuộm nhạt nhân bằng dung dịch
đỏ trung tính 0,5% hoặc đỏ nhanh (fast red) 0,1%.
+ Rửa nhanh trong nước cất.
+ Đẩy nước bằng cồn 95° và
100°.
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch,
Gắn lamen
* Đối với quy trình nhuộm máy tự
động
+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho
máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Ion sắt: xanh
+ Nhân: đỏ
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Nên chuẩn bị dung dịch
nhuộm ngay trước khi sử dụng do dung dịch acid hydrochloric mới pha sẽ có tác dụng
hiệu quả hơn để tách liên kết protein với ion sắt, đồng thời, nên có mảnh cắt
chứng nhuộm với nước.
+ Trong bước 7, nếu sử dụng vòi
nước chảy để rửa sẽ làm cho nền tiêu bản có màu đỏ và sẽ mất độ tương phản của
nhân tế bào.
Bước 9 có tác dụng biệt hóa màu
đỏ khi khử nước.
+ Nên tránh các chất cố định có
acid hoặc dichromate hoặc các dung dịch acid dùng để khử calci. Các chất phản ứng
như vậy có thể làm mất khả năng thủy phân ion sắt của mô, tạo ra kết quả âm
tính giả.
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
37. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC
WARTHIN – STARY PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm bạc Warthin - Stary
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng để phát hiện
xoắn khuẩn và Helicobacter pylori cùng một số loại vi khuẩn khác. Cơ sở của kỹ
thuật là dựa vào khả năng của một số vi khuẩn có thể gắn với ion bạc có trong
dung dịch. Sau bước gắn ion bạc, mảnh mô được tiếp xúc với chất khử
hydroquinon, nhờ đó, các ion bạc đã gắn với mô và vi khuẩn có thể chuyển ngược
trở thành bạc kim loại nhìn thấy được. Trước khi nhuộm, mảnh mô được xử lý làm
tăng tính mẫn cảm với phức hợp bạc. Dung dịch nước của bạc nitrat có gia thêm
chất khử hydroquinon để giúp tạo ra phức hợp diamin bạc.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2. Hóa chất
* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ
công :
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hay
toluen…)
- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)
- Dung dịch acid acetic 1,2%
- Dung dịch bạc nitrat 6%
* Hoá chất dùng nhuộm máy:
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen..)
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm - Bộ kít nhuộm
Warthin - Stary
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ an toàn sinh học.
- Máy nhuộm đặc biệt tự động
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công:
+ Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể
toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút
+ Rửa nước
+ Nhấn chìm mảnh cắt trong bể
nước đã làm mất ion (bể đựng nước này phải rửa sạch).
+ Ủ trong bạc nitrat 1% (AgNO3)
x 30 – 60 phút ở nhiệt độ 45 - 60°C.
+ Chuẩn bị thuốc hiện hình
(developer).
+ Ủ trong thuốc hiện hình 1
phút ở 56°C.
+ Soi kiểm tra sự bắt màu trên
kính hiển vi.
+ Rửa dưới vòi nước ấm để ngừng
phản ứng.
+ Rửa bằng nước cất nóng ở
56°C.
+ Rửa bằng nước cất lạnh.
+ Ủ trong sodium thiosunfat 2 –
5% x 1 phút.
+ Rửa bằng nước cất.
+ Làm mất nước nhanh bằng cồn
95º và cồn tuyệt đối
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
,gắn lamen bằng bôm Canada
* Đối với quy trình nhuộm máy
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Vi khuẩn: đen
+ Mô nền: vàng tươi
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Cần thay đổi thời gian
tráng khác nhau tùy mảnh cắt để có thể đạt kết quả tối đa.
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical
Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
38. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT CAO
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Diamine sắt cao
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật diamin sắt cao được
coi là kỹ thuật chuẩn để phát hiện các chất nhày có nhóm sunfat. Nguyên lý của
phương pháp: một hỗn hợp các muối diamin được oxy hoá bằng clorua sắt hình
thành một chất màu đen, liên kết với các nhóm sunfat este. Bằng cách nhuộm
tương phản với xanh alcian (mà chỉ nhuộm các chất nhày carboxyl hoá), đã phân
biệt được rõ về màu sắc giữa 2 nhóm chính của chất nhày acid. Một điều đáng chú
ý, đó là các chất nhày sunfat của các tuyến phế quản dường như không phản ứng với
hỗn hợp diamin clorua sắt..
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y : 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2 Hóa chất
* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ
công :
- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay
toluen…)
- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)
- Sodium photphat monobasic
- Sodium photphat dibasic
(khan: anhydrous)
- Xanh alcian
- Acid acetic
- Đỏ trung tính.
- N,N - dimethyl - meta -
phenylenediamin - dihydrochlorit.
- N,N - dimethyl - para -
phenylenediamine- dihydrochlorit.
- Clorua sắt
- Nước cất 2 lần.
* Hoá chất dùng để nhuộm
máy
- Bộ kít nhuộm Diamine sắt cao
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- KHV quang học
- Bể nhuộm, giá nhuộm
- Máy hút ẩm
- Tủ an toàn sinh học.
- Máy nhuộm đặc biệt tự động
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt
ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công
- Để khô mảnh cắt ở tủ 37°C, 12
giờ trước khi nhuộm.
- Các mảnh cắt làm chứng và các
mảnh cắt cần nhuộm được tẩy parafin, qua cồn, rửa nước và rửa nước cất.
- Nhúng các mảnh cắt trong dung
dịch diamin 18-24 giờ.
- Rửa kỹ trong nước chảy.
- Nhuộm tương phản (nếu cần thiết)
bằng xanh alcian 1% trong acid acetic 3% trong 5 phút.
- Nhuộm nhân bằng đỏ trung tính
0,5% trong 2-3 phút.
- Rửa qua nước.
- Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối.
- Làm trong bằng xylen và gắn
lamen bằng bôm Canada.
* Đối với quy trình nhuộm máy
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
- Sulfat mucin : đen-nâu
- Carboxylate mucin : xanh
- Nhân : đỏ.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh giá
kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
39. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI CHO
SỢI VÕNG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Gomori cho sợi võng
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dựa vào tính ưa bạc của sợi
võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi
đặc biệt này. Hai phương pháp nhuộm sợi võng thông dụng nhất là Gomori và
Gordon – Sweet. Bước đầu tiên của quy trình là thực hiện oxy hóa chất đường
hexose có trong sợi võng để tạo ra aldehit. Bước tiếp theo làm “tăng độ nhạy”
do lắng đọng thành phần kim loại (ammonium sunfat) quanh sợi võng. Hiện tượng tẩm/ngấm
bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc ammoniac bị oxy hóa tạo ra
aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt được chuyển vào trong
formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng, kim loại vàng có trong
clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc nét” sợi võng, làm
chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y : 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2 Hóa chất
* Hoá chất dùng cho nhuộm
thủ công:
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen…)
- Cồn 70°, 80°, 95°, cồn tuyệt
đối
- Formalin 4%
- Dung dịch permanganat kali 1%
- Dung dịch metabisunfat kali
2%
- Dung dịch phèn sắt (iron
alum) 2%
- Dung dịch bạc
- Dung dịch clorua vàng 0,2%
- Dung dịch metabisunfat kali
2%
- Dung dịch sodium thiosunfat
2%
- Phẩm nhuộm van Gieson hoặc
eosin
* Hoá chất dùng cho nhuộm máy:
- Bộ kít nhuộm Gomori
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Khay, giá, cốc đựng phẩm nhuộm
- Máy nhuộm đặc biệt.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt
ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công:
+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng
3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút.
+ Rửa trong nước cất 3 – 5
phút.
+ Xử lý bằng dung dịch
permanganat kali 1% x 2 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Làm trắng trong dung dịch
metabisunfat kali 2% .
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Xử lý bằng dung dịch phèn sắt
(iron alum) 2% x 2 phút.
+ Rửa vài lần bằng nước cất.
+ Đặt mảnh cắt vào trong bình
Coplin đựng dung dịch bạc x 1 phút.
+ Rửa vài lần bằng nước cất.
+ Khử bằng dung dịch nước
formalin 4% x 3 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Làm sắc nét bằng dung dịch
clorua vàng 0,2% x 10 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Xử lý bằng dung dịch
metabisunfat kali 2% x 1 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Xử lý bằng dung dịch sodium
thiosunfat 2% x 1 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy.
+ Nhuộm đối màu bằng van Gieson
hoặc eosin.
+ Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
+ Gắn lamen
* Đối với quy trình nhuộm máy
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: Sợi võng: đen xám nhạt
Nhân: xanh đen
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical
Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
40. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN CẢI
BIÊN THEO SHIKATA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN HbsAg
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Orcein cải biên theo Shikata
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kháng nguyên virus viêm gan B gồm
2 thành phần là kháng nguyên lõi (HBcAg) có bản chất DNA và kháng nguyên bề mặt
(HBsAg) có bản chất lipoprotein. Thông thường, orcein sẽ nhuộm cầu nối disunfit
có trong thành phần xistin của HBsAg; nhờ vậy, người ta có thể phát hiện được sự
có mặt của virus trong tế bào gan.
Kỹ thuật orcein cải biên theo Shikata
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn một số kỹ thuật orcein thông thường, đồng thời
giá thành rẻ, dễ thực hiện và lợi thế của kỹ thuật là có thể thực hiện được kể
cả khi mô gan đã được vùi parafin, thậm chí đã lưu trữ rất lâu, mặc dù hiện
nay, cơ chế của hiện tượng nhuộm vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y : 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , pipet 1 lần
- Lam kính
2.2.2 Hóa chất
* Dùng cho quy trình nhuộm
thủ công:
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- Cồn 70°,80°, 95°, tuyệt đối
- Dung dịch nước permanganat
kali 0,5%
- Acid sunfuric đậm đặc
- Orcein
- Cồn etylic 70%
- HCl đậm đặc
- Dung dịch gắn lamen
* Dùng cho quy trình nhuộm máy
:
- Bộ kít nhuộm Orcein theo
Shikata
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Khay, giá, bể đựng phẩm nhuộm
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt
ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công:
+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng
3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút.
+ Rửa nước.
+ Oxy hóa trong dung dịch (A):
5 phút.
+ Rửa nước
+ Làm mất màu trong oxalic acid
2%
+ Rửa bằng nước cất, sau đó rửa
nước chảy 3 phút
+ Nhuộm màu bằng dung dịch
orcein (B): 2 - 4 giờ
+ Rửa nước
+ Biệt hóa trong dung dịch cồn
70% - HCl.
+ Làm mất nước nhanh bằng cồn
95º và cồn tuyệt đối.
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.
+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn.
* Đối với quy trình nhuộm máy
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: Bào tương tế bào gan nhiễm virus viêm gan B: dạng
thủy tinh mờ.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
41. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN
PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN VIÊM GAN B (HbsAg) TRONG MÔ GAN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Orcein.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Thông thường, virus có kích thước
rất nhỏ và chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Virus chỉ được
coi là vật ký sinh khi chúng sinh sản (được nhân lên) trong tế bào vật chủ. Các
tiểu phần virus nằm bên trong tế bào vật chủ được gọi là “thể vùi virus” và có
thể thấy bằng kính hiển vi quang học. HBsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm
gan B) thường xuất hiện dưới dạng thể vùi trong bào tương tế bào gan. Bào tương
của tế bào Küpffer cũng có thể có kháng nguyên này. Phẩm nhuộm orcein và
andehit - fuscin có khả năng nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần cistin
của HBsAg và tạo ra hình ảnh “thủy tinh mờ” của tế bào gan bị nhiễm virus.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý : 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , keo gắn lamen
- Lam kính sạch.
2.2.2 Hóa chất
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- cồn 100°, 95°, 80°, cồn-acid
1%
- permanganat kali
- acid oxalic
- Acid periodic 5%
- phẩm nhuộm orcein
(*) Đối với quy trình nhuộm
máy:
- Bộ kít nhuộm Orcein
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt.
- Khay, giá, bể đựng phẩm nhuộm
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không
có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công :
+ Tẩy parafin bằng 3 bể toluen
(xylen), mỗi bể 2 phút
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút
+ Rửa nước
+ Oxy hóa trong permanganat
kali (5 - 10 phút)
+ Rửa nước
+ Tẩy trắng trong acid oxalic
(nhìn cho tới trắng)
+ Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng
nước cất
+ Acid periodic 5% trong 5 phút
+ Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng
nước cất
+ Nhuộm orcein trong lò vi sóng
ở công suất thấp trong 30 - 45 giây, rồi tiếp tục để như vậy trong 30 phút. Kiểm
tra dưới kính hiển vi, có thể nhuộm lại nếu chưa đủ màu đen.
+ Rửa trong cồn 70°.
+ Biệt hóa trong cồn-acid 1%
cho tới khi không còn phẩm màu chảy ra từ mảnh cắt.
+ Rửa bằng cồn 70°.
+ Làm mất nước nhanh bằng cồn
95º và cồn tuyệt đối
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn
(*) Đối với quy trình nhuộm
máy:
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode
để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả.
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Kháng nguyên HBsAg, sợi chun:
đỏ tía
+ Các protein liên kết với đồng
: đỏ tía sẫm
+ Nền: đỏ tía ánh nâu nhạt
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
42. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MUCICARMIN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Mucicarmin .
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phương pháp nhuộm nhằm phát hiện
chất nhầy từ biểu mô
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý : 01
2.2. Vật tư, hóa chất
2.2.1. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen.
- Lam kính sạch.
2.2.2 Hóa chất
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- cồn 100°, 95°, 80°
- dung dịch mucicarmin
- nước cất
(*) Đối với quy trình nhuộm máy
- Bộ kít nhuộm Murcamine
2.3. Trang thiết bị
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Giá, khay, bể đựng phẩm nhuộm
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
+ Có đầy đủ thông tin về người bệnh
(họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương
pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.
+ Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm,
ngày giờ chuyển phòng xét nghiêm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh
phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật: 2 giờ
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công
+ Loại parafin như thường lệ.
+ Nhuộm mảnh cắt trong dung dịch
mucicarmin pha loãng từ 10-15 phút hay lâu hơn.
+ Rửa nhanh trong nước cất.
+ Loại nước bằng cồn 80°, 95°,
sau đó là cồn tuyệt đối.
+ Làm trong bằng xylen.
+ Gắn lamen bằng bôm Canada.
(*) Đối với quy trình nhuộm
máy:
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: Chất nhầy màu đỏ.
4.3 Trả kết quả và lưu trữ hồ
sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
43. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY –
GRUNWALD – GIEMSA
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện nhuộm May – Grunwald – Giemsa cho tủy xương.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phương pháp nhuộm này áp dụng
cho tất cả các phiến đồ Tế bào học chọc hút kim nhỏ, tế bào bong và phiến đồ
máu. Đây là sự kết hợp giữa hai phương pháp nhuộm Giemsa và May-Grünwald. Hỗn hợp
thuốc nhuộm Giemsa và May-Grünwald là sự kết hợp của hỗn hợp có tính acid và kiềm
của eosin lẫn xanh metylen. Độ pH là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng
phiến đồ, bất kỳ sự thay đổi pH nào đều có thể dẫn đến tính chất bắt màu của
các tế bào bị sai lệch, do đó, độ pH thích hợp được khuyến cáo là từ 6,5 - 6,8.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Găng tay vô trùng, khẩu
trang.
- Ống hút tự động.
- Lọ đựng dịch ly tâm
- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.
- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh,
vị trí chọc hút
2.3. Hoá chất
- Cồn methanol
- Xylen (toluen)
- Dung dịch May – Grunwald
- Dung dịch Giemsa
- Glycerin
- Keo gắn
2.4. Trang thiết bị:
- Máy ly tâm
- Giá để đựng phiến kính đã dàn
bệnh phẩm.
- Các dụng cụ để nhuộm: khay,
giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.
- Kính hiển vi quang học.
- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và
tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người
thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.
- Sổ hoặc máy tính ghi lại
thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.
- Các sọt rác đựng rác thải y tế,
rác thải thường.
- Máy đo pH.
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm từ chọc hút kim nhỏ,
áp lam hoặc tế bào bong, tế bào dịch được phết trên lam kính, cố định đúng cách
và gửi về phòng xét nghiệm.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 45 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản cố định bằng cồn tuyệt
đối, để khô
- Dung dịch May- Grunwald: 3-5
phút
- Rửa nước chảy 1 phút
- Giemsa 10-20 phút
- Rửa nước chảy
- Để khô
4.2. Nhận định kết quả
- Về cơ bản, tính chất bắt màu
của các thành phần tế bào như sau:
+ Các thành phần có tính acid của
tế bào bắt màu xanh (xanh metylen).
+ Các thành phần kiềm của tế
bào bắt màu đỏ da cam.
- Hồng cầu: màu hồng tím đến
trung bình, không có màu xám hoặc màu xanh.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tuân thủ đúng độ pH của phẩm
nhuộm từ 6,5 - 6,8. Nếu độ pH kiềm quá hay acid quá đều gây sai lạc tính chất bắt
màu của các tế bào. Bởi vậy, cần kiểm tra độ pH trước khi nhuộm. Nếu độ pH thấp,
cần điều chỉnh bằng dung dịch đệm có pH 7,2.
- Cần tuân thủ thời gian nhuộm,
nếu thời gian nhuộm ngắn hoặc quá dài đều ảnh hưởng đến chất lượng chẩn đoán…
- Phẩm nhuộm May-Grünwald -
Giemsa rất dễ cháy và độc với da, đường hô hấp, đường tiêu hóa (nếu chẳng may
nuốt phải). Bởi vậy, phải đóng kín miệng lọ phẩm nhuộm, tránh xa lửa, không hút
thuốc trong khi nhuộm. Khi tiến hành nhuộm, cần có khẩu trang, găng tay bảo hộ.
Nếu chẳng may khi tiếp xúc, cảm thấy nguy hiểm cần khám và tư vấn Bác sĩ.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
44. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH
TOLUIDINE
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm xanh Toluidine
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Thuốc nhuộm có ái lực cao với
các thành phần mô có tính acid, do đó nhuộm các mô giàu DNA và RNA, làm nổi bật
các thành phần như hạt tế bào mast, chất nhày và sụn
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Lưỡi dao cắt lát mỏng;
- Lam kính sạch;
- Lamen.
2.3. Hoá chất
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm xanh toluidine
2.4. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm từ chọc hút kim nhỏ,
áp lam hoặc tế bào bong, tế bào dịch được phết trên lam kính, cố định đúng cách
và gửi về phòng xét nghiệm.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Tế bào mast: Đỏ tía;
+ Chất nền: Màu xanh.
4. 3. Trả kết quà và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
45. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH LUXOL/NISEELL
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm xanh Luxol/ Nisell.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Trong chẩn đoán bệnh lý thần
kinh, cả hai kỹ thuật nhuộm Luxol và Nisseel thường được sử dụng kết hợp để
cung cấp một cái nhìn toàn diện về tổn thương thần kinh.
Myelin là lớp vật liệu giàu chất
béo (lipid) và protein bao bọc xung quanh sợi trục của tế bào thần kinh, hoạt động
như một lớp cách điện để bảo vệ và giúp các tín hiệu thần kinh được dẫn truyền
nhanh chóng, hiệu quả. Lớp bảo vệ này được tạo ra bởi các tế bào thần kinh đệm,
như tế bào Schwann và tế bào oligodendrocyte.
Nhuộm xanh Luxol cho thấy thuốc
nhuộm liên kết mạnh với các thành phần mỡ trong myelin, cho phép quan sát rõ
ràng các vùng mất myelin dưới kính hiển vi. Trong khi nhuộm Nisseel là nhuộm
màu xanh các cấu trúc chứa RNA, bao gồm cả ribosome trong các thể Nissl, giúp
quan sát sự suy giảm của tế bào thần kinh, xác định mức độ và bản chất của bệnh
lý.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen , keo gắn lamen.
2.3. Hoá chất:
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm xanh Luxol/
Nisell
2.4. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ
dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: các sợi myelin có màu xanh lam, với các vùng
có nồng độ myelin cao nhất có màu sẫm hơn. Vết nhuộm màu xanh lam xuất hiện
trên nền trắng
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng xét nghiệm
theo quy định Bộ Y Tế
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
46. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này giúp phát hiện các
vi khuẩn có trên mẫu mô vùi nến dựa vào sự bắt màu của các vi khuẩn với thuốc
nhuộm.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Khi vi khuẩn được nhuộm với thuốc
nhuộm ban đầu Crystal Violet (CV-tinh thể tím) và được cố định bằng chất gắn
màu, một số vi khuẩn có thể giữ lại thuốc nhuộm ban đầu và một số bị mất màu bởi
cồn (ethanol). Dựa vào màu sắc khác nhau có thể phân biệt vi khuẩn Gram âm và
vi khuẩn Gram dương trên tiêu bản nhuộm.
Vi khuẩn Gram dương: thành tế
bào có một lớp phức hợp protein-đường dày (peptidoglycan) và hàm lượng lipid thấp.
Việc khử màu tế bào khiến thành tế bào dày này bị mất nước và co lại, làm bít
các lỗ trên thành tế bào và ngăn không cho thuốc nhuộm thoát ra khỏi tế bào. Vì
vậy, cồn không thể loại bỏ phức hợp CV-Iodine liên kết với lớp peptidoglycan
dày của vi khuẩn gram dương và xuất hiện màu xanh lam hoặc tím.
Vi khuẩn Gram âm: thành tế bào
cũng hấp thụ phức hợp CV-Iodine nhưng do lớp peptidoglycan mỏng và lớp ngoài
dày được hình thành từ lipid nên phức hợp CV-Iodine bị cuốn trôi. Khi chúng tiếp
xúc với cồn, chất khử màu sẽ hòa tan lipid trong thành tế bào, điều này cho
phép phức hợp CV-Iodine thoát ra khỏi tế bào. Sau đó, khi nhuộm lại bằng
safranin, chúng sẽ có màu đỏ.
Chữ viết tắt
- CV: Tinh thể tím (Crystal
Violet)
- HE: Hematoxylin Eosin.
- MSDS: Bảng chỉ dẫn an toàn
hóa chất (Material Data Safety Sheets)
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện: Nhân
lực trực tiếp
Bác sỹ : 01
Kỹ thuật y: 01
Hộ lý: 01
2.2. Vật tư
2.2.1. Sinh phẩm
|
Tên hóa chất
|
Đơn vị
|
|
Dung dịch tẩy nến: xylen (hoặc
dung dịch thay thế xylen)
|
ml
|
|
Cồn tuyệt đối
|
ml
|
|
Cồn 96%
|
ml
|
|
Nước cất 2 lần (hoặc nước RO)
|
ml
|
|
Bộ kít gồm các dung dịch: 1.
Tím gentian, 2. Lugol, 3. Tẩy màu (aceton), 4. Fuchsin, 5. Biệt hóa
|
test
|
|
Dung dịch rửa (Wash)
|
test
|
|
Dung dịch tẩy nến (khử
parafin) (Ez Pres)
|
test
|
|
Dung dịch dầu khoáng nhẹ
(Lique coverslip LCS)
|
test
|
|
Dung dịch rửa hệ thống
(Cleaning Plus kit)
|
test
|
|
Dung dịch gắn lamelle
|
ml
|
|
Dung dịch rửa tay
|
ml
|
|
Dung dịch khử khuẩn bề mặt
|
ml
|
|
Khử khuẩn Presept 2,5 gram
|
viên
|
2.2.2. Dụng cụ
- Que tãi bệnh phẩm.
- Kẹp không mấu các kích cỡ
- Khay nhôm làm đá lạnh.
- Giá để tiêu bản nằm, đứng.
- Bể nhuộm
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại)
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng)
- Thùng đựng rác thông thường
(màu xanh).
2.2.3. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính tích điện dương
super frost.
- Lá kính (lamelle)
- Pipet nhựa
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn
- Găng tay không bột tan
- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.
- Bút chì, bút dạ dầu.
- Giấy A4
- Giấy in tem chống thấm nước,
hóa chất
- Cuộn mực in tem
- Giấy thấm tiêu bản
- Giấy lau tay
- Túi đựng rác thải các loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu)
- Máy nhuộm đặc biệt
- Bể dàn tiêu bản
- Máy gắn lamelle tự động
- Máy khuấy từ
- Cân điện tử
- Kính hiển vi quang học (một
và nhiều đầu, không và có kết nối camera)
- Tủ ấm
- Tủ hút mùi hóa chất
- Tủ lạnh có ngăn làm đá
- Tủ đựng hóa chất chống cháy
lan
- Tủ đựng hóa chất có hệ thống
lọc khí, hóa chất
- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt
độ 2-8 °C
- Hệ thống tủ lưu trữ tiêu bản,
khối nến.
- Máy in tem/nhãn
- Hệ thống công nghệ thông tin có
phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm) và lưu trữ mẫu.
- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ
phòng 21-26 °C, đảm bảo an toàn sinh học
- Hệ thống lavabo cấp thoát nước
(có đường thải hóa chất độc hại)
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Các trang thiết bị, dụng cụ vệ
sinh, làm sạch.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến cần
nhuộm Gram để đánh giá và tiêu bản nhuộm Hematoxylin Eosin (HE) kèm theo.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định trong
dung dịch formalin trung tính 10% ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.
+ Quy trình tạo ra khối nến phải
đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
- Lựa chọn khối nến chứa mẫu bệnh
và mẫu chứng nhuộm Gram âm và dương.
- Chuẩn bị các lam kính chuyên
dụng có mã số, ký hiệu tương ứng với từng loại tiêu bản nhuộm. Cắt 1-2 lát mẫu
bệnh và mẫu chứng với độ dày 3-5µm gắn lên mỗi lam kính.
+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm
Gram.
+ 1 tiêu bản mẫu chứng Gram âm.
+ 1 tiêu bản mẫu chứng Gram dương.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
loại xét nghiệm yêu cầu.
- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, loại
mẫu cần làm xét nghiệm.
- Có ghi thời gian chỉ định, họ
tên và chữ ký của bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu,
người bàn giao và người nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Tổng thời gian ước tính: 72 giờ,
trong đó:
- Thời gian chuẩn bị mẫu: 12 giờ
- Thời gian nhuộm: 24 giờ
- Thời gian phân tích kết quả,
trả kết quả: 36 giờ.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu
bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.
3. AN TOÀN:
- Thực hiện các biện pháp an toàn
theo Sổ tay an toàn của từng phòng xét nghiệm: an toàn sinh học, an toàn điện,
an toàn cháy nổ, an toàn hoá chất.
- Thực hiện an toàn sinh học
phù hợp tác nhân gây bệnh theo thông tư 41/2016/TT-BYT
- Sử dụng hoá chất sinh phẩm an
toàn theo khuyến cáo của nhà sản xuất (tham khảo MSDS).
- Hiệu chuẩn vật tư, thiết bị định
kỳ.
- Kiểm soát môi trường: Ánh
sáng, tiếng ồn, nhiệt độ, độ ẩm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
|
Bước
|
Dung dịch
|
Thời gian
|
|
|
Tẩy nến
|
|
|
1
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen hoặc
dung dịch thay thế xylen (bể 1)
|
2 phút
|
|
2
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 2)
|
2 phút
|
|
3
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 3)
|
2 phút
|
|
4
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn tuyệt
đối
|
1 phút
|
|
5
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn 96%
(bể 1)
|
1 phút
|
|
6
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn 96%
(bể 2)
|
1 phút
|
|
7
|
Ngâm các tiêu bản vào bể nước
chảy
|
2 phút
|
|
|
Nhuộm tiêu bản
|
|
|
8
|
Phủ tiêu bản với dung dịch
Tím gentian
|
1 phút
|
|
9
|
Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy
|
1 phút
|
|
10
|
Phủ tiêu bản với dung dịch
Lugol
|
1 phút
|
|
11
|
Rửa tiêu bản với nước cất
|
1 phút
|
|
12
|
Phủ tiêu bản với dung dịch tẩy
màu aceton
|
20 giây
|
|
13
|
Rửa tiêu bản với nước cất
|
5 giây
|
|
14
|
Phủ tiêu bản với dung dịch
Fuchsin
|
2 phút
|
|
15
|
Rửa tiêu bản với nước cất
|
5 giây
|
|
16
|
Phủ tiêu bản với dung dịch biệt
hóa
|
15 giây
|
|
|
Khử nước
|
|
|
17
|
Dội tiêu bản với cồn tuyệt đối
lần 1
|
3 giây
|
|
18
|
Dội tiêu bản với cồn tuyệt đối
lần 2
|
3 giây
|
|
19
|
Dội tiêu bản với cồn tuyệt đối
lần 3
|
3 giây
|
|
|
Gắn tiêu bản
|
|
|
20
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen hoặc
dung dịch thay thế xylen (bể 4)
|
30 giây
|
|
21
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 5)
|
30 giây
|
|
22
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 6)
|
30 giây
|
|
23
|
Gắn lamelle bằng dung dịch gắn
|
|
|
24
|
Đánh giá chất lượng nhuộm và
bàn giao tiêu bản
|
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Phân tích kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE,
chú ý vùng nghi ngờ có vi khuẩn.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm chứng
Gram âm và chứng Gram dương:
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm mẫu bệnh.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
- Các tiêu chí đánh giá:
+ Vi khuẩn gram dương: xanh lam/tím
+ Vi khuẩn gram âm: đỏ
+ Các phần khác của mô: vàng
+ Nhân: đỏ.
- Các loại vi khuẩn có thể gặp:
+ Vi khuẩn Gram dương:
Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella,
Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus,
Streptomyces ...
+ Vi khuẩn Gram âm: Escherichia
coli (E. coli), Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas,
Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, acetic acid bacteria,
Legionella …
- Đưa ra kết luận: Nhuộm Gram
có/không có vi khuẩn Gram dương/âm.
4.2.2. Báo cáo kết quả xét nghiệm
và lưu trữ bệnh phẩm
- Trả kết quả theo các quy
trình liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và
người thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.
- Lưu khối nến và tiêu bản theo
quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian quy định
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Chứng âm nền:
- Nguyên nhân: tẩy màu thuốc
nhuộm chưa đủ
- Khắc phục: Chú ý thời gian tẩy
màu đến khi hết màu thuốc nhuộm trên lam.
5.2. Chứng dương âm tính:
- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; tẩy
màu quá lâu, mẫu hết không đạt tiêu chuẩn, thực hiện không đúng các bước trong
quy trình.
- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới;
cắt các tiêu bản chứng dương để test lại, và tìm mẫu chứng dương khác nhuộm
cùng để đối chứng, tuân thủ đúng theo quy trình kỹ thuật.
5.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm:
- Nguyên nhân: Mẫu cắt mất mô
do kỹ thuật cắt hoặc do máy cắt, dao cắt. Tiêu bản bị bóng nước, tiêu bản nhuộm
chưa khô, cắt mẫu trên lam thường. Tiêu bản khi thực hiện nhuộm bị nghiêng hoặc
hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc
nhuộm.
- Khắc phục: Dựa vào nguyên
nhân để loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng. Khi thấy trên mẫu bệnh phẩm có bóng nước
cần loại bỏ bóng, bọt khí, để tiêu bản khô hoàn toàn, cắt mẫu trên lam tích điện
dương có chất gắn. Cân bằng lại hệ thống máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực
hiện quy trình tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió….
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm tra chất
lượng:
+ Sử dụng mẫu chứng Gram âm và
Gram dương đã đánh giá chất lượng
+ Nhuộm Gram trên mẫu chứng khi
nhập hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo khuyến
cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.
+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu
cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
+ Nếu không đạt yêu cầu, cần
tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
- Thực hiện ngoại kiểm: theo
chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng.
- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh
trang thiết bị.
- Kiểm soát điều kiện môi trường.
- Đào tạo thường xuyên nhân
viên về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo
tiêu chuẩn.
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế Hướng
dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào học.
2. Quyết định 3376/QĐ-BYT ngày 30/098/2023 của Bộ y tế Ban
hành “Đề cương Quy trình kỹ thuật xét nghiệm.
3. Bancroff JD, Gamble M
(2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th
edition.
4. Suvarna SK, Layton C,
Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques.
Elsevier, 8th edition.
47. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NGẤM BẠC
XEM DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Chuẩn bị mô y sinh học và vi
sinh vật để soi trên kính hiển vi điện tử quét, quan sát cấu trúc siêu vi thể bề
mặt mẫu.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng để quan sát bề
mặt mẫu kích thước cỡ nanomet dùng trong chẩn đoán, nghiên cứu và soi đặc điểm
hình dạng cấu trúc bên ngoài mô.
Nguyên lý của phương pháp là
các mô sẽ được cố định, làm khô, mạ phủ bằng kim loại nặng để chùm điện tử
electron có thể quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện
thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm
điện tử với bề mặt mẫu vật.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật viên: 02
- Hộ lí: 01
2.2. Vật tư, phương tiện,
hoá chất
- Chai, lọ thủy tinh đựng hóa
chất và mẫu (Số lượng lọ phụ thuộc vào số lượng mẫu)
- Dung dịch khử khoáng (đối với
các mẫu mô xương, răng)
- Dung dịch glutaraldehyde
- Dung dịch đệm cacodylat
- Dung dịch axit Osmic
- Bộ dụng cụ tiểu phẫu (Gồm
dao, kéo, nỉa, kẹp có mấu và không mấu)
- Effpendof 0,5ml
- Cồn 96° (để pha các nồng độ
khác nhau)
- Cồn tuyệt đối
- Nước cất
- Giấy lọc
- Băng dính cacbon
- Kính phòng hộ,
- Acetone
- T-Butyl
- Isoamyl acetate
- Ống hút nhựa
- Xilanh 5ml
- Găng tay, khẩu trang, kính bảo
vệ mắt và quần áo bảo hộ: 02 bộ.
- Dung dịch khử trùng là sạch dụng
cụ,
- Kim loại mạ phủ: Vàng,
Platinum, Palladium hoặc Chromium...
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống kính hiển vi điện tử
quét,
- Máy mạ phủ
- Máy bốc bay hơi
- Máy làm khô mẫu ở điểm tới hạn
- Tủ lạnh, hộp cách nhiệt chứa
đá khô hoặc đá lạnh để lưu giữ và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút phòng thí nghiệm.
- Kính soi nổi
- Cân vi lượng.
- Vòi nước chảy, các dụng cụ
- Chai thủy tinh có nắp để đựng
bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem hủy.
- Bình có chứa dung dịch cố định
để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Với mẫu mô y sinh học
tươi
- Lấy bệnh phẩm: Tiến hành như
quy trình thường quy giải phẫu bệnh. Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa
lâm sàng, phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu và gửi bệnh phẩm về các phòng nghiên
cứu siêu cấu trúc.
- Thu thập mẫu bệnh phẩm:
+ Đo chiều dài mảnh sinh thiết
+ Vẽ hoặc chụp lại hình ảnh mẫu
+ Mẫu có kích thước 0,5 x 0,5 x
0,5 cm.
+ Cố định ngay trong lọ đựng
3-5ml dung dịch glutaraldehyde 2,5% .
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có ghi đầy đủ thông tin theo
quy đinh (họ tên người bệnh, tuổi, giới, tên khoa phòng yêu cầu xét nghiệm),
- Có ghi ngày vào viện, chẩn
đoán lâm sàng, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian phương pháp, vị trí, lấy mẫu bệnh
phẩm, số lượng bệnh phẩm).
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên người yêu cầu xét nghiệm.
- Có phần mô tả đại thể:
+ Loại mô xét nghiệm
+ Vùng lấy bệnh phẩm
+ Số lượng bệnh phẩm lấy xét
nghiệm
+ Màu sắc bệnh phẩm
+ Kích thước bệnh phẩm
+ Đặc điểm hình thái diện cắt
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị mẫu, hóa chất
và chất đúc
4.1.1. Chuẩn bị mẫu
- Lấy mẫu từ mô y sinh học:
Lấy mẫu từ mô tươi tốt hơn mô
đã được cố định thường quy. Cần nhanh chóng lấy mẫu ngay khi bệnh phẩm được lấy
ra khỏi cơ thể.
Đặt bệnh phẩm lên thớt nhựa cứng
hoặc thớt thủy tinh sạch.
Nhỏ vài giọt dung dịch bảo quản
glutaraldehyde 2,5% lên vùng khác của tấm thớt, đặt các lát cắt mô lên phía
trên và phủ lên trên với vài giọt dung dịch glutaraldehyde 2,5%.
Pha nhỏ các lát cắt thành những
khối 1mm3 bằng dao sắc và nhúng bệnh phẩm vào dung dịch
glutaraldehyde 2,5% lạnh (4°C).
Lấy 3-5 mảnh mô là đủ. Nếu bệnh
phẩm có nhiều vùng tổn thương khác nhau trên đại thể, cần lấy riêng và đưa đến
phòng xét nghiệm hiển vi điện tử trong những lọ riêng biệt.
Mô có thể được giữ trong dung dịch
cố định dùng cho hiển vi điện tử trong nhiều ngày ở 4°C (không quá 30 ngày) trước
khi đưa đến phòng xét nghiệm hiển vi điện tử.
- Lấy mẫu y sinh học từ mô
được cố định bảo quản
Mô đã được cố định bảo quản
trong formol trung tính 10% và các dung dịch bảo quản khác.
Cắt bỏ lát mỏng 1mm từ bờ của bệnh
phẩm nơi tiếp xúc trực tiếp với dung dịch cố định, cho vào trong bình nước ngâm
rửa dưới vòi nước sạch liên tục 48h.
Sau đó tiến hành như đối với mô
tươi.
- Các mẫu xương: được khử
khoáng bằng dung dịch ethylen diamin tetra acetic (EDTA) 5%, thời gian khử
khoáng từ 15 đến 20 ngày (thường sử dụng 25 - 30 ml dung dịch EDTA 5% cho một
gam xương).
Tiến hành khử khoáng như sau:
Dùng một lớp gạc bọc các mẫu xương, lấy một sợi chỉ buộc và treo mẫu lơ lửng
trong lọ dung dịch để mẫu được tiếp xúc đều với dung dịch khử khoáng. Hàng ngày
lắc đều dung dịch khử khoáng từ 1 đến 2 lần. Sau mỗi tuần thay dung dịch mới.
Cuối tuần thứ 2 kiểm tra kết quả khử khoáng bằng các phương pháp sau:
+ Phương pháp cơ học: Dùng kim
khâu xuyên vào cạnh mẫu xương, khi kim xuyên qua mà có cảm giác mềm tay là quá
trình khử khoáng đã hoàn thành.
+ Phương pháp hoá học: Lấy 1 ml
dung dịch amoni oxalat NH4C2O4 5% hay natri oxalat
Na2 C2O4 5%; cho một trong hai dung dịch vào dung dịch khử
khoáng, nếu có tủa là sự khử khoáng chưa hoàn thành.
4.1.2. Chuẩn bị dung dịch để rửa
và cố định mẫu
- Chuẩn bị đệm cacodylate 0,2M
và 0,3M
- Chuẩn bị dung dịch cố định
glutaraldehyde 2,5%
- Chuẩn bị dung dịch axit Osmic
1%
- Dung dịch cồn các nồng độ:
50°, 70°, 80°, 85°, 90°, 95°
- Chuẩn bị các dung dịch khác
4.2. Tiến hành xử lý mẫu cho
nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét
Tiến hành nhuộm theo các bước
sau:
1. Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat
0,3M, 2 lần x 10 phút/lần.
2. Cố định mẫu trong
glutaraldehyd 2,5% trong 12 giờ (để qua đêm), ở 40°C;
3. Rửa mẫu bằng đệm cacodylat
0,1M, 2 lần x 10 phút/lần;
4. Cố định bổ sung bằng axit
osmic 1% trong 4-6 giờ), ở 40°C;
5. Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat
0,1M, 2 lần x 10 phút/lần.
6. Khử nước các mẫu theo qui
trình:
- Cồn ethanol 50°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 70°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 80°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 90°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 95°, 2 lần x 15 phút/lần;
- Cồn ethanol 100°, 2 lần x 15
phút/lần.
7. Làm khô mẫu:
Tùy thuộc vào loại mẫu mà áp dụng
các phương pháp làm khô khác nhau như sau:
- Làm khô tự nhiên (đối với các
mẫu mô có bề mặt tương đối rắn chắc: xương, răng, tóc, móng…) bằng cách khử cồn
trong các mẫu xương bằng ether:
+ Cồn ethanol 100°, ether
nguyên chất (tỉ lệ 1/1) x 20 phút/lần x1 lần;
+ Ether nguyên chất x 20 phút/lần
x 1 lần;
+ Làm khô mẫu trong không khí.
- Làm khô bằng bốc bay (đối với
các mẫu mô mềm) bằng cách khử cồn ethanol trong các mẫu mô bằng T – Butyl:
+ Ngâm các mẫu mô trong cồn T -
Butyl x 30 phút/lần x 3 lần. Sau lần 3 để trong ngăn đá tủ lạnh 30 phút đến 1
giờ để cồn T - Butyl chuyển dạng tinh thể.
+ Bốc bay cồn T - Butyl trong
2-5h.
- Làm khô tại điểm tới hạn (là
phương pháp tối ưu nhất để bảo tồn bề mặt mẫu) được thực hiện bằng máy làm khô
tại điểm tới hạn với các bước chính sau:
+ Ngâm các mẫu trong isoamyl
acetate;
+ Thay thế isoamyl acetate bằng
CO2 lỏng;
+ Làm bay hơi CO2 lỏng
ở điểm tới hạn.
8. Mạ phủ mẫu:
Gắn mẫu trên đế mang mẫu của
kính hiển vi điện tử quét bằng băng dính cacbon, hướng bề mặt quan sát lên
trên.
Mạ phủ mẫu bằng vàng/Palladium
dày 40-60nm trong thời gian 45 - 60 giây, hoặc có thể mạ phủ mẫu bằng cacbon và
sau đó là đồng trên máy mạ phủ mẫu
4.3. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ Giải phẫu bệnh
đọc trên kính hiển vi điện tử quét.
Đưa mẫu vào máy, vận hành, soi
và chụp ảnh theo quy trình và mục đích cần đánh giá, nghiên cứu.
4.4. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Pha mẫu gây tổn
thương, bầm rập mẫu; Sử dụng lưỡi dao sắc, cắt gọn 1 thì, không cứa, kéo mẫu.
Dùng nỉa chuyên dụng giữ mẫu.
- Cố định nhầm vào dung dịch
khác, loại bỏ và lấy lại bệnh phẩm mới
- Không kịp thời cố định ngày
trong dung dịch glutaraldehyd, thời gian cố định không đủ. Bệnh phẩm dính vào
thành lọ đựng mẫu, không được ngâm trong dung dịch cố định làm hỏng bệnh phẩm:
nên cho lượng dung dịch đủ quy định vào lọ trước khi pha và thả bệnh phẩm ngập
trong dung dịch, sau đó đậy nắp và lắc đều lọ đựng mẫu.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Mạ phủ nhầm mặt cắt và vùng định
quan sát: Mạ phủ lại
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
+ Tiêu bản nhăn, rách: Có thể do:
Chất đúc không đạt yêu cầu, tủ ấm không bảo đảm nhiệt độ, do bản thân mẫu
+ Tiêu bản bị quá nhạt hoặc quá
đậm: Kiểm tra lại hóa chất và thời gian nhuộm
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi Huyền Trác (1976),
Các kỹ thuật hiển vi học, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
2. Jeol – Serving
Advanced Technology, A guide to Scanning Microscope Observation
3. Murtey, M. D., &
Ramasamy, P. (2016). Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy –
Life Sciences. InTech. doi: 10.5772/61720
4. Chris G. Jones (2012),
Scanning Electron Microscopy: Preparation and Imaging for SEM, Methods Mol
Biol. 2012;915:1-20. doi: 10.1007/978-1-61779-977-8_1.
48. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM TRICHROME
BLUE
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Trichrome blue.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Phương pháp nhuộm ba màu theo
n.guyên lý giống như nhuộm ba màu theo Masson (1929).
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen
- Lam kính
2.3. Hoá chất:
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Keo gắn lamen
- Bộ kít nhuộm Trichrome blue
2.4. Trang thiết bị:
- Tủ ấm 37°C và 56°C
- Tủ hút
- Tủ lạnh
- Máy cắt lát mỏng (Microtome)
- Khay và giá đựng mẫu
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học:
- Nhân: Xanh da trời - đen
- Bào tương, sợi cơ và hồng cầu:
Đỏ
- Sợi tạo keo: Xanh da trời
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
49. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI
METHENAMINE SILVER
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm gomori methenamine silver .
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nguyên lý phương pháp nhuộm giống
như nhuộm PAS: : nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc
permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd
này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc - methenamine.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01.
- Kỹ thuật Y: 01. - Hộ lý: 01.
2.2. Vật tư:
- Lam kính
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen
2.3. Hoá chất
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Keo gắn lamen
- Bộ kít nhuộm Gomori
Metheamine silver
2.4. Trang thiết bị:
- Tủ ấm 37°C và 56°C
- Tủ hút
- Tủ lạnh
- Máy cắt lát mỏng (Microtome)
- Khay và giá đựng mẫu
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm .
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ
dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm;
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm;
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được;
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động.
4.2. Nhận định kết quả:
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
− Sợi võng: đen
− Nhân: xám nhạt
− Mô khác: phụ thuộc chất nhuộm
đối màu
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
50. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Sắt .
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng trong chẩn
đoán các bệnh, tổn thương liên quan đến chuyển hóa và lắng động sắt ở các mô,
cơ quan, tổ chức.... Việc tẩm dung dịch kim loại sắt sẽ dừng lại khi màu sắc mảnh
cắt đạt được màu mong muốn và được thực hiện hoàn toàn trên máy nhuộm tự động.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Lam kính
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen
2.3. Hoá chất
* Đối với quy trình nhuộm thủ
công :
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- Dung dịch acid acetic 12%.
- Dung dịch mẹ hydroxit sắt dạng
keo
- Dung dịch Ferrocyanua Kali
(2%)
- HCl (2%)
- keo gắn lamen
* Đối với quy trình nhuộm máy:
- Bộ kit nhuộm sắt
2.4. Trang thiết bị:
- Tủ ấm 37°C và 56°C
- Tủ hút
- Tủ lạnh
- Điều hòa nhiệt độ
- Máy cắt lát mỏng (Microtome)
- Khay và giá đựng mẫu
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
* Đối với quy trình nhuộm thủ công
:
+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng
3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80° mỗi bể 2 phút.
+ Rửa nước.
+ Nhúng mảnh cắt rất nhanh vào
dung dịch acid acetic 12%.
+ Không rửa; đặt các mảnh cắt
vào trong dung dịch làm việc khoảng 1 giờ.
+ Rửa trong 4 bể acid acetic
12% (3 phút mỗi bể).
+ Đặt mảnh cắt vào trong dung dịch
Ferrocyanua Kali (2%) + HCl (2%) với thể tích bằng nhau, khoảng 20 phút.
+ Rửa nước chảy rồi qua nước cất.
+ Nhuộm nhân bằng đỏ nhân trong
3 - 10 phút.
+ Rửa trong nước chảy, rồi nước
cất.
+ Làm mất nước nhanh bằng cồn
95º và cồn tuyệt đối.
+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.
+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn.
* Đối với quy trình nhuộm máy :
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: Mucopolysaccarit acid bắt màu xanh đậm.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
51. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CHẤT ĐỒNG
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm đồng trên máy nhuộm đặc biệt tự
động.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng trong chẩn
đoán các bệnh, tổn thương liên quan đến chuyển hóa và lắng động đồng ở các mô,
cơ quan, tổ chức.... Việc tẩm dung dịch kim loại đồng sẽ dừng lại khi màu sắc mảnh
cắt đạt được màu mong muốn và được thực hiện hoàn toàn trên máy nhuộm tự động.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý 01
2.2. Vật tư:
- Lam kính
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen
2.3. Hoá chất
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm đồng
- Keo gắn lamen
2.3. Trang thiết bị:
- Tủ ấm 37°C và 56°C
- Tủ hút
- Tủ lạnh
- Điều hòa nhiệt độ
- Máy cắt lát mỏng (Microtome)
- Khay và giá đựng mẫu
- Kính hiển vi quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học: chất đồng tích tụ thành phức hợp có màu xanh
đen hoặc nâu đen trong mô.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị bong: cắt dày
quá, cố định thời gian chưa đảm bảo…
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
52. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC CHO THẬN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP XANH JONES
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Jones methamine silver.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng trong chẩn
đoán các bệnh, tổn thương liên quan thận, sử dụng kỹ thuật nhuộm màng đáy cầu
thận để phát hiện tổn thương của nó, Oxy hóa các thành phần Carbohydrate của
màng đáy tạo ra aldehyde bằng Periodic acid. Các aldehyde được giải phóng sẽ khử
bạc thành bạc kim loại có thể nhìn thấy được. Việc tẩm dung dịch kim loại sẽ dừng
lại khi màu sắc mảnh cắt đạt được màu mong muốn.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Lamen
- Giấy lọc
- Lam kính
- Giá đựng tiêu bản, bút ghi
nhãn, giấy thấm
- Bể nhuộm
2.3. Hoá chất
- Acid periodic 0,5%
- Vàng Chloride 0.5%
- Thiosulphate sodium 5%
- Dung dịch nhuộm bạc thận
(Renal Silver Bath – RSB)
+ 40ml Hexamine 3% (trữ ở nhiệt
độ phòng)
+ 2ml Bạc nitrat 5% (trữ ở tủ lạnh)
+ 6ml Borax 5% (trữ ở nhiệt độ
phòng)
- Hematoxylin, Green Fast
- Keo gắn lamen
- Đối với trường hợp nhuộm máy
tự động: bộ kit test có sẵn của hãng đã bao gồm đầy đủ dung dịch nhuộm.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy đo độ pH
- Kính hiển vi quang học
- Tủ lạnh
- Pipet
- Cân vi lượng
- Khay, giá, Lọ thủy tinh đựng
hóa chất...
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Khoa giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ
dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm
(*) Đối với quy trình nhuộm thủ
công:
+ Đối chiếu mã số bệnh nhân
trên lam kính và trên phiếu chỉ định sau đó thực hiện kỹ thuật:
+ Tiêu bản tẩy nến như thường lệ
sau đó rửa nước chảy: 5 phút
+ Phủ dung dịch Acid Periodic
0.5%: 30 phút
+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút
+ Cho tiêu bản vào bể nhựa có
chứa dung dịch RSB, cho bể nhựa vào cốc nước
ấm 80°C, cho cốc nước vào tủ ấm
70°C: 20 phút
+ Kiểm tra tiêu bản xem đủ đậm
màu chưa, nếu chưa đợi đến khi đủ đậm màu rồi rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút
+ Phủ Vàng chloride 0.5% lên
tiêu bản: 1 phút
+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút
+ Phủ Thiosulphate sodium 5%
lên tiêu bản: 1 phút
+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút
+ Nhuộm Hematoxylin
+ Nhuộm Green fasst
+ Rửa nước
+ Khử nước → làm trong bằng
xylen → gắn bôm
(*) Đối với quy trình nhuộm máy
+ Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
+ Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Màng đáy: Đen;
+ Nhân: Xanh lam/tía;
+ Bào tương: xanh
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
+ Tiêu bản bị đen: cắt dày hoặc
để thời gian nhuộm RSB quá lâu: cắt mỏng, giảm thời gian nhuộm RSB
+ Dung dịch RSB là chất oxy hóa
có độc tính cao, do đó khi tiếp xúc với dung dịch phải cẩn thận, phải đeo khẩu
trang, găng tay, ở nơi thoáng gió.
+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ
màu đen: pha dung dịch RSB chưa đúng tỉ lệ, thời gian ủ chơi đủ hoặc dung dịch
bạc hết hạn sử dụng.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
53. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS
(Periodic Acid Schiff)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Acid Periodic Schiff trên mẫu
mô bệnh học.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đây là kỹ thuật nhuộm phát hiện
nấm và chất nhầy với nguyên lý dùng tác nhân oxy hóa là acid periodic để phá vỡ
mối liên kết của 2 nguyên tử các bon (các nhóm glycol 1-2, hydro-1 amino-2,
hydroxy-1 alkylamino-2, hydroxyl -1ceto-2…) làm xuất hiện các nhóm aldehyt. Các
nhóm aldehyt này nhìn được nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật Y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Vật tư:
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen.
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.3. Hoá chất
- Cồn tuyệt đối
- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc
toluen)
- Các hóa chất để thực hiện nhuộm:
thuốc thử Shiff, acid periodic, Hematoxyline.
2.4. Trang thiết bị:
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Bể nhuộm.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm
ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm đã được trong vùi
paraffin.
2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.7. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.8. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Khối nến chứa bệnh phẩm được
cắt mỏng 3-4 micromet trên lam kính.
- Tiến hành kỹ thuật nhuộm:
Tẩy parafin bằng 3 bể toluen
(xylen), mỗi bể 2 phút.
Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80°, 70° mỗi bể 2 phút.
Ngâm trong nước cất: 10 phút.
Oxy hóa trong acid periodic 1%:
10 phút.
Rửa nước chảy: 5 – 10 phút rồi
cho vào nước cất.
Ngâm trong thuốc thử Schiff:
15- 30 phút (hoặc thấy có màu hồng là được).
Nhuộm nhân bằng hemalum Mayer:
khoảng 1phút.
Rửa nước chảy trong 5 phút. Đẩy
nước bằng cồn 95° và 100°
Làm trong qua 3 bể toluen sạch
Gắn lamen bằng bôm như thường lệ
4.2. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh
giá trên kính hiển vi quang học:
+ Nhân tế bào: Xanh đen
+ Nấm, chất nhày: Hồng đậm tới
đỏ
+ Glycoprotein: Đỏ
+ Glycogen: Đỏ
+ Chất nền: màu ve
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tiêu bản gấp, xước, rách,
nhăn
- Chất lượng thuốc thử shiff và
nồng độ acid periodic cần được kiểm tra thường xuyên
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
3. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
54. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC
ACID SCHIFF DIASTATE (PAS – D).
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phân biệt các thành phần chứa
glycogen (Ví dụ: tế bào gan, đại thực bào, thể vùi) với các thành phần chứa
carbohydrate khác (như chất nhầy, tinh bột, nấm, màng đáy, sợi võng) khi cùng bắt
màu nhuộm Periodic Acid Schiff (PAS).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật nhuộm PAS-D thường thực
hiện sau khi nhuộm PAS bắt màu đỏ với các thành phần chứa carbohydrate trong mô
(ví dụ: glycogen, chất nhầy, tinh bột). Đây là một trong những kỹ thuật tiêu
enzym giúp loại bỏ glycogen ra khỏi mô, các phân tử glycogen dưới tác động của
enzym tiêu glycogen α-Amylase sẽ bị phá vỡ thành các phân tử nhỏ hơn (maltose
và glucose) dễ bị rửa trôi và mất màu đỏ của thuốc nhuộm PAS.
Chữ viết tắt
- HE: Hematoxylin Eosin.
- MSDS: Bảng chỉ dẫn an toàn
hóa chất (Material Data Safety Sheets)
- PAS: Periodic Acid Schiff
- PAS-D: Periodic Acid Schiff-
Diastase
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sỹ: 01
Kỹ thuật y: 01
Hộ lý: 01
2.2. Vật tư
2.2.1. Sinh phẩm
|
Tên hóa chất
|
Đơn vị
|
|
Dung dịch Xylen hoặc dung dịch
thay thế xylen
|
ml
|
|
Cồn tuyệt đối
|
ml
|
|
Cồn 96%
|
ml
|
|
Nước cất 2 lần (hoặc nước RO)
|
ml
|
|
DD enzym α - Amylase 1%
|
test
|
|
DD Acid periodic 0,5 %
|
test
|
|
DD Schiff
|
test
|
|
DD Hematoxylin Mayer
|
test
|
|
Dung dịch rửa (Wash)
|
test
|
|
Dung dịch tẩy nến (khử
parafin) (Ez Pres)
|
test
|
|
Dung dịch dầu khoáng nhẹ
(Lique coverslip LCS)
|
test
|
|
Dung dịch rửa hệ thống
(Cleaning Plus kit)
|
test
|
|
DD gắn lamelle (DPX mountant)
|
ml
|
|
Dung dịch rửa tay
|
ml
|
|
Dung dịch khử khuẩn bề mặt
|
ml
|
|
Khử khuẩn Presept 2,5
gram
|
viên
|
2.2.2. Dụng cụ
- Que tãi bệnh phẩm.
- Kẹp không mấu các kích cỡ
- Khay nhôm làm đá lạnh.
- Giá để tiêu bản nằm, đứng.
- Bể nhuộm
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại)
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng)
- Thùng đựng rác thông thường
(màu xanh).
2.2.3. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính tích điện dương
super frost.
- Lá kính (lamelle)
- Pipet nhựa
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn
- Găng tay không bột tan
- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.
- Bút chì, bút dạ dầu.
- Giấy A4
- Giấy in tem chống thấm nước,
hóa chất
- Cuộn mực in tem
- Giấy thấm tiêu bản
- Giấy lau tay
- Túi đựng rác thải các loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu)
- Máy nhuộm đặc biệt
- Bể dàn tiêu bản
- Máy gắn lamelle tự động
- Máy khuấy từ
- Cân điện tử
- Kính hiển vi quang học (một
và nhiều đầu, không và có kết nối camera)
- Tủ ấm
- Tủ hút mùi hóa chất
- Tủ lạnh có ngăn làm đá
- Tủ đựng hóa chất chống cháy
lan
- Tủ đựng hóa chất có hệ thống
lọc khí, hóa chất
- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt
độ 2-8°C
- Hệ thống tủ lưu trữ tiêu bản,
khối nến.
- Máy in tem/nhãn
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm) và lưu trữ bệnh phẩm.
- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ
phòng 21-26°C, đảm bảo an toàn sinh học
- Hệ thống lavabo cấp thoát nước
(có đường thải hóa chất độc hại)
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Các trang thiết bị, dụng cụ vệ
sinh, làm sạch.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là mẫu nến cần nhuộm
PAS-D để đánh giá.
- Các tiêu bản kèm theo gồm:
+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm
Hematoxylin Eosin (HE)
+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm PAS
dương tính.
- Mẫu nến chứa bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định trong
DD formalin trung tính 10% ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.
+ Quy trình tạo ra mẫu nến phải
đảm bảo đúng kỹ thuật.
- Chuẩn bị các lam kính chuyên
dụng có mã số, ký hiệu tương ứng với từng loại tiêu bản nhuộm. Cắt từ mẫu nến
1-2 lát với độ dày 3-5µm gắn lên mỗi lam kính.
+ 1 tiêu bản mẫu bệnh để nhuộm
PAS-D tương ứng tiêu bản nhuộm PAS dương tính.
+ 1 tiêu bản mẫu chứng PAS-D
âm.
+ 1 tiêu bản mẫu chứng PAS-D
dương.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
loại xét nghiệm yêu cầu.
- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, loại
mẫu cần làm xét nghiệm.
- Có ghi thời gian chỉ định, họ
tên và chữ ký của bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu,
người bàn giao và người nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Tổng thời gian ước tính: 72 giờ,
trong đó:
- Thời gian chuẩn bị mẫu: 12 giờ
- Thời gian nhuộm: 24 giờ
- Thời gian phân tích kết quả,
trả kết quả: 36 giờ.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu
bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.
3. AN TOÀN:
Thực hiện theo tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1 Các bước thực hiện
|
Bước
|
Nội dung
|
Thời gian
|
|
|
Tẩy nến
|
|
|
1
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 1)
|
2 phút
|
|
2
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen hoặc
dung dịch thay thế xylen (bể 2)
|
2 phút
|
|
3
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 3)
|
2 phút
|
|
4
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn tuyệt
đối
|
1 phút
|
|
5
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn 96%
(bể 1)
|
1 phút
|
|
6
|
Ngâm các tiêu bản vào cồn 96%
(bể 2)
|
1 phút
|
|
7
|
Ngâm các tiêu bản vào bể nước
chảy
|
2 phút
|
|
|
Nhuộm tiêu bản
|
|
|
8
|
Phủ tiêu bản với dung dịch
α–Amylase 1%
|
30 phút
|
|
9
|
Rửa các tiêu bản trong bể nước
chảy nhẹ
|
2 phút
|
|
10
|
Phủ các tiêu bản vào dung dịch
Acid periodic 0,5%
|
15 phút
|
|
11
|
Rửa các tiêu bản trong bể nước
chảy nhẹ
|
2 phút
|
|
12
|
Phủ các tiêu bản vào dung dịch
Schiff
|
20 phút
|
|
13
|
Rửa các tiêu bản trong bể nước
chảy nhẹ
|
5 phút
|
|
14
|
Phủ các tiêu bản vào dung dịch
Hematoxylin Mayer
|
1 phút
|
|
15
|
Rửa các tiêu bản trong bể nước
chảy
|
2 phút
|
|
|
Khử nước
|
|
|
16
|
Dội các tiêu bản bằng cồn 96%
|
5 giây
|
|
17
|
Ngâm các tiêu bản vào bể cồn
96%
|
30 giây
|
|
18
|
Ngâm các tiêu bản vào bể cồn
tuyệt đối (bể 3)
|
30 giây
|
|
19
|
Ngâm các tiêu bản vào bể cồn
tuyệt đối (bể 4)
|
30 giây
|
|
|
Gắn tiêu bản
|
|
|
20
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen hoặc
dung dịch thay thế xylen (bể 4)
|
30 giây
|
|
21
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 5)
|
30 giây
|
|
22
|
Ngâm các tiêu bản vào Xylen
hoặc dung dịch thay thế xylen (bể 6)
|
30 giây
|
|
23
|
Gắn lamelle bằng dung dịch gắn
|
|
|
24
|
Đánh giá chất lượng nhuộm và
bàn giao tiêu bản
|
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Phân tích kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE và
PAS nhằm xác định vùng tổn thương.
- Nội kiểm tra đánh giá tiêu bản
nhuộm chứng âm và chứng dương:
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm mẫu bệnh.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kỹ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
+ Tiêu chí đánh giá: Nhân tế bào
bắt màu xanh tím. Thành phần chứa glycogen trong bào tương không bắt màu hoặc bắt
màu hồng nhạt. Thành phần không phải glycogen trong bào tương bắt màu đỏ sáng.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh
theo các tiêu chí:
+ Tế bào/ thành phần cần đánh
giá dương tính hay âm tính
+ Vị trí dương tính (ổ hay lan
tỏa).
+ Mức độ dương tính (nếu cần).
- Đưa ra kết luận: Nhuộm PAS-D
dương tính hay âm tính cho thành phần nào.
4.2.2. Báo cáo kết quả xét nghiệm
và lưu trữ bệnh phẩm
- Trả kết quả theo các quy trình
liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và người
thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.
- Lưu khối nến và tiêu bản theo
quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Chứng âm nền:
- Nguyên nhân: thời gian khử
glycogen thành các phân tử nhỏ hơn như glucose, maltose chưa đủ.
- Khắc phục: Chú ý thời gian phủ
dung dịch enzym Amylase tuân thủ đúng, đảm bảo đúng nồng độ và điều kiện môi
trường.
5.2. Chứng dương âm tính:
- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; tẩy
màu quá lâu, mẫu hết không đạt tiêu chuẩn, thực hiện không đúng các bước trong
quy trình.
- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới;
cắt các tiêu bản chứng dương để test lại, và tìm mẫu chứng dương khác nhuộm
cùng để đối chứng, tuân thủ đúng theo quy trình kỹ thuật.
5.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm:
- Nguyên nhân: Mẫu cắt mất mô
do kỹ thuật cắt hoặc do máy cắt, dao cắt. Tiêu bản bị bóng nước, tiêu bản nhuộm
chưa khô, cắt mẫu trên lam thường. Tiêu bản khi thực hiện nhuộm bị nghiêng hoặc
hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc
nhuộm.
- Khắc phục: Dựa vào nguyên
nhân để loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng. Khi thấy trên mẫu bệnh phẩm có bóng nước
cần loại bỏ bóng, bọt khí, để tiêu bản khô hoàn toàn, cắt mẫu trên lam tích điện
dương có chất gắn. Cân bằng lại hệ thống máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực
hiện quy trình tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm tra chất
lượng:
+ Sử dụng mẫu chứng âm và mẫu
chứng dương đã đánh giá chất lượng
+ Nhuộm PAS-D trên mẫu chứng
khi nhập hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo
khuyến cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.
+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu
cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
+ Nếu không đạt yêu cầu, cần
tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục và đánh giá lại. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện
nhuộm cùng mẫu bệnh.
- Thực hiện ngoại kiểm: theo
chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng.
- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh
trang thiết bị
- Kiểm soát điều kiện môi trường
- Đào tạo thường xuyên nhân
viên về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo
tiêu chuẩn.
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế Hướng
dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào học
2. Dongtao A Fu, Martha
Campbell-Thompson (2017). Periodic Acid-Schiff Staining with Diastase, 1639:145-149.
doi: 10.1007/978-1-4939-7163-3
3. Mc Manus (1992). Diastase
digestion. Laboratory methods in histopathology - AFIP:153.
4. Bancroff JD, Gamble M
(2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th
edition:182-190.
5. Suvarna SK, Layton C,
Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier,
8th edition.
55. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
HEMATOXYLIN EOSIN TRÊN TIÊU BẢN MÔ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm hai màu Hematoxylin
Eosin.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Đây là phương pháp nhuộm đơn giản,
phối hợp hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần bằng phẩm nhuộm
Hematoxylin có tính baze, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần bằng phẩm
nhuộm Eosin có tính acid.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Hóa chất, Vật tư:
- Các hóa chất để thực hiện cố
định bệnh phẩm: Formol 10%; Formol đệm trung tính 10%, Bouin...
- Các vật tư, hóa chất để thực
hiện chuyển, xử lý bệnh phẩm, nhuộm màu: miếng lót bệnh phẩm, casset, bút ghi
cassett, Cồn tuyệt đối, Xylen, Toluen, Paraffin, Hematoxylin, Eosin,
Lithiumcarbonat, acid HCL, keo gắn lamen, lamen, lam kính, dao cắt mảnh...
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy đo pH điện tử.
- Máy chuyển, xử lý bệnh phẩm tự
động.
- Máy nhuộm tiêu bản tự động
- Máy đúc khối Paraffin.
- Bàn hơ tiêu bản.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút mùi phòng thí nghiệm.
- Bể nhuộm.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Là các khối nến chứa mẫu bệnh
phẩm đã qua quá trình cố định – chuyển – đúc.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Khối nến chứa bệnh phẩm cần
xét nghiệm được cắt mảnh và dán mảnh
- Tiến hành kỹ thuật nhuộm:
+ Tẩy paraffin trong 3 bể
toluen (hoặc xylen), mỗi bể 5 phút.
+ Qua 4 bể cồn giảm dần: 100º -
95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.
+ Rửa nước: nhúng 15 lần.
+ Nhuộm nhân bằng Hematoxylin:
3-5 phút hoặc lâu hơn.
+ Rửa nước chảy: 5-10 phút.
+ Kiểm tra màu của nhân qua
kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
+ Rửa nước chảy: 1 phút.
+ Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.
+ Rửa nước chảy: 1 phút.
+ Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º -
100º, mỗi bể 15 lần nhúng.
+ Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng
15 lần, bể III: 5-10 phút.
+ Gắn lamen
- Ngoài ra có thể thực hiện các
bước nhuộm theo quy trình cài đặt sẵn trên máy nhuộm tiêu bản tự động sau khi
tiêu bản được cắt mảnh dán trên lam kính.
- Kết quả:
Nhân tế bào: xanh đến xanh đen
Bào tương tế bào: hồng đến đỏ Hồng
cầu: hồng đậm Sợi tạo keo: hồng nhạt
4.2. Nhận định kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Bào tương và nhân đều bắt màu
nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.
- Nhân nhạt màu: tăng thời
gian nhuộm nhân.
- Nhân đậm màu quá mức:
tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
56. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA
TRÊN MẢNH CẮT MÔ PHÁT HIỆN HP
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm giemsa trên mẫu mô bệnh học nhằm
phát hiện vi khuẩn HP (Helicobacter pylori) .
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Sử dụng thuốc nhuộm giemsa để
phát hiện các vi khuẩn Helicobacter pylori bắt màu tím đỏ ở khe tuyến,
vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Hóa chất, Vật tư:
- Các vật tư, hóa chất để thực
hiện cố định chuyển, xử lý bệnh phẩm, nhuộm màu: Cồn, Giemsa, nước cất, keo gắn
lamen, lưỡi dao cắt lát mỏng…
- Bể nhuộm.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm
ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy đo pH điện tử.
- Máy chuyển, xử lý bệnh phẩm tự
động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ tiêu bản
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút phòng xét nghiệm.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm thực hiện xét
nghiệm này là các khối nến chứa mẫu phẩm cần xét nghiệm
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 1h30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
+ Khối nến chứa bệnh phẩm được
cắt mảnh và dán mảnh;
- Tiến hành kỹ thuật nhuộm
Giêmsa;
+ Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha
loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2
và được điều chỉnh bằng đệm photphat.
+ Mảnh cắt được tẩy nến như thường
lệ (qua xylen, hoặc toluen, cồn).
+ Rửa nước.
+ Nhuộm tiêu bản trong dung dịch
Giemsa đã pha loãng trong 30 phút đến 1 giờ.
+ Rửa nước
+ Biệt hóa trong acid acetic
loãng (1 giọt acid acetic với 100ml nước cất)
+ Rửa nước
+ Loại phẩm thừa bằng cồn 95°
+ Loại nước bằng cồn và làm
trong bằng xylen
+ Gắn lamen
- Kết quả:
Các vi khuẩn Helicobacter
pylori (HP) bắt màu tím đỏ.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ (kết hợp cùng tiêu bản nhuộm
Hematoxylin – Eosin), từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Các mảnh cắt quá dầy, không
có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.
- Dung dịch dán mảnh cắt bị nhiễm
khuẩn: sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay dung dịch
dán mảnh cắt.
- Thời gian nhuộm lâu hoặc nồng
độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định kết
quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.
- Nước dùng để rửa có nhiều cặn
bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn nước sạch
và sử dụng lõi lọc nếu cần.
- Thuốc nhuộm cũng có thể bị cặn
và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc nhuộm
mới.
- Dung dịch Giemsa pha loãng chỉ
pha trước khi nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
57. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS KẾT HỢP
XANH ALCIAN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình nhuộm PAS kết hợp
Xanh Alcian được sử dụng để phát hiện và phân biệt giữa các loại polysaccharide
và glycoprotein trong mô. PAS dùng để nhuộm glycogen và một số glycoprotein,
trong khi Xanh Alcian chuyên dùng để nhuộm acid mucopolysaccharide. Kết hợp cả
hai giúp xác định vị trí và loại của các thành phần carbohydrate trong mô, hỗ
trợ chẩn đoán các tình trạng bệnh lý như fibrosis, các bệnh về gan và bệnh lý
tiêu hóa..
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Nhuộm PAS kết hợp Xanh Alcian
là một kỹ thuật nhuộm trong mô bệnh học, sử dụng để phân biệt các thành phần carbohydrate
trong mô. PAS nhuộm glycogen, glycoprotein, và mucin không chứa acid, tạo ra
màu hồng/magenta. Xanh Alcian được dùng để nhuộm acid mucopolysaccharide và
glycosaminoglycan, tạo màu xanh. Kết hợp hai phương pháp này cho phép xác định
rõ ràng vị trí và loại của các carbohydrate, hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý có
liên quan đến các biến đổi của carbohydrate trong mô.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư, hóa chất:
- Các vật tư, hóa chất để thực
hiện chuyển bệnh phẩm, nhuộm màu: miếng lót bệnh phẩm, casset, bút ghi cassett,
Cồn tuyệt đối, Xylen, Toluen, Paraffin, bể nhuộm, giá đựng tiêu bản...
- Các vật tư, hóa chất để thực
hiện nhuộm: thuốc thử Shiff, acid periodic, xanh alcian, Hematoxyline, keo gắn
phiến kính, phiến kính, lam kính, dao cắt mảnh...
2.3. Trang thiết bị:
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi
cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol
0%, Bouin…) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần
thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 4 - 24 giờ tuỳ theo kích thước mảnh bệnh
phẩm to hay nhỏ.
- Sau khi cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
+ Chuyển bệnh phẩm
+ Vùi Paraffin
+ Đúc khối Paraffin
+ Cắt mảnh và dán mảnh.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 60 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Khi thực hiện nhuộm PAS kết hợp
Xanh Alcian, cần tuân thủ các biện pháp an toàn như sử dụng găng tay, kính bảo
hộ, và làm việc trong tủ hút khí để tránh tiếp xúc với hóa chất độc hại. Cần bảo
quản và xử lý hóa chất cẩn thận, theo dõi và tuân thủ hướng dẫn về an toàn hóa
chất và tiêu hủy chất thải theo quy định.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
+ Nhuộm tiêu bản
- Tiến hành kỹ thuật
+ Tẩy parafin bằng 3 bể toluen
(xylen), mỗi bể 2 phút.
+ Chuyển vào các bể cồn 100°,
95°, 80°, 70° mỗi bể 2 phút.
+ Ngâm trong nước cất: 10 phút.
+ Phiến đồ đã cố định, nhuộm 20
phút trong dung dịch nước xanh Alcian 0,1%.
+ Rửa và nhúng 6 phút trong
dung dịch nước acid photphomolybdic.
+ Rửa cẩn thận trong nước cất
10 phút.
+ Rửa nước cất 5 phút.
+ Nhuộm thuốc thử Schiff trong
60 phút.
+ Nhúng vào dung dịch Bisunfit
Natri 3 lần, cách nhau 20 phút.
+ Rửa nước chảy trong 5 phút.
+ Lần lượt cho qua cồn có nồng
độ cao dần (70°, 80°, cồn tuyệt đối).
+ Làm trong và gắn lá kính như
thường lệ.
4.2. Nhận định kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học: Chất
nhày acid có màu xanh.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tiêu bản bị gấp, xước, rách,
nhăn.....
- Chú ý kiểm tra chất lượng
acid periodic, thuốc thử schiff, nồng độ xanh alcian...
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
58. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DIFF -
QUICK
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mục đích của phương pháp này là
cung cấp kết quả nhanh chóng, cho phép phân biệt giữa các loại tế bào khác nhau
và nhận diện các dấu hiệu bệnh lý, hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng trong thời gian ngắn..
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Là phương pháp nhuộm dựa trên sự
cải biên của phương pháp nhuộm Wright Giemsa của Bernard Witlin năm 1970. Nó có
ưu điểm hơn phương pháp nhuộm Wright Giemsa, vì các bước nhuộm đơn giản hơn, ít
tốn thời gian hơn và cho phép tìm bạch cầu ái toan hay ái kiềm bằng cách thay đổi
thời gian nhuộm. Vì vậy, nó là phương pháp nhuộm nhanh tế bào và mô, được áp dụng
cho nhiều loại bệnh phẩm, từ chọc hút kim nhỏ, phiến đồ Tế bào học bong, phiến
đồ Tế bào học áp, tinh dịch đồ. Phiến đồ nhuộm Diff - Quik cần để khô trong
không khí trước khi cố định, không cố định khi phiến đồ còn ướt. Phương pháp
nhuộm này giúp đánh giá chi tiết bào tương tế bào, các giọt lipid, các hạt chế
tiết, chất nhầy, các chất ngoại bào như chất nhầy, các sợi keo. Các thành phần
như vi khuẩn, nấm cũng dễ dàng phát hiện được bằng phương pháp nhuộm này.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư, hóa chất:
- Dung dịch cố định bệnh phẩm:
Cồn tuyệt đối, cồn ete…
- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm
phiến đồ Diff - Quick
- Nước cất, nước sạch để rửa
thuốc nhuộm trên phiến kính.
- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản,
lam kính, phiến kính, dung dịch gắn phiến kính…
2.3. Trang thiết bị:
- Máy nhuộm tiêu bản
- Kính hiển vi quang học, bàn
có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi
- Sổ hoặc máy tính ghi lại
thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.
- Các sọt rác đựng rác thải y tế,
rác thải thường.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Lấy bệnh phẩm:
+ Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
+ Phiến đồ được cố định trong cổn
tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 60 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
Phiến đồ được cố định trong cồn
tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây
Nhuộm dung dịch 1: 20 giây
Nhuộm dung dịch 2: 20 giây
Rửa nước cất: 10 giây
Cồn etanol 95°: 10 giây
Cồn tuyệt đối: 15 giây
Xylen: 15 - 20 giây
Gắn lá kính bằng bôm Canada
- Kết quả:
+ Hồng cầu: màu hồng/vàng đỏ.
+ Tiểu cầu: màu tím/hạt màu
tím.
+ Bạch cầu đa nhân trung tính:
nhân màu xanh, bào tương màu hồng tím.
+ Bạch cầu ái toan: nhân màu
xanh, bào tương màu xanh, các hạt màu đỏ.
+ Bạch cầu ưa kiềm: nhân màu
tím hoặc xanh đen.
+ Bạch cầu đơn nhân: nhân màu
tím, bào tương xanh sáng.
+ Vi khuẩn: màu xanh.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phiến đồ bị mất tế bào vào
trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.
- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ
nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất chống bong
- Các tế bào dày, chồng chất: lấy
lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay
- Các tế bào bắt màu quá kém: cần
cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt
- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc
nhuộm bằng cồn tuyệt đối.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
59. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
GIEMSA
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm giemsa.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Các vi khuẩn bắt màu tím đỏ ở
khe tuyến, vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày và các mô khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư, hóa chất:
Các vật tư, hóa chất để thực hiện
chuyển bệnh phẩm, nhuộm màu: Cồn, Giemsa, nước cất, lam kính, phiến kính, keo gắn
phiến kính, bể nhuộm, giá đựng tiêu bản...
2.3. Trang thiết bị:
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ tiêu bản.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được
đưa ngay vào dung dịch cố định (Formol đệm trung tính 10%, Formol 10%, Bouin..)
với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh
phẩm. Thời gian cố định từ 4 -24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
- Sau khi cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
+ Chuyển bệnh phẩm
+ Vùi Paraffin
+ Đúc khối Paraffin
+ Cắt mảnh và dán mảnh
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 45 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
+ Nhuộm tiêu bản
- Tiến hành kỹ thuật
+ Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha
loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2 –
7,6 và được điều chỉnh bằng đệm photphat.
+ Mảnh cắt được tẩy nến như thường
lệ (qua xylen, cồn).
+ Rửa nước
+ Nhuộm tiêu bản trong dung dịch
Giemsa đã pha loãng trong 1 giờ.
+ Rửa nước
+ Biệt hóa trong acid acetic
loãng (1 giọt acid acetic với 100ml nước cất)
+ Rửa nước
+ Loại phẩm thừa bằng cồn 95°
+ Loại nước bằng xylen
+ Gắn lá kính bằng bôm Canada
+ Kết quả: Các vi khuẩn bắt màu
tím đỏ.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Các mảnh cắt quá dầy,
không có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.
- Dung dịch dán mảnh cắt
bị nhiễm khuẩn: sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay
dung dịch dán mảnh cắt.
- Thời gian nhuộm lâu hoặc
nồng độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định
kết quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.
- Nước dùng để rửa có
nhiều cặn bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn
nước sạch và sử dụng lõi lọc nếu cần.
- Thuốc nhuộm cũng có thể
bị cặn và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc
nhuộm mới.
- Dung dịch Giemsa pha
loãng chỉ pha trước khi nhuộm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
60. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
GOMORI
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Gomori.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dựa vào tính ưa bạc của sợi
võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi
đặc biệt này. Hai phương pháp nhuộm sợi võng thông dụng nhất là Gomori và
Gordon – Sweet. Bước đầu tiên của quy trình là thực hiện oxy hóa chất đường
hexose có trong sợi võng để tạo ra aldehit. Bước tiếp theo làm “tăng độ nhạy”
do lắng đọng thành phần kim loại (ammonium sunfat) quanh sợi võng. Hiện tượng tẩm/ngấm
bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc ammoniac bị oxy hóa tạo ra
aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt được chuyển vào trong
formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng, kim loại vàng có trong
clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc nét” sợi võng, làm
chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư, hóa chất:
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm gomori
- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản,
lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính…
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Phiến kính , keo gắn phiến kính
- KHV quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được
đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 10%, Bouin…)
với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh
phẩm. Thời gian cố định từ 4 -24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
- Sau khi cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
+ Chuyển bệnh phẩm
+ Vùi Paraffin
+ Đúc khối Paraffin
+ Cắt mảnh và dán mảnh
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 90 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Nên dùng bình thót cổ
đựng dung dịch bạc và khuấy kỹ mỗi khi thêm một giọt amoniac, vì nếu thêm quá
nhiều amoniac sẽ làm cho dung dịch bạc kém tác dụng. Dung dịch bạc có thể pha
hàng ngày trước sử dụng, nếu cần thiết.
- Dung dịch bạc amoniac
có thể cất trữ ở 4°C trong vài tuần. Dung dịch này có thể nổ, nếu để tiếp xúc tực
tiếp với ánh sáng mặt trời.
- Thời gian xử lý bằng
dung dịch bạc – amoniac rất khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và hiệu
lực của dung dịch bạc.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
61. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
RETICULINE
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Reticuline.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dựa vào tính ưa bạc của sợi
võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi
đặc biệt này. Hiện tượng tẩm/ngấm bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc
ammoniac bị oxy hóa tạo ra aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt
được chuyển vào trong formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng,
kim loại vàng có trong clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc
nét” sợi võng, làm chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư:
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm Reticuline
- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản,
lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính…
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Phiến kính , keo gắn phiến
kính
- KHV quang học
- Máy nhuộm đặc biệt
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được
đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 105, Bouin…)
với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh
phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
- Sau khi cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
+ Chuyển bệnh phẩm
+ Vùi Paraffin
+ Đúc khối Paraffin
+ Cắt mảnh và dán mảnh
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:
ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên
khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 90 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Tiêu bản sau khi được
cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình
nhuộm
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Nên dùng bình thót cổ
đựng dung dịch bạc và khuấy kỹ mỗi khi thêm một giọt amoniac, vì nếu thêm quá
nhiều amoniac sẽ làm cho dung dịch bạc kém tác dụng. Dung dịch bạc có thể pha
hàng ngày trước sử dụng, nếu cần thiết.
- Dung dịch bạc amoniac
có thể cất trữ ở 4°C trong vài tuần. Dung dịch này có thể nổ, nếu để tiếp xúc tực
tiếp với ánh sáng mặt trời.
- Thời gian xử lý bằng
dung dịch bạc – amoniac rất khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và hiệu
lực của dung dịch bạc.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen Handling
in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.
62. NHUỘM ZIEHL – NEELSEN TÌM VI KHUẨN LAO TRONG TỔ CHỨC
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn quy trình,
cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm ziehl - neelsen.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Dựa vào đặc tính kháng cồn,
kháng toan của vi khuẩn có trong tổ chức để tiến hành nhuộm màu và quan sát dưới
kính hiển vi quang học
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Vật tư:
- Dung dịch cố định bệnh phẩm
- Cồn (70°, 80°, 95°, 100°).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Dung dịch fucshin 0,3%
- Dung dịch Phenol
- Dung dịch HCL 3%
- Cồn ethylic 95°
- Dung dịch methylen 0,3%
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Giá đựng tiêu bản
- Dung dịch tẩy nến
- Dung dịch dầu khoáng
- Dung dịch rửa
- Bộ kít nhuộm Ziehl Neelsen
(khi nhuộm tự động)
- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản,
lam kính, lamen, keo gắn lamen…
- Găng tay, kính phòng hộ, khẩu
trang...
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- Máy đo độ pH điện tử
- Kính hiển vi quang học
- Hệ thống chụp ảnh gắn với
kính hiển vi
- Máy nhuộm đặc biệt
- Tủ lưu tiêu bản
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được
đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 10%, Bouin…)
với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh
phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
- Sau khi cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
+ Chuyển bệnh phẩm
+ Vùi parafin
+ Đúc khối parafin
+ Cắt mảnh và dán mảnh
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 90 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
4.1.1. Quy trình nhuộm thủ công
- Cắt và dán mảnh
+ Cắt mảnh với độ dày 2-4µm. Lấy
các lát cắt đạt tiêu chuẩn (mỏng đều, không rách, không xước, không nhăn và lấy
hết mặt bệnh phẩm).
+ Dùng que tãi, đưa nhẹ nhàng
các lát cắt vào phiến kính (có mã số của bệnh phẩm) đã nhúng qua albumin, đặt
lên bàn hơ hoặc thả các lát cắt vào khay nước ấm, để mảnh cắt dãn đều rồi vớt mảnh
cắt, đặt lên phiến kính đã được tráng Albumin.
+ Dựng tiêu bản trên giá đựng
tiêu bản.
+ Đưa tiêu bản vào tủ ấm 37°C.
- Nhuộm tiêu bản
+ Cố định bệnh phẩm 30
phút ở 70 °C
+ Ngâm vào 3 bể xylen, mỗi bể 5
phút
+ Ngâm vào 3 bể cồn ( 80°, 90°,
96° ) mỗi bể 5 phút
+ Rửa nước 5 phút
+ Nhỏ dung dịch Fuchsin phủ kín
bệnh phẩm
+ Hơ nóng cho bốc hơi 3 lần (
không được sôi ), để nguội
+ Rửa nước
+ Tẩy màu bằng dung dịch cồn
acid cho đến khi phai hết màu đỏ
+ Rửa nước
+ Nhỏ dung dịch xanh methylene
phủ kín bệnh phẩm trong 1 phút
+ Rửa nước
+ Khử nước bằng cồn rồi qua
xylen và gắn lamen
4.1.2. Quy trình nhuộm tự động
- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ
dày 2-4 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm.
- Chuẩn bị các bình hóa chất
cho máy và bộ kit nhuộm
- Tiêu bản được mã hóa và dán
barcode để máy có thể nhận biết được
- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm
và thực hiện quy trình nhuộm tự động
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Chú ý hạn sử dụng hóa
chất
- Thường xuyên kiểm tra hệ thống
rửa của máy
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
63. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN
TỬ QUÉT
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Chuẩn bị mô y sinh học và vi
sinh vật để soi trên kính hiển vi điện tử quét, quan sát cấu trúc siêu vi thể bề
mặt mẫu.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng để quan sát bề
mặt mẫu kích thước cỡ nanomet dùng trong chẩn đoán, nghiên cứu và soi đặc điểm
hình dạng cấu trúc bên ngoài mô.
Nguyên lý của phương pháp là
các mô sẽ được cố định, làm khô, mạ phủ bằng kim loại nặng để chùm điện tử
electron có thể quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện
thông qua ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử
với bề mặt mẫu vật.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 02
- Kỹ thuật viên: 02
2.2. Vật tư, phương tiện,
hoá chất
- Chai, lọ thủy tinh có nắp đựng
hóa chất và mẫu (Số lượng lọ phụ thuộc vào số lượng mẫu)
- Dung dịch khử khoáng (đối với
các mẫu mô xương, răng)
- Dung dịch glutaraldehyde
- Dung dịch đệm cacodylat
- Dung dịch axit Osmic
- Bộ dụng cụ tiểu phẫu (Gồm
dao, kéo, nỉa, kẹp có mấu và không mấu)
- Effpendof 0,5ml
- Cồn 96° (để pha các nồng độ
khác nhau)
- Cồn tuyệt đối
- Nước cất
- Giấy lọc
- Băng dính cacbon
- Kính phòng hộ: 03 chiếc
- Acetone
- T-Butyl
- Isoamyl acetate
- Ống hút nhựa
- Xilanh 5ml
- Găng tay, khẩu trang, kính bảo
vệ mắt và quần áo bảo hộ: 03 bộ.
- Dung dịch khử trùng (Cồn 96°)
dùnglàm sạch dụng cụ,
- Kim loại mạ phủ: Vàng,
Platinum, Palladium hoặc Chromium...
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống kính hiển vi điện tử
quét,
- Máy mạ phủ
- Máy bốc bay hơi
- Máy làm khô mẫu ở điểm tới hạn
- Máy kiểm tra độ pH dung dịch
- Tủ lạnh, hộp cách nhiệt chứa đá
khô hoặc đá lạnh để lưu giữ và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút phòng thí nghiệm.
- Kính soi nổi
- Cân vi lượng.
- Vòi nước chảy, các dụng cụ
- Chai thủy tinh có nắp để đựng
bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem hủy.
- Bình có chứa dung dịch cố định
để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Với mẫu mô y sinh học
tươi
- Lấy bệnh phẩm: Tiến hành như
quy trình thường quy giải phẫu bệnh.
Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
các khoa lâm sàng, phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu và gửi bệnh phẩm về các
phòng nghiên cứu siêu cấu trúc.
- Thu thập mẫu bệnh phẩm:
+ Đo chiều dài mảnh sinh thiết
+ Vẽ hoặc chụp lại hình ảnh mẫu
+ Mẫu có kích thước 0,5 x 0,5 x
0,5 cm.
+ Cố định ngay trong lọ đựng
3-5ml dung dịch glutaraldehyde 2,5% .
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm:
- Có ghi đầy đủ thông tin theo
quy đinh (họ tên người bệnh, tuổi, giới, tên khoa phòng yêu cầu xét nghiệm),
- Có ghi ngày vào viện, chẩn
đoán lâm sàng, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian phương pháp, vị trí, lấy mẫu bệnh
phẩm, số lượng bệnh phẩm).
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên người yêu cầu xét nghiệm.
- Có phần mô tả đại thể:
+ Loại mô xét nghiệm
+ Vùng lấy bệnh phẩm
+ Số lượng bệnh phẩm lấy xét
nghiệm
+ Màu sắc bệnh phẩm
+ Kích thước bệnh phẩm
+ Đặc điểm hình thái diện cắt
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm mô bệnh học, giải phẫu bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị mẫu, hóa chất
và chất đúc
4.1.1. Chuẩn bị mẫu
- Lấy mẫu từ mô y sinh học:
Lấy mẫu từ mô tươi tốt hơn mô
đã được cố định thường quy. Cần nhanh chóng lấy mẫu ngay khi bệnh phẩm được lấy
ra khỏi cơ thể.
Đặt bệnh phẩm lên thớt nhựa cứng
hoặc thớt thủy tinh sạch.
Nhỏ vài giọt dung dịch bảo quản
glutaraldehyde 2,5% lên vùng khác của tấm thớt, đặt các lát cắt mô lên phía
trên và phủ lên trên với vài giọt dung dịch glutaraldehyde 2,5%.
Pha nhỏ các lát cắt thành những
khối 1mm3 bằng dao sắc và nhúng bệnh phẩm vào dung dịch
glutaraldehyde 2,5% lạnh (4°C).
Lấy 3-5 mảnh mô là đủ. Nếu bệnh
phẩm có nhiều vùng tổn thương khác nhau trên đại thể, cần lấy riêng và đưa đến
phòng xét nghiệm hiển vi điện tử trong những lọ riêng biệt.
Mô có thể được giữ trong dung dịch
cố định dùng cho hiển vi điện tử trong nhiều ngày ở 4°C (không quá 30 ngày) trước
khi đưa đến phòng xét nghiệm hiển vi điện tử.
- Lấy mẫu y sinh học từ mô
được cố định bảo quản
Mô đã được cố định bảo quản
trong formol trung tính 10% và các dung dịch bảo quản khác.
Cắt bỏ lát mỏng 1mm từ bờ của bệnh
phẩm nơi tiếp xúc trực tiếp với dung dịch cố định, cho vào trong bình nước ngâm
rửa dưới vòi nước sạch liên tục 48h.
Sau đó tiến hành như đối với mô
tươi.
- Các mẫu xương: được khử
khoáng bằng dung dịch ethylen diamin tetra acetic (EDTA) 5%, thời gian khử
khoáng từ 15 đến 20 ngày (thường sử dụng 25 - 30 ml dung dịch EDTA 5% cho một
gam xương).
Tiến hành khử khoáng như sau:
Dùng một lớp gạc bọc các mẫu xương, lấy một sợi chỉ buộc và treo mẫu lơ lửng
trong lọ dung dịch để mẫu được tiếp xúc đều với dung dịch khử khoáng. Hàng ngày
lắc đều dung dịch khử khoáng từ 1 đến 2 lần. Sau mỗi tuần thay dung dịch mới.
Cuối tuần thứ 2 kiểm tra kết quả khử khoáng bằng các phương pháp sau:
+ Phương pháp cơ học: Dùng kim
khâu xuyên vào cạnh mẫu xương, khi kim xuyên qua mà có cảm giác mềm tay là quá
trình khử khoáng đã hoàn thành.
+ Phương pháp hoá học: Lấy 1 ml
dung dịch amoni oxalat NH4C2O4 5% hay natri
oxalat Na2 C2O4 5%; cho một trong hai dung dịch
vào dung dịch khử khoáng, nếu có tủa là sự khử khoáng chưa hoàn thành.
4.1.2. Chuẩn bị dung dịch
để rửa và cố định mẫu
- Chuẩn bị đệm cacodylate 0,2M
và 0,3M
- Chuẩn bị dung dịch cố định
glutaraldehyde 2,5%
- Chuẩn bị dung dịch axit Osmic
1%
- Dung dịch cồn các nồng độ:
50°, 70°, 80°, 85°, 90°, 95°
- Chuẩn bị các dung dịch khác
4.2. Tiến hành xử lý mẫu cho
nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét
1. Rửa lại mẫu bằng đệm
cacodylat 0,3M, 2 lần x 10 phút/lần.
2. Cố định mẫu trong
glutaraldehyd 2,5% trong 12 giờ (để qua đêm), ở 40°C;
3. Rửa mẫu bằng đệm cacodylat
0,1M, 2 lần x 10 phút/lần;
4. Cố định bổ sung bằng axit
osmic 1% trong 4-6 giờ), ở 40°C;
5. Rửa lại mẫu bằng đệm
cacodylat 0,1M, 2 lần x 10 phút/lần.
6. Khử nước các mẫu theo qui
trình:
- Cồn ethanol 50°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 70°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 80°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 90°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 95°, 2 lần x 15
phút/lần;
- Cồn ethanol 100°, 2 lần x 15
phút/lần.
7. Làm khô mẫu:
Tùy thuộc vào loại mẫu mà áp dụng
các phương pháp làm khô khác nhau như sau:
- Làm khô tự nhiên (đối với các
mẫu mô có bề mặt tương đối rắn chắc: xương, răng, tóc, móng…) bằng cách khử cồn
trong các mẫu xương bằng ether:
+ Cồn ethanol 100°, ether
nguyên chất (tỉ lệ 1/1) x 20 phút/lần x1 lần;
+ Ether nguyên chất x 20 phút/lần
x 1 lần;
+ Làm khô mẫu trong không khí.
- Làm khô bằng bốc bay (đối với
các mẫu mô mềm) bằng cách khử cồn ethanol trong các mẫu mô bằng T – Butyl:
+ Ngâm các mẫu mô trong cồn T -
Butyl x 30 phút/lần x 3 lần. Sau lần 3 để trong ngăn đá tủ lạnh 30 phút đến 1
giờ để cồn T - Butyl chuyển dạng tinh thể.
+ Bốc bay cồn T - Butyl trong
2-5h.
- Làm khô tại điểm tới hạn (là
phương pháp tối ưu nhất để bảo tồn bề mặt mẫu) được thực hiện bằng máy làm khô
tại điểm tới hạn với các bước chính sau:
+ Ngâm các mẫu trong isoamyl
acetate;
+ Thay thế isoamyl acetate bằng
CO2 lỏng;
+ Làm bay hơi CO2 lỏng
ở điểm tới hạn.
8. Mạ phủ mẫu:
Gắn mẫu trên đế mang mẫu của
kính hiển vi điện tử quét bằng băng dính cacbon, hướng bề mặt quan sát lên
trên.
Mạ phủ mẫu bằng vàng/Palladium
dày 40-60nm trong thời gian 45 - 60 giây, hoặc có thể mạ phủ mẫu bằng cacbon và
sau đó là đồng trên máy mạ phủ mẫu.
9. Soi trên kính HVĐT quét.
Đưa mẫu vào máy, vận hành, soi
và chụp ảnh theo quy trình và mục đích cần đánh giá, nghiên cứu.
4.3. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ Giải phẫu bệnh
đọc trên kính hiển vi điện tử quét
4.4. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNGXỬ
TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Pha mẫu gây tổn
thương, bầm rập mẫu; Sử dụng lưỡi dao sắc, cắt gọn 1 thì, không cứa, kéo mẫu.
Dùng nỉa chuyên dụng giữ mẫu.
- Cố định nhầm vào dung dịch
khác: loại bỏ và lấy lại bệnh phẩm mới
- Không kịp thời cố định ngày
trong dung dịch glutaraldehyd, thời gian cố định không đủ. Bệnh phẩm dính vào
thành lọ đựng mẫu, không được ngâm trong dung dịch cố định làm hỏng bệnh phẩm:
nên cho lượng dung dịch đủ quy định vào lọ trước khi pha và thả bệnh phẩm ngập
trong dung dịch, sau đó đậy nắp và lắc đều lọ đựng mẫu.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Mạ phủ nhầm mặt cắt và vùng định
quan sát: Mạ phủ lại
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
+ Tiêu bản nhăn, rách: Có thể
do: Chất đúc không đạt yêu cầu, tủ ấm không bảo đảm nhiệt độ, do bản thân mẫu
+ Tiêu bản bị quá nhạt hoặc quá
đậm: Kiểm tra lại hóa chất và thời gian nhuộm
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi Huyền Trác (1976),
Các kỹ thuật hiển vi học, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
2. Jeol – Serving
Advanced Technology, A guide to Scanning Microscope Observation
3. Murtey, M. D., &
Ramasamy, P. (2016). Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy –
Life Sciences. InTech. doi: 10.5772/61720
4. Chris G. Jones (2012),
Scanning Electron Microscopy: Preparation and Imaging for SEM, Methods Mol
Biol. 2012;915:1-20. doi: 10.1007/978-1-61779-977-8_1.
64. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN
TỬ TRUYỀN QUA
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Chuẩn bị tiêu bản mô y sinh học
để soi trên kính hiển vi điện tử truyền qua, quan sát cấu trúc siêu vi thể.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật này dùng để quan sát cấu
trúc ở cấp độ siêu vi thể kích thước cỡ nanomet các mẫu mô y sinh học, dùng
trong chẩn đoán, nghiên cứu và đánh giá đặc điểm cấu trúc mô.
Nguyên lý của phương pháp là
các mô sẽ được cố định, cắt lát và nhuộm để chùm điện tử electron có thể bắn
xuyên qua các lát cắt ở mức siêu mỏng, mức độ cản điện tử tại các vị trí sẽ
khác nhau cho ra hình ảnh mẫu.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 02
- Kỹ thuật viên: 02
2.2. Vật tư, phương tiện,
hoá chất
- Chai, lọ, cốc thủy tinh đựng
hóa chất và mẫu (Số lượng phụ thuộc vào số mẫu)
- Xylen,
- Dung dịch khử khoáng (đối với
các mẫu mô xương, răng)
- Dung dịch Glutaraldehyde
2,5%.
- Dung dịch đệm cacodylat
- Dung dịch axit Osmic
- Bộ dụng cụ tiểu phẫu (Gồm
dao, kéo, nỉa, kẹp có mấu và không mấu)
- Effpendof 0,5ml
- Bình phun nước 500 ml.
- Cồn 96° (để pha các nồng độ
khác nhau)
- Cồn tuyệt đối
- Nước cất
- Giấy lọc
- Parafin dạng băng cuộn
- Lam kính, lamen sạch.
- Keo gắn lamen
- Lưới đồng
- Nỉa gắp lưới đồng (chuyên dụng)
- Propylen oxit
- Bộ chất đúc epon hoặc
colodion
- Khuôn đúc block
- Formvar (làm màng lưới đồng)
- Chloroform
- Ethanol
- Xanh Toludin 1%
- Hóa chất nhuộm tương phản:
+ Dung dịch kim loại nặng: dung
dịch Uranyl acetat 1%, dung dịch chì citrat.
+ Dung dịch NaOH.
- Ống hút nhựa (pipet nhựa)
- Xilanh 5ml
- Đĩa petri kích thước 10cm.
- Đầu lọc thuốc nhuộm siêu cấu
trúc
- Giá đựng tiêu bản, nhãn dán,
bút ghi nhãn (bút chì và bút mực)
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
- Găng tay, khẩu trang, kính bảo
vệ mắt và quần áo bảo hộ: 02 bộ.
- Dung dịch khử trùng, vệ sinh,
2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống kính hiển vi điện tử
truyền qua,
- Tủ lạnh, hộp cách nhiệt chứa
đá khô hoặc đá lạnh để lưu giữ và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
- Máy rửa siêu âm (rửa lưới đồng)
- Tủ ấm; Máy kiểm tra độ pH
dung dịch
- Máy Gọt block;
- Máy cắt dao thủy tinh;
- Máy cắt lát siêu mỏng
(ultramicrotom), có dao kim cương và dao thủy tinh
- Kính hiển vi quang học;
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút phòng thí nghiệm.
- Kính hiển vi soi nổi
- Cân vi lượng.
- Vòi nước chảy, các dụng cụ
- Chai thủy tinh có nắp để đựng
bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem hủy.
- Bình có chứa dung dịch cố định
để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Với mẫu mô y sinh học
tươi
- Lấy bệnh phẩm: Tiến hành như
quy trình thường quy giải phẫu bệnh.
Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
các khoa lâm sàng, phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu và gửi bệnh phẩm về các
phòng nghiên cứu siêu cấu trúc.
- Thu thập mẫu bệnh phẩm:
+ Đo chiều dài mảnh sinh thiết
+ Vẽ hoặc chụp lại hình ảnh mẫu
+ Mẫu có kích thước 0,5 x 0,5 x
0,5 cm.
+ Cố định ngay trong lọ đựng
3-4ml dung dịch glutaraldehyde 2,5% có đệm.
Với mẫu mô đã đúc
paraffin: Sử dụng mẫu đã đúc trong block khối nến. Khử nến trong tủ ấm ở
56°C và Xylen. Sau đó cố định ngay trong lọ đựng glutaraldehyd 2,5% có đệm.
Với mẫu y sinh học đã qua
cố định bảo quản:
- Lấy bệnh phẩm ra khỏi dung dịch
cố định bảo quản, cắt bỏ phía ngoài mô, khoảng 1mm từ bờ ngoài. Tiến hành ngâm
rửa mẫu trong bình dưới vòi nước sạch chảy liên tục 48h.
- Sau đó tiến hành như với mô
tươi.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm:
- Có ghi đầy đủ thông tin theo
quy đinh (họ tên người bệnh, tuổi, giới, tên khoa phòng yêu cầu xét nghiệm),
- Có ghi ngày vào viện, chẩn
đoán lâm sàng, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian phương pháp, vị trí, lấy mẫu bệnh
phẩm, số lượng bệnh phẩm).
- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm,
tên người yêu cầu xét nghiệm.
- Có phần mô tả đại thể:
+ Loại mô xét nghiệm
+ Vùng lấy bệnh phẩm
+ Số lượng bệnh phẩm lấy xét
nghiệm
+ Màu sắc bệnh phẩm
+ Kích thước bệnh phẩm
+ Đặc điểm hình thái diện cắt
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm mô bệnh học, giải phẫu bệnh.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị mẫu, hóa chất
và chất đúc
4.1.1. Chuẩn bị mẫu
- Lấy mẫu từ mô tươi:
Lấy mẫu từ mô tươi tốt hơn mô đã
được cố định thường quy. Cần nhanh chóng lấy mẫu ngay khi bệnh phẩm được lấy ra
khỏi cơ thể.
Đặt bệnh phẩm lên thớt nhựa cứng
hoặc thớt thủy tinh sạch.
Nhỏ vài giọt dung dịch bảo quản
glutaraldehyde 2,5% lên vùng khác của tấm thớt, đặt các lát cắt mô lên phía
trên và phủ lên trên với vài giọt dung dịch glutaraldehyde 2,5%.
Pha nhỏ các lát cắt thành những
khối 1mm3 bằng dao sắc và nhúng bệnh phẩm vào dung dịch
glutaraldehyde 2,5% lạnh (4°C).
Lấy 5-15 mảnh mô là đủ. Nếu bệnh
phẩm có nhiều vùng tổn thương khác nhau trên đại thể, cần lấy riêng và đưa đến
phòng xét nghiệm hiển vi điện tử trong những lọ riêng biệt.
Mô có thể được giữ trong dung dịch
cố định dùng cho hiển vi điện tử trong nhiều ngày ở 4°C (không quá 30 ngày) trước
khi đưa đến phòng xét nghiệm hiển vi điện tử.
- Lấy mẫu từ mô được cố định
thường quy
Mô cố định thường qui là mô được
cố định trong formol trung tính 10% có thể có nhiều lỗi gây ra do cố định,
nhưng những hình thái cần đánh giá trên kính hiển vi điện tử để chẩn đoán vẫn
còn được bảo tồn (như các cầu liên bào, hạt chế tiết thần kinh, hạt sắc tố, các
bào quan, màng, nhân tế bào...). Cách tiến hành lấy mẫu như sau:
Cắt bỏ lát mỏng 1mm từ bờ của bệnh
phẩm nơi tiếp xúc trực tiếp với dung dịch cố định.
Sau đó tiến hành như đối với mô
tươi.
- Các mẫu xương: được khử
khoáng bằng dung dịch ethylen diamin tetra acetic (EDTA) 5%, thời gian khử
khoáng từ 15 đến 20 ngày (thường sử dụng 25 - 30 ml dung dịch EDTA 5% cho một
gam xương).
Tiến hành khử khoáng như sau:
Dùng một lớp gạc bọc các mẫu xương, lấy một sợi chỉ buộc và treo mẫu lơ lửng
trong lọ dung dịch để mẫu được tiếp xúc đều với dung dịch khử khoáng. Hàng ngày
lắc đều dung dịch khử khoáng từ 1 đến 2 lần. Sau mỗi tuần thay dung dịch mới.
Cuối tuần thứ 2 kiểm tra kết quả khử khoáng bằng các phương pháp sau:
+ Phương pháp cơ học: Dùng kim
khâu xuyên vào cạnh mẫu xương, khi kim xuyên qua mà có cảm giác mềm tay là quá
trình khử khoáng đã hoàn thành.
+ Phương pháp hoá học: Lấy 1 ml
dung dịch amoni oxalat NH4C2O4 5% hay natri
oxalat Na2 C2O4 5%; cho một trong hai dung dịch
vào dung dịch khử khoáng, nếu có tủa là sự khử khoáng chưa hoàn thành.
- Các mẫu mô đã được xử lý
và đúc paraffin
Khử paraffin: Khử
paraffin bằng xylen
+ Xylen lần 1: Để qua đêm
+ Xylen lần 2: 30 phút
+ Xylen lần 3: 30 phút
Hydrat hóa mẫu
+ Cồn tuyệt đối lần 1: 10 phút
+ Cồn tuyệt đối lần 2: 15 phút
+ Cồn 95°: 10 phút
+ Cồn 90°: 10 phút
+ Cồn 80°: 10 phút
+ Cồn 70°: 10 phút
+ Đệm Cacodylat 0,3M (pH
7,2-7,4): 04 lần, mỗi lần 10 phút
4.1.2. Chuẩn bị dung dịch
để rửa và cố định mẫu
- Chuẩn bị đệm Cacodylate 0,2M
và 0,3M
- Chuẩn bị dung dịch cố định
Glutaraldehyde 2,5%
- Chuẩn bị dung dịch Axit Osmic
1%
- Dung dịch cồn các nồng độ:
30,50, 70, 80, 85, 90, 95%
- Chuẩn bị các dung dịch khác.
4.1.3 Chuẩn bị chất đúc
Epoxy
* EPON 812................................48g
* DDSA
......................................19g
*
MNA........................... .............33g
* DMP-30
...................................2g
Cách pha như sau:
1. Cho các phần EPON 812, DDSA
và MNA vào một cốc thủy tinh rồi khuấy đều.
2. Tiếp tục cho thêm DMP-30 vào
rồi lắc kỹ trong 5-10 phút
4.2. Tiến hành xử lý mẫu mô
nghiên cứu trên kính HVĐTTQ
1. Mẫu mô có kích thước 1mm
x1mm x 1mm.
2. Rửa mẫu bằng đệm Cacodylat
0,1M 2 lần x 10 phút/lần;
3. Cố định mẫu trong Glutaraldehyde
2,5 % trong 2-4 giờ;
4. Rửa mẫu bằng đệm Cacodylat
0,1M 2 lần x 10 phút/lần;
5. Cố định mẫu bằng axit Osmic
1% trong đệm cocadylat trong 2 giờ;
6. Rửa lại mẫu bằng đệm
cacodylat 0,1M 2 lần x 10 phút/lần;
7. Khử nước bằng cồn ethanol
theo qui trình:
- Cồn ethanol 50° x 10 phút/lần
x 2 lần,
- Cồn ethanol 70° x 10 phút/lần
x 2 lần,
- Cồn ethanol 80° x 10 phút/lần
x 2 lần
- Cồn ethanol 90° x 10 phút/lần
x 2 lần,
- Cồn ethanol 95° x 10 phút/lần
x 2 lần,
- Cồn ethanol 100° x 10 phút/lần
x 2 lần.
8. Khử cồn ethanol theo qui
trình:
- Chuyển qua propylen oxide, 3
lần x 10 phút/lần;
- Chuyển mẫu vào hỗn hợp
propylen oxide + epon tỷ lệ 2/1 để trong 30 phút;
- Chuyển mẫu vào hỗn hợp
propylen oxide + epon tỷ lệ 1/1 để trong 1 giờ;
- Chuyển mẫu vào hỗn hợp propylen
oxide + epon tỷ lệ 1/2 để trong 1 giờ;
- Chuyển mẫu vào epon trong 2
giờ (hoặc qua đêm)
9. Đúc mẫu bằng chất đúc epoxy,
để tủ ấm 35 °C trong 24 giờ, sau đó 45 °C trong 24 giờ và 60 °C trong 24 giờ.
10. Làm tiêu bản bán mỏng
Mục đích:
- Định hướng cho cắt siêu mỏng;
- Sử dụng để nghiên cứu vi thể
khi nhuộm hóa mô hay nhuộm miễn dịch sau khi tẩy epoxy.
- Cắt tiêu bản bán mỏng
Gọt thô: các mẫu đúc trong
block epon được gọt bằng máy hoặc tay, sau đó tạo dáng một cách chính xác trên
máy cắt siêu mỏng bằng lưỡi dao thủy tinh. Khác với khi gọt tinh để cắt siêu mỏng,
gọt để cắt bán mỏng sao cho sau khi cắt, trên tiêu bản bán mỏng ở rìa ngoài là
epoxy để có thể soi được toàn bộ bề mặt của mẫu (cả trong và ngoài)
Cắt bán mỏng trên máy cắt siêu
mỏng:
+ Đặt block gọt thô lên máy
siêu cắt và cắt bán mỏng (dày từ 0,5-2 micromet) bằng lưỡi dao thủy tinh hoặc
kim cương.
+ Dùng một mũi kim tiêm hoặc một
búi chải lông mi câu các lát cắt bán mỏng lên và đặt chúng lần lượt vào giọt nước
cất trước đó đã nhỏ lên tấm lam kính sạch.
+ Lam kính được chuyển vào đặt
lên tấm sấy (70-900) cho tới khi giọt nước bay hơi hết hoàn toàn.
- Nhuộm tiêu bản bán mỏng
Dung dịch nhuộm: xanh toluidin
1% hoặc xanh metylen 1%
Kỹ thuật nhuộm:
> Nhỏ một giọt dung dịch thuốc
nhuộm lên lát cắt;
> Đặt tiêu bản lên tấm sấy
cho tới khi các mép lát cắt dính thuốc nhuộm bắt đầu khô.
> Rửa nhẹ nhàng lam kính bằng
một bình có vòi phun nước cất;
> Đặt tiêu bản lên tấm sấy để
làm khô trước khi kiểm tra trên kính HVQH.
Chú ý: Không được phun
nước rửa trực tiếp lên các lát cắt vì chúng có thể bong ra khỏi lam. Nếu muốn
có nhiều lát cắt để quan sát thì thu lấy những dải dài các lát cắt dính nối tiếp.
11. Làm tiêu bản siêu cấu trúc
- Chuẩn bị lưới
+ Lựa chọn lưới đỡ mẫu (chất liệu,
kích thước mắt lưới) tùy theo mục đích nghiên cứu. Để nghiên cứu siêu cấu trúc
mô ƯBQ thường sử dụng lưới đồng loại 200 mắt lưới.
+ Làm sạch lưới: Trước khi sử dụng,
tất cả các lưới phải được rửa sạch bằng siêu âm trong nước hoặc ethanol và tiếp
đó trong acetone. Sau khi để lưới nằm ổn định ở đáy một chiếc cốc nhỏ và rót đổ
chất lỏng đi, cốc được lật úp trên một tờ giấy lọc và đặt vào sấy ở 60°C cho tới
khi thật sự khô.
+ Tạo màng đỡ của lưới bằng
màng formvar:
• Rửa sạch một lam kính bằng xà
phòng và nước. Làm khô lam kính;
• Nhúng lam kính vào trong một
cốc thủy tinh chứa dung dịch Formvar 0,5% trong chloroform hay trong ethylene
dichloride (W/V). Nhúng lam ngập nhiều nhất là khoảng ¾ độ dài của nó mà không
ngập hẳn trong dung dịch;
• Sau 30 giây tiếp theo rút lam
ra khỏi cốc và để khô trong không khí;
• Dùng lưỡi dao lam rạch các đường
thẳng theo các mép của lam kính và thổi nhẹ lên mặt lam và màng trước khi nhúng
vào nước;
• Làm nổi màng trên mặt nước sạch
bằng cách nhúng từ từ mép ngắn của lam kính theo góc 30-45º vào trong cốc (đã đổ
gần đầy nước cất 2 lần). Đẩy gần lam kính vào trong nước cho đến khi màng
formvar tách hoàn toàn khỏi lam và nổi trên mặt nước;
• Đặt nhẹ nhàng lần lượt lưới đồng
lên trên màng (mặt có viền bóng lên trên), bắt đầu từ 1 trong 4 góc để dễ dàng
quan sát phần diện tích màng đã đặt lưới;
• Lấy một mẩu giấy thấm với
kích thước thích hợp đặt trên các lưới và ấn nhẹ lên nó. Dùng kẹp kéo giấy có
dính lưới cùng với màng Formvar ra khỏi mặt nước và lật ngược tấm giấy từ dưới
lên trên, đặt chúng trên giấy lọc và để khô qua đêm.
Như vậy đã có lưới phủ màng
Formvar thích hợp để giữ mẫu cho quan sát trong kính hiển vi điện tử.
- Cắt lát mẫu siêu mỏng trên
máy cắt siêu mỏng ultramicrotom
+ Gọt tinh: Sau khi xác
định được những vùng block mẫu đúc đáng quan tâm kiểm tra các lát cắt dày, có
thể tiếp tục gọt thêm block mẫu để loại bỏ những phần mẫu không phù hợp. Thao
tác này gọi là gọt tinh. Mục đích chung của việc gọt tinh là tạo ra được một
chóp cụt với các mặt bên nghiêng từ 45° đến 60°. Đỉnh hình tháp cụt có dạng
hình vuông, hình chữ nhật hoặc hình thang
+ Vớt lát cắt:
Các lát cắt được vớt thành từng
đám từ 2 đến 4 lát bằng 1 que gạt lông mịn. Đặt các lát cắt nằm ở trung tâm lưới.
Vớt các lát cắt lên lưới bằng
cách luồn nhẹ lưới dưới dải lát cắt theo một gúc 45º so với mặt nước thu được
những dải lát cắt lên mặt lưới. Nâng nhẹ nhàng các dải lát cắt ra khỏi nước.
Có thể vớt các lát cắt lên lưới
bằng cách đưa lưới xuống áp trực tiếp vào lát cắt từ phía trên, phương pháp này
các lát cắt thường bị dồn cụm lại, chồng lên nhau và gấp nếp, không phẳng.
Chú ý: các màng chất dẻo hoặc
cacbon thường có xu hướng không dính với các lát cắt nên cần làm cho màng ưa nước
bằng cách đặt màng dưới sự phóng điện trong thiết bị bốc bay chấn không hoặc giữ
các lưới có phủ màng bằng cách để qua đêm trong tủ lạnh.
- Nhuộm tương phản mẫu bằng các
dung dịch kim loại nặng: uranyl acetat, chì citrat,....
+ Dung dịch nhuộm: Dung
dịch uranyl acetat 1%; Dung dịch chì citrat.
+ Tiến hành nhuộm
• Đặt giấy lọc vào đáy của đĩa
petri và làm ướt bằng một lượng nước cất nhỏ;
• Đặt giấy paraphin lên trên miếng
giấy lọc ướt;
• Nhỏ các giọt thuốc nhuộm
uranyl acetat lên trên bề mặt giấy paraphin;
• Đặt các lưới đỡ mẫu nổi riêng
rẽ trên các giọt thuốc nhuộm sao cho mặt có dính lát cắt hướng xuống dưới và đậy
nắp đĩa petri lại, che sáng; để 15 phút;
• Rửa lưới bằng cách nhẹ nhàng
nhúng vào trong một số cốc đựng nước cất, khoảng 15-20 lần nhúng/trong một cốc.
(Sau khi rửa có thể để khô và bảo
quản riêng cho đến khi nhuộm chì hoặc nhuộm chì luôn)
• Chuyển lưới tới một giọt thuốc
nhuộm chì citrate để 30 giây đến 15 phút
• Lấy lưới ra khỏi giọt chì
citrat sao cho còn giữ lại được giọt dung dịch trên lát cắt và nhúng trực tiếp
25 lần vào cốc đựng NaOH 1N;
• Tiếp tục nhúng lưới trực tiếp
vào cốc đựng nước cất 25 lần;
• Đặt lưới trên giấy lọc và để
khô trước khi kiểm tra trên TEM.
- Kết quả: Hình ảnh
trắng đen thể hiện mức độ cản điện tử khác nhau
+ Vật chất ít, khối lượng riêng
thấp (không bào): màu trắng hơn
+ Vật chất nhiều (nhân, màng tế
bào, melanin, ...): màu đen
4.3. Nhận định kết quả
Kết quả được Bác sĩ Giải phẫu bệnh
đọc và đánh giá trên kính hiển vi điện tử truyền qua.
4.4. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Pha mẫu gây tổn thương, bầm rập
mẫu; Sử dụng lưỡi dao sắc, cắt gọn 1 thì, không cứa, kéo mẫu. Dùng nỉa chuyên dụng
giữ mẫu.
- Cố định nhầm vào dung dịch
khác, loại bỏ và lấy lại bệnh phẩm mới
- Không kịp thời cố định ngày
trong dung dịch glutaraldehyd, thời gian cố định không đủ. Bệnh phẩm dính vào
thành lọ đựng mẫu, không được ngâm trong dung dịch cố định làm hỏng bệnh phẩm:
nên cho lượng dung dịch đủ quy định vào lọ trước khi pha và thả bệnh phẩm ngập
trong dung dịch, sau đó đậy nắp và lắc đều lọ đựng mẫu.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Cắt quá dày hoặc quá mỏng mẫu:
Đặt chế độ cắt chuẩn và cắt lại
- Cố định bổ sung không đủ: cố
định lại đúng quy trình.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
+ Tiêu bản nhăn, rách: Có thể
do: Chất đúc không đạt yêu cầu, tủ ấm không bảo đảm nhiệt độ, do bản thân mẫu
+ Tiêu bản bị quá nhạt hoặc quá
đậm: Kiểm tra lại hóa chất và thời gian nhuộm
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi Huyền Trác (1976),
Các kỹ thuật hiển vi học, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
2. Nguyễn Kim Giao (2004),
Hiển vi điện tử truyền qua, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Edna B. Prophet, Bob
Mill, Jacquelyn B. Arrington, Leslie H. Sobin, M. D (1992), Laboratory
Methods in Histotechnology, Prepared by the Armed Forces institute of Pathology
Washington, D. C; Published by the Ameican Registry of Pathology Washington, D.
C.
4. Parastou Tizro, Cecilia
Choi, and Negar Khanlou (2019), Sample Preparation for Transmission
Electron Microscopy: Methods and Protocols; Methods in molecular biology
(Clifton, N.J.) 1897:417-424, January 2019. DOI:10.1007/978-1-4939-8935-5_33.
PHẦN III. CÁC QUY TRÌNH HOÁ MIỄN DỊCH VÀ LAI TẠI CHỖ
65. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỘT DẤU ẤN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện
xét nghiệm và chẩn đoán bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch trên mẫu mô bệnh học.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hoá mô miễn dịch (HMMD) là sự kết
hợp của hai chuyên ngành miễn dịch học và mô học, trong đó có việc ứng dụng các
nguyên lý và các kỹ thuật của miễn dịch học để nghiên cứu tế bào và mô. Kỹ thuật
hoá mô miễn dịch được sử dụng không chỉ để xác định xem một mô có biểu hiện
(hay không biểu hiện) một kháng nguyên riêng biệt mà còn xác định tình trạng
kháng nguyên của các tế bào riêng biệt trong mô đó và vị trí của các kháng
nguyên này trong cấu trúc tế bào. Hoá mô miễn dịch giúp chẩn đoán phân biệt về
bản chất và nguồn gốc của tế bào, bản chất của mô u thông qua sự hiện diện của
một số kháng nguyên đặc hiệu, đặc biệt trong trường hợp các mô kém biệt hoá hoặc
không biệt hoá trên mô học. Trong một số trường hợp, HMMD giúp cho việc chẩn
đoán phân biệt giữa u lành và u ác, chẳng hạn như sử dụng một số dấu ấn miễn dịch
trong chẩn đoán phân biệt các u lympho ác tính với các tổn thương khác của hạch.
Hoá mô miễn dịch còn giúp xác định các dấu hiệu của thành phần tế bào ở mức
sinh học phân tử, qua đó người ta có thể tìm thấy mối liên quan giữa tình trạng
của tế bào và mô với các rối loạn về quá trình phát triển như quá trình phát
sinh, phát triển của mô ung thư (các dấu hiệu liên quan đến gen ung thư, yếu tố
phát triển bì, yếu tố tăng sinh…) hoặc các rối loạn khác như rối loạn chuyển
hoá, rối loạn do viêm, nhiễm trùng gây ra.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Hóa chất, Vật tư:
- Lam kính có tráng chất gắn
Silan (3-aminopropyltriethoxy-silane) hoặc lam kính tích điện dương.
- Dung dịch H2O2
3%.
- Các kháng thể (dấu ấn) mua của
các hãng cung cấp (theo bộ, kể cả chứng). Mỗi loại kháng thể có cách thức pha
loãng khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Hematoxylin để nhuộm nhân tế
bào.
- Dung dịch đệm: Đệm TBS (tris
buffer Saline) hoặc đệm PBS, pH 7,2.
- Bể nhuộm.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm
ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển, xử lý bệnh phẩm tự
động.
- Máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự
động
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Thiết bị bộc lộ kháng nguyên:
lò vi sóng hoặc nồi áp suất… hoặc sử dụng proteinase K*.
- Tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ
37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hút phòng thí nghiệm.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm là khối nến có chứa
bệnh phẩm của bệnh nhân đã qua quá trình cố định – chuyển – đúc.
- Thường nên kèm theo tiêu bản
nhuộm Hematoxyline – Eosin.
- Nếu mẫu mô không kèm theo
tiêu bản nhuộm bằng phương pháp Hematoxylin
- Eosin cần cắt nhuộm 1 tiêu bản
trước.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 150 – 300 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
* Chuẩn bị tiêu bản nhuộm:
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc lại
tiêu bản Hematoxylin: Chọn khối nến phù hợp cho nhuộm hoá mô miễn dịch; xem xét
lại các dấu ấn cần nhuộm để chỉ định đầy đủ dấu ấn.
- Kỹ thuật viên cắt bệnh phẩm
lên các lam kính chuyên dụng nhuộm hoá mô miễn dịch, cắt các mẫu chứng kèm
theo.
* Tiến hành kỹ thuật:
- Sấy khô các phiến kính có lát
cắt ở tủ ấm 37°C hoặc 56°C: 12 giờ
- Khử parafin: 10 phút;
- Nhúng nước cất : 5 phút;
- Khử peroxidase nội sinh bằng
dung dịch H2O2 3%: 5 phút;
- Rửa các lam kính có lát cắt bằng
nước cất: 5 phút
- Bộc lộ kháng nguyên bằng thiết
bị bộc lộ kháng nguyên như đun cách thủy trong nồi áp suất hoặc trong lò vi
sóng hoặc sử dụng proteinase K*.
- Rửa nước cất: 5 phút;
- Rửa các lam kính bằng dung dịch
TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút): 6 phút;
- Ủ với kháng thể thứ nhất
(primary antibody): 60 phút;
- Rửa các lam kính bằng dung dịch
TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút): 6 phút;
- Ủ với kháng thể thứ hai có gắn
với biotin (Biotinylated secondary antibody): 30 phút;
- Rửa các lam kính bằng dung dịch
TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút): 6 phút;
- Ủ với phức hợp ABC hoặc
streptavidin peroxidase: 30 phút;
- Rửa các lam kính bằng dung dịch
TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút): 6 phút;
- Phủ dung dịch tạo màu DAB
(Diamino benzidin) hoặc EAC (3-amino-9- ethylcarbazole): 10 phút;
- Rửa các lam kính bằng dung dịch
TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút): 6 phút;
- Nhuộm nhân: bằng Hematoxylin:
1 phút;
- Rửa nước chảy;
- Nếu dùng DAB thì tiếp tục khử
nước bằng cồn rồi qua xylen.
- Gắn lamen
* Kết quả nhuộm:
+ Dương tính: có sự hiện diện của
phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, được hiển thị bằng màu
vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặc màu đỏ (nếu dùng EAC).
+ Âm tính: không có sự hiện diện
của phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, không được hiển thị bằng
màu vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặc màu đỏ (nếu dùng EAC).
+ Nhân tế bào bắt màu xanh tím
của Hematoxylin.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN
HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1
quá ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA
CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
- Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
- Kiểm tra lại nhiệt độ buồng
rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể quá
lâu
|
- Giảm thời gian ủ
|
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
- Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
- Giảm thời gian bộc lộ
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh giá
kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
66. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH TỰ ĐỘNG CHO MỖI
MỘT DẤU ẤN BẰNG MÁY
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán bằng phương pháp xét nghiệm hóa mô miễn dịch tự động bằng máy trên
mẫu mô bệnh học. HMMD được sử dụng để xác định một mô có biểu hiện (hay không
biểu hiện) một kháng nguyên riêng biệt và xác định tình trạng kháng nguyên của
các tế bào riêng biệt trong mô đó và vị trí của các kháng nguyên trong cấu trúc
tế bào.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hoá mô miễn dịch (HMMD) là sự kết
hợp của hai chuyên ngành miễn dịch học và mô học, trong đó có việc ứng dụng các
nguyên lý và các kỹ thuật của miễn dịch học để nghiên cứu tế bào và mô. Kỹ thuật
hoá mô miễn dịch được sử dụng không chỉ để xác định xem một mô có biểu hiện
(hay không biểu hiện) một kháng nguyên riêng biệt mà còn xác định tình trạng
kháng nguyên của các tế bào riêng biệt trong mô đó và vị trí của các kháng
nguyên này trong cấu trúc tế bào. Hoá mô miễn dịch giúp chẩn đoán phân biệt về
bản chất và nguồn gốc của tế bào, bản chất của mô u thông qua sự hiện diện của
một số kháng nguyên đặc hiệu, đặc biệt trong trường hợp các mô kém biệt hoá hoặc
không biệt hoá trên mô học. Trong một số trường hợp, HMMD giúp cho việc chẩn
đoán phân biệt giữa u lành và u ác, chẳng hạn như sử dụng một số dấu ấn miễn dịch
trong chẩn đoán phân biệt các u lympho ác tính với các tổn thương khác của hạch.
Hoá mô miễn dịch còn giúp xác định các dấu hiệu của thành phần tế bào ở mức
sinh học phân tử, qua đó người ta có thể tìm thấy mối liên quan giữa tình trạng
của tế bào và mô với các rối loạn về quá trình phát triển như quá trình phát
sinh, phát triển của mô ung thư (các dấu hiệu liên quan đến gen ung thư, yếu tố
phát triển bì, yếu tố tăng sinh…) hoặc các rối loạn khác như rối loạn chuyển
hoá, rối loạn do viêm, nhiễm trùng gây ra.
HMMD là một phương pháp nhuộm đặc
biệt trong đó các kháng thể được sử dụng nhằm xác định sự hiện diện của các
kháng nguyên đặc hiệu trong và/ hoặc trên bề mặt tế bào và mô.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý.
2.2. Hóa chất, Vật tư:
- Dung dịch khử paraffin
- Dung dịch dầu khoáng phủ mẫu
mô
- Dung dịch bộc lộ kháng nguyên
- Dung dịch rửa các bước
- Kháng thể 1: Gắn với kháng
nguyên mô, kháng thể 1 là kháng thể dùng luôn hay phải pha loãng tùy thuộc vào
nhà sản xuất
- Bộ kit hiện màu
- Hematoxylin - dung dịch nhuộm
nhân
- Dung dịch làm xanh nhân
- Keo gắn lamen
- Lamen
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Pipet, đầu côn
- Giá đựng kháng thể
2.3. Trang thiết bị:
- Máy nhuộm hóa mô miễn dịch
- Máy cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- KHV quang học
- Tủ lạnh
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm là các khối nến
chứa bệnh phẩm cần xét nghiệm. Nên đi kèm tiêu bản nhuộm Hematoxylin – Eosin để
đánh giá (nếu không có cần cắt nhuộm bổ sung).
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc
tiêu bản Hematoxylin – Eosin, đánh giá lựa chọn khối nến phù hợp cho xét nghiệm,
đánh giá lại và bổ sung các dấu ấn cần nhuộm.
- Mẫu bệnh phẩm được cắt mỏng,
gắn lên lam kính chống bong (lam kính tráng silan hoặc lam kính tích điện
dương).
- Trên tiêu bản phải có mẫu chứng
dương và chứng âm thích hợp cho từng loại dấu ấn sinh học.
- Khối nến chứa u có chứa mẫu
mô phải được bảo quản tốt còn đủ mô.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:
ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên
khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm, các dấu
ấn sinh học cần khảo sát.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 3-5 ngày làm việc,
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, phải có phòng thực hiện kỹ thuật
hóa mô miễn dịch riêng, phòng phải có hệ thống thông khí tốt, hệ thống lạnh ổn
định từ 23-26°C.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
a. Kiểm tra hồ sơ
- Đối chiếu mã số bệnh nhân
trên lam kính và trên phiếu chỉ định
b. Thực hiện kỹ thuật
- Khối block bệnh phẩm
được cắt lát mỏng 3-5 µm và dán lên lam kính hóa mô tích điện (hoặc lam tráng
silan), và một lam kính sạch nhuộm HE.
- Để lam kính trong tủ ấm
60-65°C trong 40-45 phút hoặc trong tủ 37°C qua đêm (12h)
- Cài đặt chương trình chạy máy
nhuộm hóa mô tự động:
B1: Chọn thời gian và nhiệt độ
sấy tiêu bản;
B2: Chọn nhiệt độ khử paraffin;
B3: Khử protein nội sinh;
B4: chọn mức thời gian bộc lộ
kháng nguyên (tùy thuộc vào loại kháng thể nhuộm);
B5: Chọn nhiệt độ ủ kháng thể
(35-42 độ C), tùy thuộc vào từng loại kháng thể; B6: Chọn bước kháng thể 1 nhỏ
tự động hoặc nhỏ tay, nếu chọn nhỏ tay, nếu chọn nhỏ tay thì máy sẽ bắt đầu nhuộm
tiêu bản và thông báo cho người dụng đến giai đoạn nhỏ tay, mở các buồng ủ tiêu
bản, nhỏ tay kháng thể, sau đó đóng buồng ủ và giữ nút trong vài giây để thông
báo cho máy rằng kháng thể đã được cho vào tiêu bản.
Nếu sử dụng kháng thể hoàn toàn
tự động: chọn kháng thể thích hợp trong danh sách và thời gian ủ tương ứng
B7: Sử dụng bộ hiện màu phức hợp
kháng nguyên – kháng thể; B8: Nhuộm nhân hematoxylin;
B9: Làm xanh nhân;
B10: Rửa sạch tiêu bản sau đó
loại nước, làm trong và gắn lamen.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và
chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN
HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1
quá ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA
CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
- Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
- Kiểm tra lại nhiệt độ buồng
rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể quá
lâu
|
- Giảm thời gian ủ
|
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
- Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
- Giảm thời gian bộc lộ
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
67. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN
TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này mô tả và hướng dẫn
các bước thực hiện kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch cho một dấu ấn phục vụ điều
trị đích (một số dấu ấn hiện nay như HER2, ALK, BRAF,….) và cách đánh giá, chẩn
đoán cho các dấu ấn này.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hóa mô miễn dịch là phương pháp
xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể. Kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ
các kháng nguyên tại bào tương, màng tế bào, nhân của tế bào. Có 2 cách để quan
sát được phức hợp này: miễn dịch huỳnh quang (gắn với một chất phát huỳnh quang
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang) và miễn dịch men (gắn với một loại
men (peroxidase hoặc Alkakine phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen)) có
thể quan sát dưới kinh hiển vi quang học.
Điều trị đích là một bước tiến
mới hiện nay, nâng cao hiệu quả, chất lượng trong điều trị ung thư. Một số đột
biến sinh học có thể phát hiện bằng nhuộm hoá mô miễn dịch là điều kiện để lựa
chọn phác đồ điều trị. Đây là phương pháp phổ thông vả chi phí thấp. Khác với
nhuộm hoá mô miễn dịch chẩn đoán, nhuộm các dấu ấn để có cơ sở lựa chọn phác đồ
điều trị đòi hỏi tỉ mỉ, cẩn thận và các hoá chất có độ nhạy, độ đặc hiệu cao,
phân tích kết quả tỉ mỉ và theo hướng dẫn.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sĩ giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
Hộ lý: 01
Nhân viên văn phòng: 01
Nhân viên vệ sinh: 01
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
- Kháng thể 1;
- Bộ DAB bao gồm H2O2,
kháng thể 2;
- Bộ kit khuếch đại tín hiệu;
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào;
- Hoá chất làm xanh nhân;
- Dung dịch khử parafin;
- Dung dịch dầu phủ tiêu bản;
- Dung dịch rửa tiêu bản;
- Hoá chất xử lí tế bào và bộc
lộ kháng nguyên.
- Gel gắn lamelle.
- Hoá chất nhuộm hematoxylin –
Eosin.
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính thường.
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch.
- Lamelle.
- Bút chì.
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in barcode,
hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng cần nhuộm hoá mô để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Thời gian thực hiện kỹ thuật: 8
giờ;
Thời gian thực hiện xét nghiệm:
5 ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm theo quy định Bộ Y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Khối nến bệnh phẩm sau khi cố
định được cắt 1 lát với độ dày 3µm, sau đó được gắn lên tiêu bản tích điện
dương chuyên dụng cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch, trên lam có mã số riêng. Mỗi mẫu
phẩm cắt 2 tiêu bản (nhằm đảm bảo tiết kiệm tối đa bệnh phẩm và đảm bảo tính
liên tục của mô trên 2 tiêu bản). Hai tiêu bản này bao gồm:
+ 1 tiêu bản nhuộm hoá mô miễn
dịch chính.
+ 1 tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin.
- Mẫu phẩm chuẩn bị làm chứng
âm và chứng dương cắt 2 tiêu bản:
+ 1 tiêu bản chứng âm.
+ 1 tiêu bản chứng dương.
- Tiêu bản nhuộm Hematoxylin Eosin
sẽ được nhuộm HE theo quy trình nhuộm. Các tiêu bản còn lại được bảo quản trong
tủ lạnh trong các hộp đựng tiêu bản có đánh số.
- Tiêu bản được các Bác sĩ Giải
phẫu bệnh đánh giá lại bằng kính hiển vi quang học: Đánh giá chất lượng tiêu bản,
chất lượng mô, đánh số số lượng và chất lượng u nhằm đảm bảo cho nhuộm hoá mô
miễn dịch.
+ Nếu mẫu mô đạt, tiến hành các
bước tiếp theo.
+ Nếu mẫu mô không đạt, chọn mẫu
mô khác của bệnh nhân và thực hiện lại các bước trên.
4.2. Chuẩn bị hoá chất
- Dung dịch loại paraffin: theo
tỉ lệ 1dung dịch:9 nước cất 2 lần (hoặc nước đã khử ion)
- Dung dịch dầu bao phủ lên
tiêu bản mô ngăn hóa chất bốc hơi, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng xảy
ra: dùng trực tiếp.
- Dung dịch rửa tiêu bản
Buffer: Pha dung dịch đậm đặc với nước cất 2 lần theo tỉ lệ 1 dung dịch rửa đậm
đặc: 9 nước cất 2 lần.
- Dung dịch bộc lộ kháng
nguyên: sử dụng trực tiếp.
- Các kháng thể 1 cần để nhuộm:
ALK, PDL1, BRAF,… (nếu hóa chất đậm đặc cần pha loãng theo tỉ lệ quy định của
nhà sản xuất)
- Bộ kít phát hiện DAB
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào.
- Hóa chất làm xanh nhân.
- Chứng âm và chứng dương của bộ
kit.
+ Chứng âm: Kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ thỏ, không bắt đặc hiệu với các kháng nguyên trên
mẫu mô. Được sử dụng thay cho kháng thể sơ cấp. Giúp kiểm soát chất lượng kết
quả nhuộm, đánh giá mức độ nhuộm nền của xét nghiệm.
- Bộ kít khuếch đại tín hiệu:
Tăng cường độ tạo màu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
- Ethanol hay thuốc thử alcol.
- Nước khử ion hay nước cất.
- Xylene.
- Gel gắn lamelle
- Các nhãn mã vạch (thích hợp
cho chứng thuốc thử âm và kháng thể được xét nghiệm)
4.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Tẩy paraffin trên tiêu
bản nhuộm bằng dung dịch tẩy chuyên dụng.
Bước 2: Bộc lộ kháng nguyên bằng
dung dịch bộc lộ, thời gian ủ: 92 phút.
Bước 3: Khử protein nội sinh bằng
Peroxydase.
Bước 4: Kháng thể 1: theo thời
gian quy định của từng phương pháp nhuộm.
Bước 5: Dùng chất tăng sự kết nối
kháng thể 1 và kháng thể 2: 12 phút
Bước 6; Kháng thể 2: 12 phút
Bước 7: Chất khuếch đại tín hiệu:
8 phút
Bước 8: Dung dịch nhuộm nhân tế
bào: 12 phút
Bước 9: Dung dịch làm xanh
nhân: 4 phút
Giữa các bước phải rửa tiêu bản
bằng dung dịch rửa. Trong quá trình ủ hóa chất đều phủ dung dịch dầu khoáng lên
tiêu bản để chống bay hơi.
Bước 10: Khử nước, gắn lá kính.
Bước 11: Sắp xếp tiêu bản đã
nhuộm phù hợp tên tuổi, mã số của giấy chỉ định, gửi bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc
và phân tích kết quả.
4.2. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.2.1. Đọc kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm
Hematoxylin Eosin nhằm đánh giá vùng u và vùng lành.
- Đánh giá tiêu bản chứng âm,
dương, chứng nội (in-house control):
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm chính.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
- Đánh giá tiêu bản mẫu phẩm
nhuộm: Các tiêu chí đánh giá gồm:
+ Tế bào dương tính hay âm
tính, vị trí dương tính (bào tương, màng tế bào hay nhân).
+ Tỉ lệ tế bào dương tính (tế
bào u hay tế bào ở môi trường. Tuỳ theo từng dấu ấn hoặc từng loại mô mà đánh
giá theo các chỉ số khác nhau.
- Đưa ra kết luận dấu ấn miễn dịch
là dương tính hay âm tính, mất bộc lộ hay bộc lộ tuỳ từng tiêu chí đánh giá của
mỗi loại dấu ấn hoặc mỗi loại cơ quan của 1 dấu ấn.
4.2.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
Lưu khối nến và tiêu bản theo
quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
KHÔNG
CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1 quá
ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN
HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM
NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể quá
lâu
|
Giảm thời gian ủ
|
MẤT
HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
Giảm thời gian bộc lộ
|
Chú ý:
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất
thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Tuân thủ quy trình kiểm tra
chất lượng.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen Handling
in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
68. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN ALK
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này mô tả và hướng dẫn
các bước thực hiện kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch dấu ấn ALK và cách đánh giá,
chẩn đoán cho các dấu ấn này.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hóa mô miễn dịch là phương pháp
xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể. Kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ
các kháng nguyên tại bào tương, màng tế bào, nhân của tế bào. Có 2 cách để quan
sát được phức hợp này: miễn dịch huỳnh quang (gắn với một chất phát huỳnh quang
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang) và miễn dịch men (gắn với một loại
men (peroxidase hoặc Alkakine phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen)) có
thể quan sát dưới kinh hiển vi quang học.
ALK là viết tắt của anaplastic
lymphoma kinase. ALK là một loại gen tồn tại trong tất cả chúng ta. Gen ALK tạo
ra một protein tham gia vào sự phát triển của tế bào. Những thay đổi trong gen
ALK tự nhiên có thể gây ung thư. Đột biến ALK gặp trong khoảng 5% bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ và thuốc ức chế ALK mang lại giá trị đáng kể với các
bệnh nhân ALK dương tính.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sỹ giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
Hộ lý: 01
Nhân viên văn phòng: 01
Nhân viên vệ sinh: 01
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
- Kháng thể đơn dòng ALK
(D5F3);
- Bộ DAB bao gồm H2O2,
kháng thể 2;
- Bộ kit khuếch đại tín hiệu;
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào;
- Hoá chất làm xanh nhân;
- Dung dịch khử parafin;
- Dung dịch dầu phủ tiêu bản;
- Dung dịch rửa tiêu bản;
- Hoá chất xử lí tế bào và bộc
lộ kháng nguyên.
- Gel gắn lamelle.
- Hoá chất nhuộm hematoxylin –
Eosin.
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính thường.
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch.
- Lamelle.
- Bút chì.
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng cần nhuộm hoá mô để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Thời gian thực hiện kỹ thuật: 8
giờ;
Thời gian thực hiện xét nghiệm:
5 ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm theo quy định Bộ Y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Khối nến bệnh phẩm sau khi cố
định được cắt 1 lát với độ dày 3µm, sau đó được gắn lên tiêu bản tích điện
dương chuyên dụng cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch, trên lam có mã số riêng. Mỗi mẫu
phẩm cắt 2 tiêu bản (nhằm đảm bảo tiết kiệm tối đa bệnh phẩm và đảm bảo tính
liên tục của mô trên 2 tiêu bản). Hai tiêu bản này bao gồm:
+ 1 tiêu bản nhuộm hoá mô miễn
dịch chính.
+ 1 tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin.
- Mẫu phẩm chuẩn bị làm chứng
âm và chứng dương cắt 2 tiêu bản:
+ 1 tiêu bản chứng âm.
+ 1 tiêu bản chứng dương.
- Tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin sẽ được nhuộm HE theo quy trình nhuộm. Các tiêu bản còn lại được bảo quản
trong tủ lạnh trong các hộp đựng tiêu bản có đánh số.
- Tiêu bản được các Bác sĩ Giải
phẫu bệnh đánh giá lại bằng kính hiển vi quang học: Đánh giá chất lượng tiêu bản,
chất lượng mô, đánh số số lượng và chất lượng u nhằm đảm bảo cho nhuộm hoá mô
miễn dịch.
+ Nếu mẫu mô đạt, tiến hành các
bước tiếp theo.
+ Nếu mẫu mô không đạt, chọn mẫu
mô khác của bệnh nhân và thực hiện lại các bước trên.
4.2. Chuẩn bị hoá chất
- Dung dịch loại paraffin: theo
tỉ lệ 1dung dịch:9 nước cất 2 lần (hoặc nước đã khử ion)
- Dung dịch dầu bao phủ lên
tiêu bản mô ngăn hóa chất bốc hơi, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng xảy
ra: dùng trực tiếp.
- Dung dịch rửa tiêu bản
Buffer: Pha dung dịch đậm đặc với nước cất 2 lần theo tỉ lệ 1 dung dịch rửa đậm
đặc: 9 nước cất 2 lần.
- Dung dịch bộc lộ kháng
nguyên: sử dụng trực tiếp.
- Kháng thể ALK D5F3;
- Bộ kít phát hiện DAB
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào.
- Hóa chất làm xanh nhân.
- Chứng âm và chứng dương của bộ
kit.
+ Chứng âm: Kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ thỏ, không bắt đặc hiệu với các kháng nguyên trên
mẫu mô. Được sử dụng thay cho kháng thể sơ cấp. Giúp kiểm soát chất lượng kết
quả nhuộm, đánh giá mức độ nhuộm nền của xét nghiệm.
- Bộ kít khuếch đại tín hiệu:
Tăng cường độ tạo màu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
- Ethanol hay thuốc thử alcol.
- Nước khử ion hay nước cất.
- Xylene.
- Gel gắn lamelle
- Các nhãn mã vạch (thích hợp cho
chứng thuốc thử âm và kháng thể được xét nghiệm)
4.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Tẩy paraffin trên tiêu
bản nhuộm bằng dung dịch tẩy chuyên dụng.
Bước 2: Bộc lộ kháng nguyên bằng
dung dịch bộc lộ, thời gian ủ: 92 phút.
Bước 3: Khử protein nội sinh bằng
Peroxydase.
Bước 4: Kháng thể 1: theo thời
gian quy định của từng phương pháp nhuộm.
Bước 5: Dùng chất tăng sự kết nối
kháng thể 1 và kháng thể 2: 12 phút
Bước 6; Kháng thể 2: 12 phút
Bước 7: Chất khuếch đại tín hiệu:
8 phút
Bước 8: Dung dịch nhuộm nhân tế
bào: 12 phút
Bước 9: Dung dịch làm xanh
nhân: 4 phút
Giữa các bước phải rửa tiêu bản
bằng dung dịch rửa. Trong quá trình ủ hóa chất đều phủ dung dịch dầu khoáng lên
tiêu bản để chống bay hơi.
Bước 10: Khử nước, gắn lá kính.
Bước 11: Sắp xếp tiêu bản đã nhuộm
phù hợp tên tuổi, mã số của giấy chỉ định, gửi bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc và
phân tích kết quả.
4.2. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.2.1. Đọc kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm
Hematoxylin Eosin nhằm đánh giá vùng u và vùng lành.
- Đánh giá tiêu bản chứng âm,
dương, chứng nội (in-house control):
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm chính.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
- Đánh giá tiêu bản mẫu phẩm
nhuộm: Các tiêu chí đánh giá gồm:
+ Tế bào dương tính hay âm
tính, vị trí dương tính (bào tương, màng tế bào).
+ Tỉ lệ tế bào dương tính: tính
phần trăm.
- Kết luận ALK dương tính với
khi tế bào u bộc lộ màng và/hoặc bào tương với bất kể tỉ lệ nào.
4.2.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.
Lưu khối nến và tiêu bản theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
KHÔNG
CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1
quá ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN
HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM
NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể quá
lâu
|
Giảm thời gian ủ
|
MẤT
HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
Giảm thời gian bộc lộ
|
Chú ý:
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất
thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Tuân thủ quy trình kiểm tra
chất lượng.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh giá
kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
69. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN
TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này mô tả và hướng dẫn
các bước thực hiện kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch cho một dấu ấn phục vụ điều
trị miễn dịch (một số dấu ấn hiện nay như PD-L1, CTLA-4, LAG-3,….) và cách đánh
giá, chẩn đoán cho các dấu ấn này.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hóa mô miễn dịch là phương pháp
xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể. Kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ
các kháng nguyên tại bào tương, màng tế bào, nhân của tế bào. Có 2 cách để quan
sát được phức hợp này: miễn dịch huỳnh quang (gắn với một chất phát huỳnh quang
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang) và miễn dịch men (gắn với một loại
men (peroxidase hoặc Alkakine phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen)) có
thể quan sát dưới kinh hiển vi quang học.
Điều trị miễn dịch là một bước
tiến mới hiện nay, nâng cao hiệu quả, chất lượng trong điều trị ung thư. Các dấu
ấn miễn dịch (như PD-L1, CTLA-4, LAG-3…) được phát hiện bằng nhuộm hoá mô miễn
dịch là điều kiện để lựa chọn phác đồ điều trị. Đây là phương pháp phổ thông vả
chi phí thấp. Khác với nhuộm hoá mô miễn dịch chẩn đoán, nhuộm các dấu ấn để có
cơ sở lựa chọn phác đồ điều trị đòi hỏi tỉ mỉ, cẩn thận và các hoá chất có độ
nhạy, độ đặc hiệu cao, phân tích kết quả tỉ mỉ và theo hướng dẫn.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sĩ giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
Hộ lý: 01
Nhân viên văn phòng: 01
Nhân viên vệ sinh: 01
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
- Kháng thể 1;
- Bộ DAB bao gồm H2O2,
kháng thể 2;
- Bộ kit khuếch đại tín hiệu;
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào;
- Hoá chất làm xanh nhân;
- Dung dịch khử parafin;
- Dung dịch dầu phủ tiêu bản;
- Dung dịch rửa tiêu bản;
- Hoá chất xử lí tế bào và bộc
lộ kháng nguyên.
- Gel gắn lamelle.
- Hoá chất nhuộm hematoxylin –
Eosin.
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính thường.
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch.
- Lamelle.
- Bút chì.
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng cần nhuộm hoá mô để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Thời gian thực hiện kỹ thuật: 8
giờ;
Thời gian thực hiện xét nghiệm:
5 ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm theo quy định Bộ Y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Khối nến bệnh phẩm sau khi cố
định được cắt 1 lát với độ dày 3µm, sau đó được gắn lên tiêu bản tích điện
dương chuyên dụng cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch, trên lam có mã số riêng. Mỗi mẫu
phẩm cắt 2 tiêu bản (nhằm đảm bảo tiết kiệm tối đa bệnh phẩm và đảm bảo tính
liên tục của mô trên 2 tiêu bản). Hai tiêu bản này bao gồm:
+ 1 tiêu bản nhuộm hoá mô miễn
dịch chính.
+ 1 tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin.
- Mẫu phẩm chuẩn bị làm chứng
âm và chứng dương cắt 2 tiêu bản:
+ 1 tiêu bản chứng âm.
+ 1 tiêu bản chứng dương.
- Tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin sẽ được nhuộm HE theo quy trình nhuộm. Các tiêu bản còn lại được bảo quản
trong tủ lạnh trong các hộp đựng tiêu bản có đánh số.
- Tiêu bản được các Bác sĩ Giải
phẫu bệnh đánh giá lại bằng kính hiển vi quang học: Đánh giá chất lượng tiêu bản,
chất lượng mô, đánh số số lượng và chất lượng u nhằm đảm bảo cho nhuộm hoá mô
miễn dịch.
+ Nếu mẫu mô đạt, tiến hành các
bước tiếp theo.
+ Nếu mẫu mô không đạt, chọn mẫu
mô khác của bệnh nhân và thực hiện lại các bước trên.
4.2. Chuẩn bị hoá chất
- Dung dịch loại paraffin: theo
tỉ lệ 1dung dịch:9 nước cất 2 lần (hoặc nước đã khử ion)
- Dung dịch dầu bao phủ lên
tiêu bản mô ngăn hóa chất bốc hơi, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng xảy
ra: dùng trực tiếp.
- Dung dịch rửa tiêu bản
Buffer: Pha dung dịch đậm đặc với nước cất 2 lần theo tỉ lệ 1 dung dịch rửa đậm
đặc: 9 nước cất 2 lần.
- Dung dịch bộc lộ kháng
nguyên: sử dụng trực tiếp.
- Các kháng thể 1 cần để nhuộm:
ALK, PDL1, BRAF,… (nếu hóa chất đậm đặc cần pha loãng theo tỉ lệ quy định của
nhà sản xuất)
- Bộ kít phát hiện DAB
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào.
- Hóa chất làm xanh nhân.
- Chứng âm và chứng dương của bộ
kit.
+ Chứng âm: Kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ thỏ, không bắt đặc hiệu với các kháng nguyên trên
mẫu mô. Được sử dụng thay cho kháng thể sơ cấp. Giúp kiểm soát chất lượng kết
quả nhuộm, đánh giá mức độ nhuộm nền của xét nghiệm.
- Bộ kít khuếch đại tín hiệu:
Tăng cường độ tạo màu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
- Ethanol hay thuốc thử alcol.
- Nước khử ion hay nước cất.
- Xylene.
- Gel gắn lamelle
- Các nhãn mã vạch (thích hợp
cho chứng thuốc thử âm và kháng thể được xét nghiệm)
4.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Tẩy paraffin trên tiêu
bản nhuộm bằng dung dịch tẩy chuyên dụng.
Bước 2: Bộc lộ kháng nguyên bằng
dung dịch bộc lộ, thời gian ủ: 92 phút.
Bước 3: Khử protein nội sinh bằng
Peroxydase.
Bước 4: Kháng thể 1: theo thời
gian quy định của từng phương pháp nhuộm.
Bước 5: Dùng chất tăng sự kết nối
kháng thể 1 và kháng thể 2: 12 phút
Bước 6; Kháng thể 2: 12 phút
Bước 7: Chất khuếch đại tín hiệu:
8 phút
Bước 8: Dung dịch nhuộm nhân tế
bào: 12 phút
Bước 9: Dung dịch làm xanh
nhân: 4 phút
Giữa các bước phải rửa tiêu bản
bằng dung dịch rửa. Trong quá trình ủ hóa chất đều phủ dung dịch dầu khoáng lên
tiêu bản để chống bay hơi.
Bước 10: Khử nước, gắn lá kính.
Bước 11: Sắp xếp tiêu bản đã
nhuộm phù hợp tên tuổi, mã số của giấy chỉ định, gửi bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc
và phân tích kết quả.
4.2. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.2.1. Đọc kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm
Hematoxylin Eosin nhằm đánh giá vùng u và vùng lành.
- Đánh giá tiêu bản chứng âm,
dương, chứng nội (in-house control):
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm chính.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
- Đánh giá tiêu bản mẫu phẩm
nhuộm: Các tiêu chí đánh giá gồm:
+ Tế bào dương tính hay âm
tính, vị trí dương tính (bào tương, màng tế bào hay nhân).
+ Tỉ lệ tế bào dương tính (tế
bào u hay tế bào ở môi trường. Tuỳ theo từng dấu ấn hoặc từng loại mô mà đánh
giá theo các chỉ số khác nhau.
- Đưa ra kết luận dấu ấn miễn dịch
là dương tính hay âm tính, mất bộc lộ hay bộc lộ tuỳ từng tiêu chí đánh giá của
mỗi loại dấu ấn hoặc mỗi loại cơ quan của 1 dấu ấn.
4.2.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.
Lưu khối nến và tiêu bản theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
KHÔNG
CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1
quá ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN
HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM
NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể quá
lâu
|
Giảm thời gian ủ
|
MẤT
HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
Giảm thời gian bộc lộ
|
Chú ý:
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất
thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Cần pha kháng thể theo hướng dẫn
của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Tuân thủ quy trình kiểm tra
chất lượng.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
3. Freida Carson:
Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.
70. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN PD-L1
TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này mô tả và hướng dẫn
các bước thực hiện kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch cho dấu ấn PD-L1 phục vụ điều
trị miễn dịch và cách đánh giá, chẩn đoán cho dấu ấn này.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Hóa mô miễn dịch là phương pháp
xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể. Kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ
các kháng nguyên tại bào tương, màng tế bào, nhân của tế bào. Có 2 cách để quan
sát được phức hợp này: miễn dịch huỳnh quang (gắn với một chất phát huỳnh quang
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang) và miễn dịch men (gắn với một loại
men (peroxidase hoặc Alkakine phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen)) có
thể quan sát dưới kinh hiển vi quang học.
- PD-L1 là một protein xuyên
màng, có mặt tại màng tế bào ung thư; trong khi đó thụ cảm thể PD-1 có mặt trên
bề mặt các tế bào miễn dịch như: tế bào T, tế bào B, tế bào giết tự nhiên
(Natural Killer), đại thực bào. Khi PD-L1 gắn với thụ thể PD-1 gây ra hiện tượng
bất hoạt động của tế bào T và hoạt động miễn dịch của tế bào T bị ức chế. Vì thế
khi dùng kháng thể (antibody) ức chế PD-1 hoặc PD-L1 sẽ gây ra hiện tượng ức chế
liên kết trục PD-1/PD-L1 (checkpoit inhibitors), từ đó hệ miễn dịch của tế bào
T được kích hoạt và tấn công tế bào ung thư. Khi xét nghiệm thấy PD-L1 tăng cao
ở những tế bào ung thư, thì có chỉ định bất hoạt PD-1 hoặc PD-L1 để kích hoạt hệ
thống miễn dịch tế bào T, tế bào miễn dịch T sẽ tìm và tiêu diệt tế bào ung
thư. Hiện nay có nhiều thuốc được dùng để bất hoạt PD-1 nằm trong liệu pháp miễn
dịch. PD-L1 có thể phát hiện bằng nhuộm hoá mô miễn dịch.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật viên Giải phẫu bệnh:
02
Hộ lý: 01
Nhân viên văn phòng: 01
Nhân viên vệ sinh: 01
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
- Kháng thể đơn dòng PD-L1;
- Bộ DAB bao gồm H2O2, kháng thể
2;
- Bộ kit khuếch đại tín hiệu;
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào;
- Hoá chất làm xanh nhân;
- Dung dịch khử parafin;
- Dung dịch dầu phủ tiêu bản;
- Dung dịch rửa tiêu bản;
- Hoá chất xử lí tế bào và bộc
lộ kháng nguyên.
- Gel gắn lamelle.
- Hoá chất nhuộm hematoxylin –
Eosin.
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính thường.
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch.
- Lamelle.
- Bút chì.
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng cần nhuộm hoá mô để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Thời gian thực hiện kỹ thuật: 8
giờ;
Thời gian thực hiện xét nghiệm:
5 ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm theo quy định Bộ Y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Khối nến bệnh phẩm sau khi cố
định được cắt 1 lát với độ dày 3µm, sau đó được gắn lên tiêu bản tích điện
dương chuyên dụng cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch, trên lam có mã số riêng. Mỗi mẫu
phẩm cắt 2 tiêu bản (nhằm đảm bảo tiết kiệm tối đa bệnh phẩm và đảm bảo tính
liên tục của mô trên 2 tiêu bản). Hai tiêu bản này bao gồm:
+ 1 tiêu bản nhuộm hoá mô miễn
dịch chính.
+ 1 tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin.
- Mẫu phẩm chuẩn bị làm chứng
âm và chứng dương cắt 2 tiêu bản:
+ 1 tiêu bản chứng âm.
+ 1 tiêu bản chứng dương.
- Tiêu bản nhuộm Hematoxylin
Eosin sẽ được nhuộm HE theo quy trình nhuộm. Các tiêu bản còn lại được bảo quản
trong tủ lạnh trong các hộp đựng tiêu bản có đánh số.
- Tiêu bản được các Bác sĩ Giải
phẫu bệnh đánh giá lại bằng kính hiển vi quang học: Đánh giá chất lượng tiêu bản,
chất lượng mô, đánh số số lượng và chất lượng u nhằm đảm bảo cho nhuộm hoá mô
miễn dịch.
+ Nếu mẫu mô đạt, tiến hành các
bước tiếp theo.
+ Nếu mẫu mô không đạt, chọn mẫu
mô khác của bệnh nhân và thực hiện lại các bước trên.
4.2. Chuẩn bị hoá chất
- Dung dịch loại paraffin: theo
tỉ lệ 1dung dịch:9 nước cất 2 lần (hoặc nước đã khử ion)
- Dung dịch dầu bao phủ lên tiêu
bản mô ngăn hóa chất bốc hơi, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng xảy ra:
dùng trực tiếp.
- Dung dịch rửa tiêu bản
Buffer: Pha dung dịch đậm đặc với nước cất 2 lần theo tỉ lệ 1 dung dịch rửa đậm
đặc: 9 nước cất 2 lần.
- Dung dịch bộc lộ kháng nguyên:
sử dụng trực tiếp.
- Kháng thể 1 PDL1 (nếu hóa chất
đậm đặc cần pha loãng theo tỉ lệ quy định của nhà sản xuất).
- Bộ kít phát hiện DAB
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào.
- Hóa chất làm xanh nhân.
- Chứng âm và chứng dương của bộ
kit.
+ Chứng âm: Kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ thỏ, không bắt đặc hiệu với các kháng nguyên trên
mẫu mô. Được sử dụng thay cho kháng thể sơ cấp. Giúp kiểm soát chất lượng kết
quả nhuộm, đánh giá mức độ nhuộm nền của xét nghiệm.
- Bộ kít khuếch đại tín hiệu:
Tăng cường độ tạo màu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
- Ethanol hay thuốc thử alcol.
- Nước khử ion hay nước cất.
- Xylene.
- Gel gắn lamelle
- Các nhãn mã vạch (thích hợp
cho chứng thuốc thử âm và kháng thể được xét nghiệm)
4.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Tẩy paraffin trên tiêu
bản nhuộm bằng dung dịch tẩy chuyên dụng.
Bước 2: Bộc lộ kháng nguyên bằng
dung dịch bộc lộ, thời gian ủ: 92 phút.
Bước 3: Khử protein nội sinh bằng
Peroxydase.
Bước 4: Kháng thể 1 PD-L1: ủ 50
phút.
Bước 5: Dùng chất tăng sự kết nối
kháng thể 1 và kháng thể 2: 12 phút
Bước 6; Kháng thể 2: 12 phút
Bước 7: Chất khuếch đại tín hiệu:
8 phút
Bước 8: Dung dịch nhuộm nhân tế
bào: 12 phút
Bước 9: Dung dịch làm xanh
nhân: 4 phút
Giữa các bước phải rửa tiêu bản
bằng dung dịch rửa. Trong quá trình ủ hóa chất đều phủ dung dịch dầu khoáng lên
tiêu bản để chống bay hơi.
Bước 10: Khử nước, gắn lá kính.
Bước 11: Sắp xếp tiêu bản đã
nhuộm phù hợp tên tuổi, mã số của giấy chỉ định, gửi bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc
và phân tích kết quả.
4.2. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.2.1. Đọc kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm
Hematoxylin Eosin nhằm đánh giá vùng u và vùng lành.
- Đánh giá tiêu bản chứng âm,
dương, chứng nội (in-house control):
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm chính.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
- Đánh giá tiêu bản mẫu phẩm
nhuộm: Các tiêu chí đánh giá gồm:
+ Tế bào u có bộc lộ: khi màng
bào tương bắt màu nâu nhạt của thuốc nhuộm một phần hoặc toàn bộ.
+ Tế bào miễn dịch có bộc lộ: gồm
lympho bào và đại thực bào trong vùng đệm bào trong và xung quanh u. Trong đó
màng tế bào hoặc tế bào chất bắt màu toàn bộ hoặc một phần.
+ Tuỳ vào từng cơ quan PD-L1 được
đánh giá bằng chỉ số TC, IC, CPS hoặc TPS theo hướng dẫn Quốc tế:
CPS = [(Tổng số tế bào
u,lympho,đại thực bào bắt màu)/(Tổng số tế bào u)] x 100.
TPS = [Số tế bào u bắt màu)/(Tổng
số tế bào u)] x 100%.
- Tuỳ theo từng cơ quan hoặc từng
loại hoá chất có các khuyến cáo khác nhau về trong việc đánh giá PD-L1 là dương
tính hay âm tính
4.2.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở;
Lưu khối nến và tiêu bản theo quy định của cơ sở.
5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
KHÔNG
CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế dung dịch khử paraffin mới
|
|
Nhiệt độ ủ không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian
|
|
Thời gian ủ với kháng thể 1
quá ngắn
|
Tăng thời gian ủ với kháng thể
1
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN
HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau
trên bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng và đảm
bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch khi
bơm
|
NHUỘM
NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa
|
- Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
- Kiểm tra lại nhiệt độ buồng
rửa
|
|
Thời gian ủ với kháng thể lâu
|
- Giảm thời gian ủ
|
MẤT
HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
- Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
- Giảm thời gian bộc lộ
|
Chú ý:
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất
thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Tuân thủ quy trình kiểm tra
chất lượng.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 201
71. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI
DẤU ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT TIÊU BẢN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
- Xét nghiệm hóa miễn dịch giúp
xác định nguồn gốc của tế bào ung thư, phân loại, tiên lượng bệnh ung thư, tiên
đoán đáp ứng điều trị và đặc biệt là xác định chính xác các “đích điều trị” nhằm
giúp cho lâm sàng chọn lựa đúng thuốc, đúng phác đồ cho mỗi loại ung thư. Tuy
nhiên trong thực hành có nhiều trường hợp tế bào u lấy được rất ít vì vị trí
khó tiếp cận hoặc do kỹ thuật ít xâm lấn; không còn đủ số lượng do đã thực hiện
nhiều xét nghiệm khác hoặc u phát hiện sớm nên kích thước nhỏ. Vì vậy, với sự
phát triển của các kỹ thuật hiện đại thì kỹ thuật nhuộm đồng thời hai hoặc nhiều
dấu ấn (Cooctail, Multiplex) đã ra đời nhằm đáp ứng nhu cầu thực hành lâm sàng.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Định nghĩa: Nhuộm hóa
miễn dịch (Immunochemistry) bao gồm cả Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry -
IHC) và Hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry - ICC) là một kỹ thuật được sử
dụng để xác định sự hiện diện và phân bố của các protein hoặc các phân tử khác
trong các mẫu sinh học. Kỹ thuật này dựa vào các kháng thể đặc hiệu để gắn kết
với các kháng nguyên đích trong mô, sau đó sử dụng các chất nhuộm màu có thể
quan sát được.
- Nguyên lý: Hóa mô miễn
dịch là phương pháp xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế
bào, dựa trên sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, có thể gắn kết trực tiếp hoặc
gián tiếp. Kháng thể thứ nhất sẽ được gắn kết với phức hợp màu giúp quan sát được
dưới kính hiển vi quang học. Kháng thể thứ 2 trở đi được gắn kết với phức hợp
màu giúp quan sát được dưới kính hiển vi quang học nhưng không trùng màu sắc với
phức hợp màu đã gắn ở kháng thể trước đó.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
2.2. Vật tư
- Vật tư :
|
STT
|
Tên dụng cụ, vật tư
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Lam kính
|
Cái
|
|
2
|
Lá kính dán tiêu bản (lamen)
|
Cái
|
|
3
|
Nhãn dán
|
Cái
|
|
4
|
Bể nhuộm bằng thủy tinh
|
Cái
|
|
5
|
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
|
Cái
|
|
6
|
Giá đựng tiêu bản
|
Cái
|
|
7
|
Cốc đong
|
Cái
|
|
8
|
Găng tay
|
Cái
|
|
9
|
Khẩu trang
|
Cái
|
|
10
|
Kính bảo hộ
|
Cái
|
|
11
|
Lưỡi dao cắt lát mỏng
|
Cái
|
|
12
|
Ống hút (Pipette) tự động
|
Cái
|
- Hoá chất, sinh phẩm:
|
STT
|
Hóa chất, sinh phẩm
|
Số lượng
|
Điều kiện bảo quản
|
|
1
|
Bộ kit DAB theo máy
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
2
|
Các loại kháng thể
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
3
|
Dung dịch EZ Prep
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
4
|
Dung dịch LCS
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
5
|
Dung dịch CC1
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
6
|
Dung dịch SSC
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
7
|
Dung dịch Reaction buffer
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
8
|
Dung dịch CC2
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
9
|
Dung dịch Option
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
10
|
Bộ nhuộm H&E (nếu cần)
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
2.3. Trang thiết bị
|
STT
|
Tên thiết bị
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Máy nhuộm hóa miễn dịch tự động
|
Cái
|
|
2
|
Bàn sấy tiêu bản
|
Cái
|
|
3
|
Kính hiển vi để kiểm tra kết
nhuộm quả
|
Cái
|
|
4
|
Tủ ấm 37°C
|
Cái
|
|
5
|
Tủ hút phòng thí nghiệm
|
Cái
|
|
6
|
Máy cắt lát mỏng (microtome)
|
Cái
|
|
7
|
Tủ lạnh lưu kháng thể
|
Cái
|
|
8
|
Bể nhuộm
|
Cái
|
|
9
|
Bể căng mô
|
Cái
|
|
10
|
Bàn làm lạnh
|
Cái
|
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh
phẩm đã được cắt lọc, xử lý mô và vùi trong khối paraffin. Với tiêu bản tế bào:
phiến đồ chưa nhuộm bằng phương pháp nào khác hoặc mẫu tiêu bản đã nhuộm với
phương pháp nhuộm tế bào học khác.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: còn
đủ tế bào u, đảm bảo chất lượng (cố định đúng dung dịch cố định, đủ thể tích, đảm
bảo chất lượng hóa chất, quy trình xử lý). Với tiêu bản tế bào đã nhuộm bằng
phương pháp khác thì đã xử lý ngâm trong xylen để loại bỏ lá kính và tẩy rửa
màu nhuộm trong cồn 96.
- Vật liệu nội kiểm: Mẫu bệnh
phẩm làm mô chứng đã được BS GPB tuyển chọn để cố định, cắt lọc, xử lý mô và vùi
trong khối paraffin theo quy trình chọn mẫu nội kiểm.
- Thông tin nhận diện mẫu bệnh
phẩm: Mã số tiêu bản, số thứ tự block (nếu có), tên vị trí lấy mẫu, số lượng mẫu
trên nhãn.
1.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Ghi đầy đủ thông tin bệnh
nhân.
- Ghi đầy đủ thông tin lâm sàng
và các dấu ấn, chỉ định nhuộm từ bác sĩ giải phẫu bệnh hoặc bác sĩ lâm sàng.
- Đã được vị trí nhận mẫu xác
nhận và có đầy đủ các mã số cho từng dấu ấn.
1.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Khoảng 3-6 giờ tùy thuộc từng loại
dấu ấn khác nhau.
1.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
Phòng hóa mô miễn dịch – Khoa
Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
- Quy định về an toàn cho người
thực hiện và dự phòng nguy cơ trước, trong và sau phơi nhiễm (Theo quy định của
khoa).
- Quy định hiệu chuẩn vật tư,
thiết bị (Định kỳ theo quy định hiệu chuẩn vật tư, thiết bị của khoa).
- Quy định về an toàn điện và
phòng tránh cháy nổ (Theo quy định của khoa).
- Quy định về an toàn hóa chất:
có bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất (có thể xây dựng quy định riêng nếu
cần).
- Quy định về an toàn sinh học:
đảm bảo an toàn sinh học.
- Quy định kiểm soát môi trường:
yếu tố vi khí hậu: nhiệt độ không quá 30 độ C, độ ẩm không quá 70%, ánh sáng:
tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào máy và kháng thể, tiếng ồn không vượt quá
55dBA…
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
|
STT
|
Các bước thực hiện
|
Diễn giải
|
Thời gian thực hiện
|
Người thực hiện
|
Người phối hợp
|
|
1
|
Nhận mẫu
|
- Nhận giấy chỉ định từ vị
trí nhận mẫu. Sắp xếp giấy chỉ định theo thứ tự mã số từ nhỏ tới lớn.
- Kiểm tra hệ thống LIS các
ca nhuộm trước để tránh nhuộm trùng .
- Tìm mẫu (block, tiêu bản)
theo yêu cầu trên giấy chỉ định nhuộm.
- Chọn biểu tượng hệ thống
nhuộm trên máy vi tính. Bật nút nguồn của máy hoá miễn dich.
|
15 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
2
|
Chuẩn bị trước khi nhuộm
|
- Tìm mẫu chứng các kháng thể.
Kiểm tra và dán nhãn lên tiêu bản chuyên dụng cho nhuộm hoá mô miễn dịch.
- Kiểm tra, đối chiếu lại giấy
chỉ định và các tiêu bản đã soạn để đảm bảo đã đúng và đủ dấu ấn, mô chứng đã
đúng.
- Lập danh sách kháng thể cần
chuẩn bị hoặc pha loãng.
|
3 giờ
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
3
|
Nhuộm bằng máy hóa miễn dịch
tự động
|
- Cắt mỏng đẹp từ block mô chứng
và block mô bệnh với độ dày lát cắt 3-4um, vớt lên tiêu bản nhuộm hóa miễn dịch
và tiêu bản H&E (với mẫu mô học). Sử dụng nước cất trong buồng vớt mô ở
nhiệt độ 37-40 độ C.
- Để ráo. Ủ ở 37 độ C qua
đêm. Hoặc sấy 60 độ C tối thiểu 2 giờ 30 phút nếu cần nhuộm khẩn.
- Để các tiêu bản có cùng
kháng thể gần nhau và theo thứ tự.
- Kiểm tra các hoá chất cơ bản,
bộ kit, kháng thể và thùng chứa nước thải trên máy nhuộm.
- Chuẩn bị máy nhuộm: Nhấn
nút “Ready”, ấn mở các vị trí nhuộm, kiểm tra các vị trí nhuộm, đảm bảo đã rửa
sạch hóa chất cũ
- Cho tiêu bản đã dán nhãn
vào máy theo thứ tự. Kiểm tra để đảm bảo tiêu bản đã nằm chắc chắn trong 4 mấu
giữ tiêu bản bằng cách di chuyển tiêu bản đảm bảo tiêu bản chạm 4 mấu. Đóng
máy. Chọn "Running", ấn nút OK. Theo dõi để chắc chắn máy đã chạy ổn
ở tất cả các vị trí.
|
3-6 giờ
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
4
|
Pha kháng thể
|
- Pha kháng thể nhỏ tay (nếu
có) theo thứ tự trong danh sách. Pha theo tỷ lệ pha kháng thể nhà sản xuất
khuyến cáo (có ghi trên lọ kháng thể) với dung dịch pha loãng kháng thể. Lưu
trữ trong tủ lạnh 2-8 độ C.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
5
|
Lưu thông tin nhuộm
|
- Nhập đầy đủ thông tin ca bệnh
vào hệ thống quản lý những ca đã/ đang nhuộm. Viết ngày nhuộm lên phiếu chỉ định.
|
10 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
6
|
Nhỏ kháng thể lên tiêu bản
|
- Khi máy báo nhỏ kháng thể
(titration) thì ấn nút để mở vị trí chứa tiêu bản, nhỏ kháng thể lên tiêu bản,
luôn luôn chú ý kiểm tra giữa kháng thể và dấu ấn trên nhãn tiêu bản.
- Ấn nút vị trí chứa tiêu bản
1 lần nữa để đóng, tiếp tục ấn giữ nút để tiếp tục nhuộm.
|
15 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
7
|
Rửa, hoàn thiện tiêu bản (Nếu
tiêu bản đã được nhuộm tương phản, bỏ qua bước 8,9)
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
- Dán lamell.
|
|
|
|
|
8
|
Lọc Hematoxylin
|
Lọc Hematoxylin. Thay cồn
99,5°
|
5 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
9
|
Nhuộm Hematoxylin
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch.
- Rửa lại bằng nước cất.
- Nhuộm Hematoxylin trong 1
phút
- Rửa nước.Tẩy Hematoxylin thừa
bằng acid cồn 0,5%
- Rửa nước. Nhúng qua dung dịch
NH4OH 1% hoặc bluing reagent trong 15 giây
- Rửa nước. rửa qua cồn 99,5°
trong 30 giây.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
- Dán lamell
- Kiểm tra mẫu chứng
|
3 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
10
|
Viết mã GPB lên tiêu bản và xếp
lam cho BS GPB
|
- Sắp xếp các tiêu bản
H&E (nếu có) đối chứng và tiêu bản hóa miễn dịch theo giấy chỉ định từng ca.
Kiểm tra, đối chiếu lại 1 lần nữa các tiêu bản với yêu cầu trên giấy chỉ định. Ghi
rõ ngày chuyển tiêu bản lên giấy.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
4.2. Nhận định kết quả
- Xem xét kết quả QC (chạy song
song kèm mẫu mô chứng): Trong khi tiến hành nhuộm, việc kiểm tra chất lượng là
hết sức quan trọng, để đảm bảo loại trừ các khả năng dương tính giả và âm tính
giả. Phải có các mảnh cắt chứng dương tính và âm tính được nhuộm kèm theo. Giới
hạn ngưỡng kết quả nội kiểm: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân tế
bào và hành động khắc phục khi QC không đạt: nhuộm lại. QC đạt yêu cầu sẽ được
BS GPB đọc kết quả xét nghiệm.
- Đọc kết quả và nhận định kết
quả (BS GPB):
+ Đọc kết quả (có thể là bán định
lượng, định tính) dựa trên kết quả quan sát của BS GPB.
+ Nhận định kết quả:
Âm tính: không có sự hiện diện
của phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, không được hiển thị bằng
màu.
Dương tính: có sự hiện diện của
phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, được hiển thị bằng màu.
Tùy vào bộ hóa chất gắn màu thì màu sắc phức hợp hiển thị khác nhau (thường
dùng là vàng nâu hoặc đỏ tương ứng với 2 kháng thể). Dương tính có thể xảy ra với
1 hoặc 2 hoặc nhiều kháng thể khác nhau.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả theo quy trình
liên quan, ghi vào biểu mẫu.
- Kết quả được ghi vào phiếu
xét nghiệm, in bảng giấy hoặc trả bảng điện tử (có chữ ký của BS đọc kết quả)
- Lưu hồ sơ giấy chỉ định nhuộm
theo quy định của khoa.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính
10% thì khả năng bộc lộ kháng
nguyên rất thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Việc loại bỏ nhẹ nhàng lá
kính đối với tiêu bản tế bào học đã nhuộm bằng phương pháp khác rất quan trọng.
Không được cố gắng cạy lá kính vì có thể làm bong tróc mất tế bào. Cần ngâm
trong xylen để lá kính tự bong khoảng 4-12 giờ.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Luôn kiểm tra đối chiếu kháng
thể (trường hợp kháng thể nhỏ tay) và tên kháng thể trên nhãn tiêu bản tránh nhỏ
nhằm kháng thể.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
- Nếu mô chứng và mô bênh âm
tính giả, phải kiểm tra lại hạn dùng, nồng độ của toàn bộ hóa chất, kháng thể,
nhiệt độ quá nóng, mô quá khô.
- Mô bị nhuộm nền do sử dụng nồng
độ quá cao, mô cố định xấu, có nhiều hoại tử hoặc mẫu mô còn nhiều biotin nội
sinh và peroxidase nội sinh.
- Lát cắt bị bong tróc, mất
tính toàn vẹn sau nhuộm: cần thực hiện lại quy trình.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bộ Y tế (2014). Thông tư số 50/2014/TT-BYT ngày 26 tháng 12 năm 2014 quy định
việc phân loại phẫu thuật, thủ thuật và định mức nhân lực trong từng ca phẫu
thuật, thủ thuật.
Bộ Y tế (2017). Hướng dẫn quy
trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Tế bào học. Nhà xuất bản Y học, Hà
Nội.
72. XÉT NGHIỆM HOÁ TẾ BÀO MIỄN DỊCH TRÊN PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT
TIÊU BẢN CHO MỘT DẤU ẤN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Xét nghiệm hóa tế bào miễn dịch
để xác định nguồn gốc của tế bào ung thư, hỗ trợ phân loại điều trị nhằm giúp
cho lâm sàng chọn lựa đúng phác đồ xử trí cho mỗi loại ung thư
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Định nghĩa: Nhuộm hóa tế bào
miễn dịch (Immunocytochemistry – ICC) là một kỹ thuật được sử dụng để xác định
sự hiện diện và phân bố của các protein hoặc các phân tử khác trong các mẫu/
phiến đồ tế bào học. Kỹ thuật này dựa vào các kháng thể đặc hiệu để gắn kết với
các kháng nguyên đích, sau đó sử dụng các chất nhuộm màu có thể quan sát được.
- Nguyên lý: Hóa tế bào miễn dịch
là phương pháp xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong tế bào, dựa trên sự
kết hợp kháng nguyên - kháng thể, có thể gắn kết trực tiếp hoặc gián tiếp.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y : 02
2.2. Vật tư
- Vật tư:
|
STT
|
Tên dụng cụ, vật tư
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Lam kính
|
Cái
|
|
2
|
Lá kính dán tiêu bản (lamen)
|
Cái
|
|
3
|
Nhãn dán
|
Cái
|
|
4
|
Bể nhuộm bằng thủy tinh
|
Cái
|
|
5
|
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
|
Cái
|
|
6
|
Giá đựng tiêu bản
|
Cái
|
|
7
|
Cốc đong
|
Cái
|
|
8
|
Găng tay
|
Cái
|
|
9
|
Khẩu trang
|
Cái
|
|
10
|
Kính bảo hộ
|
Cái
|
|
11
|
Lưỡi dao cắt lát mỏng
|
Cái
|
|
12
|
Ống hút (Pipette) tự động
|
Cái
|
- Hoá chất, sinh phẩm :
|
STT
|
Hóa chất, sinh phẩm
|
Số lượng
|
Điều kiện bảo quản
|
|
1
|
Bộ kit DAB theo máy
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
2
|
Các loại kháng thể
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
3
|
Dung dịch EZ Prep
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
4
|
Dung dịch LCS
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
5
|
Dung dịch CC1
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
6
|
Dung dịch SSC
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
7
|
Dung dịch Reaction buffer
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
8
|
Dung dịch CC2
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
9
|
Dung dịch Option
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
10
|
Bộ nhuộm H&E
(GPB-QTKT-04) (nếu cần)
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
2.3. Trang thiết bị
|
STT
|
Tên thiết bị
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Máy nhuộm hóa miễn dịch tự động
|
Cái
|
|
2
|
Bàn sấy tiêu bản
|
Cái
|
|
3
|
Kính hiển vi để kiểm tra kết
nhuộm quả
|
Cái
|
|
4
|
Tủ ấm 37°C
|
Cái
|
|
5
|
Tủ hút phòng thí nghiệm
|
Cái
|
|
6
|
Máy cắt lát mỏng (microtome)
|
Cái
|
|
7
|
Tủ lạnh lưu kháng thể
|
Cái
|
|
8
|
Bể nhuộm
|
Cái
|
|
9
|
Bể căng mô
|
Cái
|
|
10
|
Bàn làm lạnh
|
Cái
|
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại mẫu bệnh phẩm: phiến đồ chưa
nhuộm bằng phương pháp nào khác hoặc mẫu tiêu bản đã nhuộm với phương pháp nhuộm
tế bào học khác.
- Tiêu chuẩn mẫu: còn đủ tế bào
u, đảm bảo chất lượng (cố định đúng dung dịch cố định tế bào học, với tiêu bản
đã nhuộm bằng phương pháp khác thì đã xử lý ngâm trong xylen để loại bỏ lá
kính)
- Vật liệu nội kiểm: Mẫu mô chứng
đã được bác sĩ Giải phẫu bệnh tuyển chọn để cố định, cắt lọc, xử lý mô và vùi
trong khối paraffin theo quy trình.
- Thông tin nhận diện mẫu bệnh
phẩm: Mã số tiêu bản.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Ghi đầy đủ thông tin bệnh
nhân
- Ghi đầy đủ thông tin lâm sàng
và các dấu ấn, chỉ định nhuộm HTBMD từ bác sĩ giải phẫu bệnh hoặc bác sĩ lâm
sàng.
- Đã được vị trí nhận mẫu xác
nhận và có đầy đủ các mã số cho từng dấu ấn.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Khoảng 3-6 giờ tùy thuộc từng
loại dấu ấn khác nhau.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
Phòng hóa miễn dịch – Khoa Giải
phẫu bệnh
3. AN TOÀN
- Quy định về an toàn cho người
thực hiện và dự phòng nguy cơ trước, trong và sau phơi nhiễm (Theo quy định của
khoa).
- Quy định hiệu chuẩn vật tư,
thiết bị (Định kỳ theo quy định hiệu chuẩn vật tư, thiết bị của khoa).
- Quy định về an toàn điện và phòng
tránh cháy nổ (Theo quy định của khoa).
- Quy định về an toàn hóa chất:
có bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất (có thể xây dựng quy định riêng nếu
cần).
- Quy định về an toàn sinh học:
đảm bảo an toàn sinh học.
- Quy định kiểm soát môi trường:
yếu tố vi khí hậu: nhiệt độ không quá 30 độ C, độ ẩm không quá 70%, ánh sáng:
tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào máy và kháng thể, tiếng ồn không vượt quá
55dBA…
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị:
Chuẩn bị mẫu:
- Tìm lại tiêu bản tế bào học
tương ứng với mẫu của bệnh nhân được yêu cầu.
- Mẫu chưa nhuộm (nếu có). Chuẩn
bị hoá chất, vật tư, thiết bị:
- Bật hệ thống máy tính và phần
mềm, hệ thống máy nhuộm.
- Kiểm tra, đối chiếu lại giấy
chỉ định và các tiêu bản đã soạn để đảm bảo đã đúng và đủ dấu ấn, mô chứng đã
đúng.
- Lập danh sách kháng thể cần
chuẩn bị hoặc pha loãng.
- Cắt mỏng đẹp từ block mô chứng
được chọn với độ dày lát cắt 3-4um, vớt lên tiêu bản cần nhuộm ở vị trí còn trống.
Sử dụng nước cất trong buồng vớt mô ở nhiệt độ 37-40 độ C.
- Để ráo. Ủ ở 37 độ C qua đêm.
Hoặc sấy 60 độ C tối thiểu 2 giờ 30 phút nếu cần nhuộm khẩn.
- Để các tiêu bản có cùng kháng
thể gần nhau và theo thứ tự.
- Kiểm tra các hoá chất cơ bản,
bộ kit, kháng thể và thùng chứa nước thải trên máy nhuộm.
- Chuẩn bị máy nhuộm: Nhấn nút
“Ready”, ấn mở các vị trí nhuộm, kiểm tra các vị trí nhuộm, đảm bảo đã rửa sạch
hóa chất cũ.
4.2. Các bước nhuộm:
|
STT
|
Các bước thực hiện
|
Diễn giải
|
Thời gian thực hiện
|
Người thực hiện
|
Người phối hợp
|
|
1
|
Nhuộm bằng máy hóa miễn dịch
tự động
|
- Cho tiêu bản đã dán nhãn
vào máy theo thứ tự. Kiểm tra để đảm bảo tiêu bản đã nằm chắc chắn trong 4 mấu
giữ tiêu bản bằng cách di chuyển tiêu bản đảm bảo tiêu bản chạm 4 mấu. Đóng
máy. Chọn "Running", ấn nút OK. Theo dõi để chắc chắn máy đã chạy ổn
ở tất cả các vị trí.
|
3-6 giờ
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
2
|
Pha kháng thể
|
- Pha kháng thể nhỏ tay (nếu
có) theo thứ tự trong danh sách. Pha theo tỷ lệ pha kháng thể nhà sản xuất
khuyến cáo (có ghi trên lọ kháng thể) với dung dịch pha loãng kháng thể. Lưu
trữ trong tủ lạnh 2-8 độ C.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
3
|
Lưu thông tin nhuộm
|
- Nhập đầy đủ thông tin ca bệnh
vào hệ thống quản lý những ca đã/ đang nhuộm. Viết ngày nhuộm lên phiếu chỉ định.
|
10 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
4
|
Nhỏ kháng thể lên tiêu bản
|
- Khi máy báo nhỏ kháng thể (titration)
thì ấn nút để mở vị trí chứa tiêu bản, nhỏ kháng thể lên tiêu bản, luôn luôn
chú ý kiểm tra giữa kháng thể và dấu ấn trên nhãn tiêu bản.
- Ấn nút vị trí chứa tiêu bản
1 lần nữa để đóng, tiếp tục ấn giữ nút để tiếp tục nhuộm.
|
15 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
5
|
Rửa, hoàn thiện tiêu bản (Nếu
tiêu bản đã được nhuộm tương phản, bỏ qua bước 8,9)
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
- Dán lamell.
|
|
|
|
|
6
|
Lọc Hematoxylin
|
Lọc Hematoxylin. Thay cồn
99,5°
|
5 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
7
|
Nhuộm Hematoxylin
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch
- Rửa lại bằng nước cất.
- Nhuộm Hematoxylin trong 1
phút
- Rửa nước.Tẩy Hematoxylin thừa
bằng acid cồn 0,5%
- Rửa nước. Nhúng qua dung dịch
NH4OH 1% hoặc bluing reagent trong 15 giây
- Rửa nước. rửa qua cồn 99,5°
trong 30 giây.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
|
3 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
8
|
Viết mã GPB lên tiêu bản và xếp
lam cho BS GPB
|
- Dán lamell
- Kiểm tra mẫu chứng
- Sắp xếp các tiêu bản theo
giấy chỉ định từng ca. Ghi rõ ngày chuyển tiêu bản lên giấy.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
4.3. Nhận định kết quả
- Xem xét kết quả QC (chạy song
song kèm mẫu mô chứng): Trong khi tiến hành nhuộm HTBMD, việc kiểm tra chất lượng
là hết sức quan trọng, để đảm bảo loại trừ các khả năng dương tính giả và âm tính
giả. Phải có các mảnh cắt chứng dương tính và âm tính được nhuộm kèm theo. Giới
hạn ngưỡng kết quả nội kiểm: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân tế
bào và hành động khắc phục khi QC không đạt: nhuộm lại. QC đạt yêu cầu sẽ được
BS GPB đọc kết quả xét nghiệm.
- Đọc kết quả và nhận định kết
quả (BS GPB):
+ Đọc kết quả (có thể là bán định
lượng, định tính) dựa trên kết quả quan sát của BS GPB.
+ Nhận định kết quả:
Âm tính: không có sự hiện diện
của phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào, không được hiển thị bằng màu
vàng nâu.
Dương tính: có sự hiện diện của
phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào, được hiển thị bằng màu vàng nâu.
4.4. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả theo quy trình
liên quan, ghi biểu mẫu.
- Kết quả được ghi vào phiếu
xét nghiệm, in bảng giấy hoặc trả bảng điện tử (có chữ ký của BS đọc kết quả)
- Lưu hồ sơ giấy chỉ định nhuộm
HTBMD theo quy định của khoa.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
Việc loại bỏ nhẹ nhàng lá kính
đối với tiêu bản tế bào học đã nhuộm bằng phương pháp khác rất quan trọng.
Không được cố gắng cạy lá kính vì có thể làm bong tróc mất tế bào. Cần ngâm
xylen từ 4-12 giờ để lá kính tự bong.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Luôn kiểm tra đối chiếu kháng
thể (trường hợp kháng thể nhỏ tay) và tên kháng thể trên nhãn tiêu bản tránh nhỏ
nhằm kháng thể
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
- Nếu lát mô chứng âm tính giả,
phải kiểm tra lại hạn dùng, nồng độ của toàn bộ hóa chất, kháng thể, nhiệt độ
quá nóng, mô quá khô.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Lát mô chứng bắt màu đúng ở
chứng dương.
- Tuân thủ nghiêm ngặt quy
trình nhuộm về nồng độ, thời gian của dung dịch.
- Thực hiện nội kiểm chất lượng:
Theo quy định nội kiểm chất lượng.
- Thực hiện ngoại kiểm hoặc so
sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù (Nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bộ Y tế (2024). Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 26 tháng 12 năm 2014 quy định
việc phân loại phẫu thuật, thủ thuật và định mức nhân lực trong từng ca phẫu
thuật, thủ thuật.
Bộ Y tế (2017). Hướng dẫn quy
trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Tế bào học. Nhà xuất bản Y học, Hà
Nội.
Bộ Y tế (2013). Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25 tháng 12 năm 2013, Hướng dẫn
quy trình kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh tế bào học.
73. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI DẤU
ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC TIÊU BẢN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
- Xét nghiệm hóa miễn dịch giúp
xác định nguồn gốc của tế bào ung thư, phân loại, tiên lượng bệnh ung thư, tiên
đoán đáp ứng điều trị và đặc biệt là xác định chính xác các “đích điều trị” nhằm
giúp cho lâm sàng chọn lựa đúng thuốc, đúng phác đồ cho mỗi loại ung thư. Tuy
nhiên trong thực hành có nhiều trường hợp tế bào u lấy được rất ít vì vị trí
khó tiếp cận hoặc do kỹ thuật ít xâm lấn; không còn đủ số lượng do đã thực hiện
nhiều xét nghiệm khác hoặc u phát hiện sớm nên kích thước nhỏ. Vì vậy, với sự
phát triển của các kỹ thuật hiện đại thì kỹ thuật nhuộm đồng thời hai hoặc nhiều
dấu ấn (Cooctail, Multiplex) đã ra đời nhằm đáp ứng nhu cầu thực hành lâm sàng.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Định nghĩa: Nhuộm hóa
miễn dịch (Immunochemistry) bao gồm cả Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry -
IHC) và Hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry - ICC) là một kỹ thuật được sử
dụng để xác định sự hiện diện và phân bố của các protein hoặc các phân tử khác
trong các mẫu sinh học. Kỹ thuật này dựa vào các kháng thể đặc hiệu để gắn kết
với các kháng nguyên đích trong mô, sau đó sử dụng các chất nhuộm màu có thể
quan sát được.
- Nguyên lý: Hóa mô miễn
dịch là phương pháp xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế
bào, dựa trên sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, có thể gắn kết trực tiếp hoặc
gián tiếp. Kháng thể thứ nhất sẽ được gắn kết với phức hợp màu giúp quan sát được
dưới kính hiển vi quang học. Kháng thể thứ 2 trở đi được gắn kết với phức hợp
màu giúp quan sát được dưới kính hiển vi quang học nhưng không trùng màu sắc với
phức hợp màu đã gắn ở kháng thể trước đó.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
2.2. Vật tư
- Vật tư :
|
STT
|
Tên dụng cụ, vật tư
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Lam kính
|
Cái
|
|
2
|
Lá kính dán tiêu bản (lamen)
|
Cái
|
|
3
|
Nhãn dán
|
Cái
|
|
4
|
Bể nhuộm bằng thủy tinh
|
Cái
|
|
5
|
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
|
Cái
|
|
6
|
Giá đựng tiêu bản
|
Cái
|
|
7
|
Cốc đong
|
Cái
|
|
8
|
Găng tay
|
Cái
|
|
9
|
Khẩu trang
|
Cái
|
|
10
|
Kính bảo hộ
|
Cái
|
|
11
|
Lưỡi dao cắt lát mỏng
|
Cái
|
|
12
|
Ống hút (Pipette) tự động
|
Cái
|
- Hoá chất, sinh phẩm:
|
STT
|
Hóa chất, sinh phẩm
|
Số lượng
|
Điều kiện bảo quản
|
|
1
|
Bộ kit DAB theo máy
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
2
|
Các loại kháng thể
|
ml
|
2-8 độ C
|
|
3
|
Dung dịch EZ Prep
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
4
|
Dung dịch LCS
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
5
|
Dung dịch CC1
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
6
|
Dung dịch SSC
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
7
|
Dung dịch Reaction buffer
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
8
|
Dung dịch CC2
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
9
|
Dung dịch Option
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
|
10
|
Bộ nhuộm H&E (nếu cần)
|
ml
|
Nhiệt độ phòng, nơi khô ráo
|
2.3. Trang thiết bị
|
STT
|
Tên thiết bị
|
Đơn vị tính
|
|
1
|
Máy nhuộm hóa miễn dịch tự động
|
Cái
|
|
2
|
Bàn sấy tiêu bản
|
Cái
|
|
3
|
Kính hiển vi để kiểm tra kết
nhuộm quả
|
Cái
|
|
4
|
Tủ ấm 37°C
|
Cái
|
|
5
|
Tủ hút phòng thí nghiệm
|
Cái
|
|
6
|
Máy cắt lát mỏng (microtome)
|
Cái
|
|
7
|
Tủ lạnh lưu kháng thể
|
Cái
|
|
8
|
Bể nhuộm
|
Cái
|
|
9
|
Bể căng mô
|
Cái
|
|
10
|
Bàn làm lạnh
|
Cái
|
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Loại mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh
phẩm đã được cắt lọc, xử lý mô và vùi trong khối paraffin. Với tiêu bản tế bào:
phiến đồ chưa nhuộm bằng phương pháp nào khác hoặc mẫu tiêu bản đã nhuộm với
phương pháp nhuộm tế bào học khác.
- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: còn
đủ tế bào u, đảm bảo chất lượng (cố định đúng dung dịch cố định, đủ thể tích, đảm
bảo chất lượng hóa chất, quy trình xử lý). Với tiêu bản tế bào đã nhuộm bằng
phương pháp khác thì đã xử lý ngâm trong xylen để loại bỏ lá kính và tẩy rửa
màu nhuộm trong cồn 96.
- Vật liệu nội kiểm: Mẫu bệnh
phẩm làm mô chứng đã được BS GPB tuyển chọn để cố định, cắt lọc, xử lý mô và
vùi trong khối paraffin theo quy trình chọn mẫu nội kiểm.
- Thông tin nhận diện mẫu bệnh phẩm:
Mã số tiêu bản, số thứ tự block (nếu có), tên vị trí lấy mẫu, số lượng mẫu trên
nhãn.
1.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm
- Ghi đầy đủ thông tin bệnh
nhân.
- Ghi đầy đủ thông tin lâm sàng
và các dấu ấn, chỉ định nhuộm từ bác sĩ giải phẫu bệnh hoặc bác sĩ lâm sàng.
- Đã được vị trí nhận mẫu xác
nhận và có đầy đủ các mã số cho từng dấu ấn.
1.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Khoảng 3-6 giờ tùy thuộc từng
loại dấu ấn khác nhau.
1.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
Phòng hóa mô miễn dịch – Khoa
Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN
- Quy định về an toàn cho người
thực hiện và dự phòng nguy cơ trước, trong và sau phơi nhiễm (Theo quy định của
khoa).
- Quy định hiệu chuẩn vật tư,
thiết bị (Định kỳ theo quy định hiệu chuẩn vật tư, thiết bị của khoa).
- Quy định về an toàn điện và
phòng tránh cháy nổ (Theo quy định của khoa).
- Quy định về an toàn hóa chất:
có bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất (có thể xây dựng quy định riêng nếu
cần).
- Quy định về an toàn sinh học:
đảm bảo an toàn sinh học.
- Quy định kiểm soát môi trường:
yếu tố vi khí hậu: nhiệt độ không quá 30 độ C, độ ẩm không quá 70%, ánh sáng:
tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào máy và kháng thể, tiếng ồn không vượt quá
55dBA…
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
|
STT
|
Các bước thực hiện
|
Diễn giải
|
Thời gian thực hiện
|
Người thực hiện
|
Người phối hợp
|
|
1
|
Nhận mẫu
|
- Nhận giấy chỉ định từ vị
trí nhận mẫu. Sắp xếp giấy chỉ định theo thứ tự mã số từ nhỏ tới lớn.
- Kiểm tra hệ thống LIS các
ca nhuộm trước để tránh nhuộm trùng .
- Tìm mẫu (block, tiêu bản) theo
yêu cầu trên giấy chỉ định nhuộm.
- Chọn biểu tượng hệ thống
nhuộm trên máy vi tính. Bật nút nguồn của máy hoá miễn dich.
|
15 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
2
|
Chuẩn bị trước khi nhuộm
|
- Tìm mẫu chứng các kháng thể.
Kiểm tra và dán nhãn lên tiêu bản chuyên dụng cho nhuộm hoá mô miễn dịch.
- Kiểm tra, đối chiếu lại giấy
chỉ định và các tiêu bản đã soạn để đảm bảo đã đúng và đủ dấu ấn, mô chứng đã
đúng.
- Lập danh sách kháng thể cần
chuẩn bị hoặc pha loãng.
|
3 giờ
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
3
|
Nhuộm bằng máy hóa miễn dịch tự
động
|
- Cắt mỏng đẹp từ block mô chứng
và block mô bệnh với độ dày lát cắt 3-4um, vớt lên tiêu bản nhuộm hóa miễn dịch
và tiêu bản H&E (với mẫu mô học). Sử dụng nước cất trong buồng vớt mô ở
nhiệt độ 37-40 độ C.
- Để ráo. Ủ ở 37 độ C qua
đêm. Hoặc sấy 60 độ C tối thiểu 2 giờ 30 phút nếu cần nhuộm khẩn.
- Để các tiêu bản có cùng
kháng thể gần nhau và theo thứ tự.
- Kiểm tra các hoá chất cơ bản,
bộ kit, kháng thể và thùng chứa nước thải trên máy nhuộm.
- Chuẩn bị máy nhuộm: Nhấn
nút “Ready”, ấn mở các vị trí nhuộm, kiểm tra các vị trí nhuộm, đảm bảo đã rửa
sạch hóa chất cũ
- Cho tiêu bản đã dán nhãn
vào máy theo thứ tự. Kiểm tra để đảm bảo tiêu bản đã nằm chắc chắn trong 4 mấu
giữ tiêu bản bằng cách di chuyển tiêu bản đảm bảo tiêu bản chạm 4 mấu. Đóng
máy. Chọn "Running", ấn nút OK. Theo dõi để chắc chắn máy đã chạy ổn
ở tất cả các vị trí.
|
3-6 giờ
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
4
|
Pha kháng thể
|
- Pha kháng thể nhỏ tay (nếu
có) theo thứ tự trong danh sách. Pha theo tỷ lệ pha kháng thể nhà sản xuất
khuyến cáo (có ghi trên lọ kháng thể) với dung dịch pha loãng kháng thể. Lưu
trữ trong tủ lạnh 2-8 độ C.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
5
|
Lưu thông tin nhuộm
|
- Nhập đầy đủ thông tin ca bệnh
vào hệ thống quản lý những ca đã/ đang nhuộm. Viết ngày nhuộm lên phiếu chỉ định.
|
10 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
6
|
Nhỏ kháng thể lên tiêu bản
|
- Khi máy báo nhỏ kháng thể
(titration) thì ấn nút để mở vị trí chứa tiêu bản, nhỏ kháng thể lên tiêu bản,
luôn luôn chú ý kiểm tra giữa kháng thể và dấu ấn trên nhãn tiêu bản.
- Ấn nút vị trí chứa tiêu bản
1 lần nữa để đóng, tiếp tục ấn giữ nút để tiếp tục nhuộm.
|
15 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
7
|
Rửa, hoàn thiện tiêu bản (Nếu
tiêu bản đã được nhuộm tương phản, bỏ qua bước 8,9)
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
- Dán lamell.
|
|
|
|
|
8
|
Lọc Hematoxylin
|
Lọc Hematoxylin. Thay cồn
99,5°
|
5 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
9
|
Nhuộm Hematoxylin
|
- Khi máy báo tiêu bản đã nhuộm
xong, lấy ra rửa sạch.
- Rửa lại bằng nước cất.
- Nhuộm Hematoxylin trong 1
phút
- Rửa nước.Tẩy Hematoxylin thừa
bằng acid cồn 0,5%
- Rửa nước. Nhúng qua dung dịch
NH4OH 1% hoặc bluing reagent trong 15 giây
- Rửa nước. rửa qua cồn 99,5°
trong 30 giây.
- Để khô, vạch phân chia mô
chứng bằng bút lông xanh, đánh dấu vị trí chứng bằng bút lông đỏ ở mặt sau của
tiêu bản (mặt không có mô).
- Dán lamell
- Kiểm tra mẫu chứng
|
3 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
|
10
|
Viết mã GPB lên tiêu bản và xếp
lam cho BS GPB
|
- Sắp xếp các tiêu bản
H&E (nếu có) đối chứng và tiêu bản hóa miễn dịch theo giấy chỉ định từng
ca. Kiểm tra, đối chiếu lại 1 lần nữa các tiêu bản với yêu cầu trên giấy chỉ
định. Ghi rõ ngày chuyển tiêu bản lên giấy.
|
30 phút
|
KTV GPB
|
KTV GPB
|
4.2. Nhận định kết quả
- Xem xét kết quả QC (chạy song
song kèm mẫu mô chứng): Trong khi tiến hành nhuộm, việc kiểm tra chất lượng là
hết sức quan trọng, để đảm bảo loại trừ các khả năng dương tính giả và âm tính
giả. Phải có các mảnh cắt chứng dương tính và âm tính được nhuộm kèm theo. Giới
hạn ngưỡng kết quả nội kiểm: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân tế
bào và hành động khắc phục khi QC không đạt: nhuộm lại. QC đạt yêu cầu sẽ được
BS GPB đọc kết quả xét nghiệm.
- Đọc kết quả và nhận định kết
quả (BS GPB):
+ Đọc kết quả (có thể là bán định
lượng, định tính) dựa trên kết quả quan sát của BS GPB.
+ Nhận định kết quả:
Âm tính: không có sự hiện diện
của phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, không được hiển thị bằng
màu.
Dương tính: có sự hiện diện của
phức hợp kháng nguyên - kháng thể trên tế bào và mô, được hiển thị bằng màu.
Tùy vào bộ hóa chất gắn màu thì màu sắc phức hợp hiển thị khác nhau (thường
dùng là vàng nâu hoặc đỏ tương ứng với 2 kháng thể). Dương tính có thể xảy ra với
1 hoặc 2 hoặc nhiều kháng thể khác nhau.
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả theo quy trình
liên quan, ghi vào biểu mẫu.
- Kết quả được ghi vào phiếu
xét nghiệm, in bảng giấy hoặc trả bảng điện tử (có chữ ký của BS đọc kết quả)
- Lưu hồ sơ giấy chỉ định nhuộm
theo quy định của khoa.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.2. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Nếu bệnh phẩm không được cố định
trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất
thấp.
- Thời gian cố định quá lâu có
thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ
(bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
- Việc loại bỏ nhẹ nhàng lá
kính đối với tiêu bản tế bào học đã nhuộm bằng phương pháp khác rất quan trọng.
Không được cố gắng cạy lá kính vì có thể làm bong tróc mất tế bào. Cần ngâm
trong xylen để lá kính tự bong khoảng 4-12 giờ.
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
- Cần pha kháng thể theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc
dương tính giả.
- Luôn kiểm tra hạn sử dụng của
các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
- Luôn kiểm tra đối chiếu kháng
thể (trường hợp kháng thể nhỏ tay) và tên kháng thể trên nhãn tiêu bản tránh nhỏ
nhằm kháng thể.
5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật
- Nếu mô chứng và mô bênh âm
tính giả, phải kiểm tra lại hạn dùng, nồng độ của toàn bộ hóa chất, kháng thể,
nhiệt độ quá nóng, mô quá khô.
- Mô bị nhuộm nền do sử dụng nồng
độ quá cao, mô cố định xấu, có nhiều hoại tử hoặc mẫu mô còn nhiều biotin nội sinh
và peroxidase nội sinh.
- Lát cắt bị bong tróc, mất
tính toàn vẹn sau nhuộm: cần thực hiện lại quy trình.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Lát cắt mỏng đều, không trầy
xước, đủ mặt cắt, bắt màu đúng ở chứng dương.
- Tuân thủ nghiêm ngặt quy
trình nhuộm về nồng độ, thời gian của dung dịch.
- Thực hiện nội kiểm chất lượng:
Theo quy định nội kiểm chất lượng.
- Thực hiện ngoại kiểm hoặc so
sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù: Theo quy định ngoại kiểm chất lượng. (Nếu
có)
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bộ Y tế (2014). Thông tư số 50/2014/TT-BYT ngày 26 tháng 12 năm 2014 quy định
việc phân loại phẫu thuật, thủ thuật và định mức nhân lực trong từng ca phẫu
thuật, thủ thuật.
Bộ Y tế (2017). Hướng dẫn quy
trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Tế bào học. Nhà xuất bản Y học, Hà
Nội.
75. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này giúp phát hiện
kháng nguyên trên mẫu mô tươi dựa vào phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên có
trong mô và kháng thể thứ cấp có gắn chất phát quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kháng nguyên (KN) trong mô sẽ
phản ứng với kháng thể (KT) sơ cấp đặc hiệu. Sau đó, phức hợp KN-KT kết hợp với
KT thứ cấp đã gắn chất màu huỳnh quang (FITC fluorescence isothiocynate) có thể
phát sáng màu xanh táo khi quan sát bằng kính hiển vi (KHV) huỳnh quang dưới
ánh sáng của tia cực tím (ultraviolet light).
Chữ viết tắt
- FITC: Fluorescence
isothiocynate
- HE: Hematoxylin Eosin.
- KN: Kháng nguyên
- KT: Kháng thể
- MDHQ: Miễn dịch huỳnh quang.
- MSDS: Bảng chỉ dẫn an toàn
hóa chất (Material Data Safety Sheets)
- TBS: Dung dịch đệm duy trì pH
(Tris-Buffered Saline)
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện: Nhân
lực trực tiếp
Bác sỹ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 01
Hộ lý: 01
2.2. Vật tư
2.2.1. Hóa chất
|
Tên hóa chất
|
Đơn vị
|
|
Dung dịch pha loãng kháng thể
|
ml
|
|
Dung dịch đệm TBS (Wash
Buffer) pH 7,4
|
ml
|
|
Dung dịch kháng thể 1
|
Test
|
|
Dung dịch kháng thể 2
|
Test
|
|
Nước cất 2 lần (hoặc nước RO)
|
ml
|
|
Dung dịch rửa (Reaction
Bufer)
|
Test
|
|
Dung dịch dầu khoáng nhẹ
(Lique coverslip LCS)
|
Test
|
|
Dung dịch rửa tối ưu
(Opptional)
|
Test
|
|
Dung dịch rửa thứ cấp (SSC)
|
Test
|
|
Gel phủ mẫu tươi (cryomatric
OCT)
|
ml
|
|
Xịt đông lạnh nhanh (ICE-IT)
|
ml
|
|
Nước muối sinh lý NaCl 0,9%
|
ml
|
|
Dung dịch gắn huỳnh quang
(Fluorescence mounting medium)
|
ml
|
|
Dung dịch rửa tay
|
ml
|
|
Dung dịch khử khuẩn bề mặt
|
ml
|
|
Khử khuẩn Presept 2,5 gram
|
viên
|
2.2.2. Dụng cụ
- Que tãi bệnh phẩm.
- Kẹp không mấu các kích cỡ
- Giá để tiêu bản nằm, đứng.
- Bể nhuộm
- Pipet điện tử các loại
- Đầu col các loại
- Hộp nhựa đựng bệnh phẩm không
gamma
- Ống bảo quản mẫu nắp vặn vô
trùng 2ml
- Hộp nhựa đựng ống Cryo
1,5-2ml, 100 vị trí
- Chai code máy nhuộm đặc biệt
(User fillabel reagent)
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng)
- Thùng đựng rác thông thường
(màu xanh).
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính tích điện dương
super frost.
- Lá kính (lamelle)
- Pipet nhựa
- Giấy nhôm (Aluminium)
- Bút mỡ (dako pen)
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn
- Găng tay không bột tan
- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.
- Bút chì, bút dạ dầu.
- Giấy A4
- Giấy in tem chống thấm nước,
hóa chất
- Cuộn mực in tem
- Giấy thấm tiêu bản
- Giấy lau tay
- Túi đựng rác thải các loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh
- Máy nhuộm đặc biệt
- Máy gắn lamelle tự động
- Kính hiển vi quang học
- Kính hiển vi soi nổi
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Tủ hút mùi hóa chất
- Tủ đựng hóa chất chống cháy
lan
- Tủ đựng hóa chất có hệ thống
lọc khí, hóa chất
- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt
độ 2-8°C
- Tủ đông -20°C lưu mẫu đông lạnh
- Máy in tem/nhãn
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in barcode,
hệ thống thu âm) và lưu trữ bệnh phẩm.
- Hệ thống máy tính có phần mềm
chuyên dụng kết nối kính huỳnh quang
- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ
phòng 21-26°C, đảm bảo an toàn sinh học
- Phòng tối đọc tiêu bản huỳnh
quang
- Hệ thống lavabo cấp thoát nước
(có đường thải hóa chất độc hại)
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Các dụng cụ làm sạch trang
thiết bị, vật tư
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là mẫu mô tươi (ví
dụ: thận, da) sau khi sinh thiết và gửi ngay đến khoa GPB.
- Bác sĩ GPB kiểm tra chất lượng,
số lượng mẫu tươi dưới kính hiển vi soi nổi và phân chia mẫu cho nhuộm MDHQ. Mẫu
được cố định trong dung dịch Cryomatrix ở nhiệt độ -23°C.
- Cắt 01 tiêu bản dán trên lam
thường theo quy trình cắt lạnh. Nhuộm HE cho mẫu sinh thiết lạnh để xác định hướng
và thành phần của bệnh phẩm, đảm bảo mẫu đủ tiêu chuẩn nhuộm MDHQ.
- Cắt mẫu bệnh và mẫu chứng âm,
chứng dương thành các lát cắt mỏng, có độ dầy 5µm dán trên lam kính super frost
plus đã ghi nhãn. Số lượng và thứ tự các lát cắt theo quy định, tùy thuộc vào
loại dấu ấn miễn dịch huỳnh quang.
- Dùng bút dạ dầu khoanh quanh
vị trí lát cắt ở mặt dưới lam kính. Để khô 30 phút ở nhiệt độ phòng.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
loại xét nghiệm yêu cầu.
- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, thời
gian chỉ định, họ tên, chữ ký bác sĩ yêu cầu.
- Có ghi loại mẫu cần làm xét
nghiệm (mẫu tươi), thời gian lấy mẫu và họ tên người lấy mẫu..
- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu,
người bàn giao và người nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Tổng thời gian ước tính: 120 giờ,
trong đó:
- Thời gian chuẩn bị mẫu: 24 giờ
- Thời gian nhuộm: 24 giờ
- Thời gian phân tích kết quả,
trả kết quả: 72 giờ.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu
bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.
3. AN TOÀN:
Thực hiện quy định an toàn
phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1 Các bước thực hiện
|
Bước
|
Nội dung
|
Thời gian
|
|
1
|
Rửa các tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4.
|
5 phút
|
|
2
|
Làm ráo tiêu bản, lau viền
quanh bệnh phẩm, khoanh bút mỡ quanh bệnh phẩm và chứng.
|
|
|
3
|
Phủ kháng thể 1 trong phòng tối
(máy nhuộm đặc biệt hoặc hộp giữ ẩm)
|
40 phút
|
|
4
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 1 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
5
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 2 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
6
|
Phủ tiêu bản với kháng thể 2
gắn FITC trong phòng tối (máy nhuộm đặc biệt hoặc hộp giữ ẩm)
|
30 phút
|
|
7
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 1 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
8
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 2 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
9
|
Để tiêu bản khô tự nhiên
(phòng tối).
|
60 phút
|
|
10
|
Gắn lamelle bằng dung dịch gắn
huỳnh quang
|
|
|
11
|
Đánh giá chất lượng tiêu bản
nhuộm
|
|
|
12
|
Đặt tiêu bản trên khay bọc giấy
nhôm Aluminium.
|
|
|
13
|
Hoàn thiện và bàn giao tiêu bản
|
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Phân tích kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích, chụp ảnh nhuộm MDHQ trên tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh
quang và hệ thống phần mềm chuyên dụng.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE
trên kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm chứng
âm và chứng dương:
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm mẫu bệnh.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kỹ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
+ Tiêu chí đánh giá: Lắng đọng
miễn dịch hiển thị bằng màu xanh táo sáng tại các vị trí trên mô. Mô nền không
lắng đọng miễn dịch hiển thị bằng màu xanh nhạt đồng đều.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh
theo các tiêu chí:
+ Loại dấu ấn miễn dịch
+ Vị trí lắng đọng miễn dịch
+ Kiểu hình: hạt (granular), đường
(linear)
+ Cường độ: Không (0), vết
(0,5+), nhẹ (1+), vừa (2+), mạnh (3+), rất mạnh (4+).
4.2.2. Báo cáo kết quả xét nghiệm
và lưu trữ bệnh phẩm
- Trả kết quả theo các quy
trình liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và
người thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.
- Lưu mẫu tươi, tiêu bản và ảnh
chụp MDHQ theo quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian
quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Nhầm mẫu của BN này với BN
khác
|
- Không đối chiếu thông tin mẫu
đang làm và dụng cụ đặt mẫu khi phẫu tích bệnh phẩm.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng (nếu có thể)
|
|
|
- Đặt lát cắt của BN không
đúng mã GPB.
|
- Thực hiện lần lượt đối với
từng ca bệnh, đảm bảo kiểm tra, đối chiếu thông tin BN ở mỗi bước.
|
|
Sai mã GPB trên hệ thống phần
mềm
|
Đánh nhầm mã GPB khi nhập chỉ
định XN
|
- Sửa lại đúng mã GPB
- Cẩn thận khi nhập mã.
|
|
Mẫu chứng âm bị nền
|
Mẫu bị khô trong quá trình ủ
hoặc bị nhiễm chéo.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Không để mẫu bị khô trong
suốt quá trình thao tác. Thay đầu côn trước khi hút, pha chế hóa chất.
|
|
Mẫu chứng dương bị âm
|
- Hóa chất hỏng
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
|
|
|
- Mẫu chứng không đạt tiêu
chuẩn
- Thực hiện không đúng các bước
trong quy trình.
|
- Tuân thủ điều kiện bảo quản
hóa chất, tránh rã đông nhiều lần. Pha lại hóa chất mới
|
|
|
- Tiêu bản nhuộm mất màu theo
thời gian.
|
- Kiểm tra lại mẫu chứng
|
|
|
|
- Tuân thủ đúng theo quy
trình kỹ thuật.
|
|
|
|
- Đọc kết quả càng sớm càng tốt
do phức hợp MDHQ sẽ bị mất màu theo thời gian.
|
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Nhầm loại dấu ấn (kháng thể)
|
Không phủ đúng loại kháng thể
trên tiêu bản tương ứng với tên dấu ấn.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Đối chiếu loại kháng thể và
tên dấu ấn trên tiêu bản ở mỗi bước thực hiện
|
|
Tiêu bản chỉ được nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm
|
- Còn bọt khí trên tiêu bản
khi phủ hóa chất.
- Chỉ dùng lam kính thường
- Tiêu bản bị nghiêng hoặc để
hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc
nhuộm.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Loại bỏ bọt khí
- Cắt mẫu trên lam tích điện
dương có chất gắn.
- Cân bằng lại hệ thống máy,
dụng cụ nhuộm. Tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió.
|
|
- Tiêu bản bị mất mô
|
- Mẫu cắt mất mô do kỹ thuật
cắt hoặc do máy cắt, dao cắt.
- Rửa quá mạnh làm bong, trôi
bệnh phẩm
|
- Kiểm tra lại máy cắt, dao cắt
- Đảm bảo cắt hết mặt của bệnh
phẩm
- Cắt lại nếu bệnh phẩm bị
bong.
|
|
- Tiêu bản bị bóng nước
|
- Tiêu bản nhuộm chưa khô
|
Để khô trước khi gắn lamelle.
|
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Sai mã GPB trên tiêu bản
|
Lỗi sao chép thông tin mã (do
ghi tay)
|
Sửa lại cho đúng
|
|
Bàn giao tiêu bản thiếu/
không ghi vào sổ bàn giao
|
Nhân viên không tuân thủ đúng
quy trình
|
Yêu cầu nhân viên thực hiện đúng
quy trình bàn giao tiêu bản
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm tra chất
lượng:
+ Sử dụng mẫu chứng âm và mẫu
chứng dương đã được đánh giá chất lượng
+ Nhuộm trên mẫu chứng khi nhập
hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo khuyến
cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.
+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu
cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
+ Nếu không đạt yêu cầu, cần
tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
- Thực hiện ngoại kiểm: theo
chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng (nếu có).
- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh
trang thiết bị
- Kiểm soát điều kiện môi trường
- Đào tạo thường xuyên nhân viên
về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn.
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Quyết định 3376/QĐ-BYT ngày 30/098/2023 của Bộ y tế Ban
hành “Đề cương Quy trình kỹ thuật xét nghiệm.
2. Bancroff JD, Gamble M
(2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th
edition.
3. Suvarna SK, Layton C,
Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques.
Elsevier, 8th edition.
76. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP
PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này giúp phát hiện
kháng nguyên trên mẫu mô tươi dựa vào phản ứng kết hợp đặc hiệu giữa kháng
nguyên trong mô và kháng thể gắn chất phát quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kháng nguyên (KN) trong mô sẽ
phản ứng với kháng thể (KT) đặc hiệu đã gắn chất màu huỳnh quang (FITC
fluorescence isothiocynate) có thể phát sáng màu xanh táo khi quan sát bằng
kính hiển vi (KHV) huỳnh quang dưới ánh sáng của tia cực tím (ultraviolet
light).
1.3 Chữ viết tắt
- FITC: Fluorescence
isothiocynate
- HE: Hematoxylin Eosin.
- KN: Kháng nguyên
- KT: Kháng thể
- MDHQ: Miễn dịch huỳnh quang.
- TBS: Dung dịch đệm duy trì pH
(Tris-Buffered Saline)
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện: Nhân lực
trực tiếp
Bác sỹ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 01
Hộ lý: 01
2.2. Vật tư
2.2.1. Hóa chất
|
Tên hóa chất
|
Đơn vị
|
|
Dung dịch pha loãng kháng thể
ml
|
ml
|
|
Dung dịch đệm TBS (Wash
Buffer) pH 7,4
|
ml
|
|
Dung dịch kháng thể gắn huỳnh
quang (FITC)
|
Test
|
|
Nước cất 2 lần (hoặc nước RO)
|
Test
|
|
Dung dịch rửa (Reaction
Bufer)
|
ml
|
|
Dung dịch dầu khoáng nhẹ
(Lique coverslip LCS)
|
Test
|
|
Dung dịch rửa tối ưu
(Opptional)
|
Test
|
|
Dung dịch rửa thứ cấp (SSC)
|
Test
|
|
Gel phủ mẫu tươi (cryomatric
OCT)
|
Test
|
|
Xịt đông lạnh nhanh (ICE-IT)
|
ml
|
|
Nước muối sinh lý NaCl 0,9%
|
ml
|
|
Dung dịch gắn huỳnh quang
(Fluorescence mounting medium)
|
ml
|
|
Dung dịch rửa tay
|
ml
|
|
Dung dịch khử khuẩn bề mặt
|
ml
|
|
Khử khuẩn Presept 2,5
gram viên
|
viên
|
2.2.2. Dụng cụ
- Que tãi bệnh phẩm.
- Kẹp không mấu các kích cỡ
- Giá để tiêu bản nằm, đứng.
- Bể nhuộm
- Pipet điện tử các loại
- Đầu col các loại
- Hộp nhựa đựng bệnh phẩm không
gamma
- Ống bảo quản mẫu nắp vặn vô
trùng 2ml
- Hộp nhựa đựng ống Cryo
1,5-2ml, 100 vị trí
- Chai code máy nhuộm đặc biệt
(User fillabel reagent)
- Thùng đựng rác thải y tế (màu
vàng)
- Thùng đựng rác thông thường
(màu xanh).
2.2.3. Vật tư tiêu hao
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần.
- Lam kính tích điện dương
super frost.
- Lá kính (lamelle)
- Pipet nhựa
- Giấy nhôm (Aluminium)
- Bút mỡ (dako pen)
- Hộp đựng rác thải sắc nhọn
- Găng tay không bột tan
- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.
- Bút chì, bút dạ dầu.
- Giấy A4
- Giấy in tem chống thấm nước,
hóa chất
- Cuộn mực in tem
- Giấy thấm tiêu bản
- Giấy lau tay
- Túi đựng rác thải các loại.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh
- Máy nhuộm đặc biệt
- Máy gắn lamelle tự động
- Kính hiển vi quang học
- Kính hiển vi soi nổi
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Tủ hút mùi hóa chất
- Tủ đựng hóa chất chống cháy
lan
- Tủ đựng hóa chất có hệ thống
lọc khí, hóa chất
- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt
độ 2-8°C
- Tủ đông -20°C lưu mẫu đông lạnh
- Máy in tem/nhãn
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm) và lưu trữ bệnh phẩm.
- Hệ thống máy tính có phần mềm
chuyên dụng kết nối kính huỳnh quang
- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ
phòng 21-26°C, đảm bảo an toàn sinh học
- Phòng tối đọc tiêu bản huỳnh
quang
- Hệ thống lavabo cấp thoát nước
(có đường thải hóa chất độc hại)
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Các dụng cụ làm sạch trang
thiết bị, vật tư
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là mẫu mô tươi (ví
dụ: thận, da) sau khi sinh thiết và gửi ngay đến khoa GPB.
- Tùy vào loại mô, bác sĩ GPB
kiểm tra chất lượng mẫu tươi dưới kính hiển vi soi nổi (đúng loại mô, đủ độ lớn)
và phân chia mẫu cho nhuộm MDHQ. Mẫu được cố định trong dung dịch Cryomatrix ở
nhiệt độ -23°C.
- Cắt 01 tiêu bản dán trên lam
thường theo quy trình cắt lạnh. Nhuộm HE cho mẫu sinh thiết lạnh để xác định hướng
và thành phần của bệnh phẩm, đảm bảo mẫu đủ tiêu chuẩn nhuộm MDHQ.
- Cắt mẫu bệnh và mẫu chứng âm,
chứng dương thành các lát cắt mỏng, có độ dầy 5µm dán trên lam kính super frost
plus đã ghi nhãn. Số lượng và thứ tự các lát cắt theo quy định, tùy thuộc vào
loại dấu ấn miễn dịch huỳnh quang.
- Dùng bút dạ dầu khoanh quanh
vị trí lát cắt ở mặt dưới lam kính. Để khô 30 phút ở nhiệt độ phòng.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
loại xét nghiệm yêu cầu.
- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, thời
gian chỉ định, họ tên, chữ ký bác sĩ yêu cầu.
- Có ghi loại mẫu cần làm xét
nghiệm (mẫu tươi), thời gian lấy mẫu và họ tên người lấy mẫu.
- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu,
người bàn giao và người nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
Tổng thời gian ước tính: 120 giờ,
trong đó:
- Thời gian chuẩn bị mẫu: 24 giờ
- Thời gian nhuộm: 24 giờ
- Thời gian phân tích kết quả,
trả kết quả: 72 giờ.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu
bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.
3. AN TOÀN:
- Thực hiện các biện pháp an
toàn theo Sổ tay an toàn của từng phòng xét nghiệm: an toàn sinh học, an toàn
điện, an toàn cháy nổ, an toàn hoá chất.
- Thực hiện an toàn sinh học
phù hợp tác nhân gây bệnh theo thông tư 41/2016/TT-BYT
- Sử dụng hoá chất sinh phẩm an
toàn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
- Hiệu chuẩn vật tư, thiết bị định
kỳ.
- Kiểm soát môi trường: Ánh
sáng, tiếng ồn, nhiệt độ, độ ẩm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
|
Bước
|
Nội dung
|
Thời gian
|
|
1
|
Rửa các tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4.
|
5 phút
|
|
2
|
Làm ráo tiêu bản, lau viền
quanh bệnh phẩm, khoanh bút mỡ quanh bệnh phẩm và chứng.
|
|
|
3
|
Phủ kháng thể 1 trong phòng tối
(máy nhuộm đặc biệt hoặc hộp giữ ẩm)
|
40 phút
|
|
4
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 1 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
5
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 2 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
6
|
Phủ tiêu bản với kháng thể 2 gắn
FITC trong phòng tối (máy nhuộm đặc biệt hoặc hộp giữ ẩm)
|
30 phút
|
|
7
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 1 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
8
|
Rửa tiêu bản trong dung dịch
đệm TBS pH 7,4 lần 2 (phòng tối).
|
5 phút
|
|
9
|
Để tiêu bản khô tự nhiên
(phòng tối).
|
60 phút
|
|
10
|
Gắn lamelle bằng dung dịch gắn
huỳnh quang
|
|
|
11
|
Đánh giá chất lượng tiêu bản
nhuộm
|
|
|
12
|
Đặt tiêu bản trên khay bọc giấy
nhôm Aluminium.
|
|
|
13
|
Hoàn thiện và bàn giao tiêu bản
|
|
4.2. Nhận định kết quả
4.2.1. Phân tích kết quả
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện
đánh giá và phân tích, chụp ảnh nhuộm MDHQ trên tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh
quang và hệ thống phần mềm chuyên dụng.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE
trên kính hiển vi quang học.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm chứng
âm và chứng dương:
+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản
nhuộm mẫu bệnh.
+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại
toàn bộ quy trình kỹ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.
+ Tiêu chí đánh giá: Lắng đọng
miễn dịch hiển thị bằng màu xanh táo sáng tại các vị trí trên mô. Mô nền không
lắng đọng miễn dịch hiển thị bằng màu xanh nhạt đồng đều.
- Đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh
theo các tiêu chí:
+ Loại dấu ấn miễn dịch
+ Vị trí lắng đọng miễn dịch
+ Kiểu hình: hạt (granular), đường
(linear)
+ Cường độ: Không (0), vết (0,5+),
nhẹ (1+), vừa (2+), mạnh (3+), rất mạnh (4+).
4.2.2 Báo cáo kết quả xét nghiệm
và lưu trữ
- Trả kết quả theo các quy
trình liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và
người thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.
- Lưu mẫu tươi, tiêu bản và ảnh
chụp MDHQ theo quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian
quy định.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước khi thực hiện kỹ
thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Nhầm mẫu của BN này với BN
khác
|
- Không đối chiếu thông tin mẫu
đang làm và dụng cụ đặt mẫu khi phẫu tích bệnh phẩm.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng (nếu có thể)
|
|
|
- Đặt lát cắt của BN không
đúng mã GPB.
|
- Thực hiện lần lượt đối với từng
ca bệnh, đảm bảo kiểm tra, đối chiếu thông tin BN ở mỗi bước.
|
|
Sai mã GPB trên hệ thống phần
mềm
|
Đánh nhầm mã GPB khi nhập chỉ
định XN
|
- Sửa lại đúng mã GPB
- Cẩn thận khi nhập mã.
|
|
Mẫu chứng âm bị nền
|
Mẫu bị khô trong quá trình ủ
hoặc bị nhiễm chéo.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Không để mẫu bị khô trong
suốt quá trình thao tác. Thay đầu côn trước khi hút, pha chế hóa chất.
|
|
Mẫu chứng dương bị âm
|
- Hóa chất hỏng
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
|
|
|
- Mẫu chứng không đạt tiêu
chuẩn
- Thực hiện không đúng các bước
trong quy trình.
|
- Tuân thủ điều kiện bảo quản
hóa chất, tránh rã đông nhiều lần. Pha lại hóa chất mới
|
|
|
- Tiêu bản nhuộm mất màu theo
thời gian.
|
- Kiểm tra lại mẫu chứng
|
|
|
|
- Tuân thủ đúng theo quy
trình kỹ thuật.
|
|
|
|
- Đọc kết quả càng sớm càng tốt
do phức hợp MDHQ sẽ bị mất màu theo thời gian.
|
5.2. Trong quá trình thực hiện
kỹ thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Nhầm loại dấu ấn (kháng thể)
|
Không phủ đúng loại kháng thể
trên tiêu bản tương ứng với tên dấu ấn.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Đối chiếu loại kháng thể và
tên dấu ấn trên tiêu bản ở mỗi bước thực hiện
|
|
Tiêu bản chỉ được nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm
|
- Còn bọt khí trên tiêu bản
khi phủ hóa chất.
- Chỉ dùng lam kính thường
- Tiêu bản bị nghiêng hoặc để
hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc
nhuộm.
|
- Kiểm tra và thực hiện lại
đúng.
- Loại bỏ bọt khí
- Cắt mẫu trên lam tích điện
dương có chất gắn.
- Cân bằng lại hệ thống máy,
dụng cụ nhuộm. Tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió.
|
|
- Tiêu bản bị mất mô
|
- Mẫu cắt mất mô do kỹ thuật
cắt hoặc do máy cắt, dao cắt.
- Rửa quá mạnh làm bong, trôi
bệnh phẩm
|
- Kiểm tra lại máy cắt, dao cắt
- Đảm bảo cắt hết mặt của bệnh
phẩm
- Cắt lại nếu bệnh phẩm bị
bong.
|
|
- Tiêu bản bị bóng nước
|
- Tiêu bản nhuộm chưa khô
|
Để khô trước khi gắn lamelle.
|
5.3. Sau khi thực hiện kỹ
thuật
|
Tên lỗi
|
Nguyên nhân
|
Khắc phục- Phòng ngừa
|
|
Sai mã GPB trên tiêu bản
|
Lỗi sao chép thông tin mã (do
ghi tay)
|
Sửa lại cho đúng
|
|
Bàn giao tiêu bản thiếu/
không ghi vào sổ bàn giao
|
Nhân viên không tuân thủ đúng
quy trình
|
Yêu cầu nhân viên thực hiện
đúng quy trình bàn giao tiêu bản
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
−Thực hiện nội kiểm tra chất lượng:
+ Sử dụng mẫu chứng âm và mẫu
chứng dương đã được đánh giá chất lượng
+ Nhuộm trên mẫu chứng khi nhập
hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo khuyến
cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.
+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu
cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
+ Nếu không đạt yêu cầu, cần
tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.
- Thực hiện ngoại kiểm (nếu
có): theo chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng.
- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh
trang thiết bị
- Kiểm soát điều kiện môi trường
- Đào tạo thường xuyên nhân
viên về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo
tiêu chuẩn.
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế Hướng
dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào học
2. Quyết định 3376/QĐ-BYT ngày 30/098/2023 của Bộ y tế Ban
hành “Đề cương Quy trình kỹ thuật xét nghiệm.
3. Bancroff JD, Gamble M
(2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th
edition.
4. Suvarna SK, Layton C,
Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques.
Elsevier, 8th edition.
77. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Là kỹ thuật phát hiện kháng thể
trong máu bệnh nhân bệnh da bọng nước tự miễn bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang gián tiếp.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học
và kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang,
chất đánh dấu là các kháng nguyên được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang
(fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực
tím. Trong phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, trên các mảnh cắt
là các kháng nguyên đã biết. Nhỏ lên các mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh
(đã pha loãng theo yêu cầu của từng trường hợp chẩn đoán). Nếu trong huyết
thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở các mảnh cắt thì phức
hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành. Phức hợp này có thể phát hiện được
nếu nhỏ lên trên đó một giọt globulin kháng globulin huỳnh quang (kháng người).
Vì vậy, khi kháng nguyên bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người
bệnh có kháng thể.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật y: 01
2.2. Vật tư:
- Dung dịch đệm photphat PH
7,2.
- Huyết thanh người bệnh.
- Da bìu người bệnh không bị bệnh
miễn dịch.
- Kháng kháng thể huỳnh quang
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh đang ở trạng
thái hoạt động.
- Dao sắc, thớt nhựa sạch,
phẳng.
- Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh
phẩm.
- Phiến kính, lá kính sạch.
- Bút chì mềm (để ghi tên
tuổi người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
- Giấy thấm, gạc sạch.
- Găng tay, khẩu trang,
mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
- Chổi lông mềm.
- Gel cắt lạnh.
- Cồn tuyệt đối.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm
ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen
- Kính hiển vi 2 mắt để
kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng
tay các loại.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Lấy bệnh phẩm:
Việc lấy mẫu được thực hiện bởi
khoa HS-HH-MD và gửi mẫu máu về khoa Giải phẫu bệnh.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 2 giờ 30 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Labo giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện:
Mảnh da thân dương vật, của bệnh
nhân không bị bệnh miễn dịch (chưa cố định) được tiến hành cắt lạnh theo qui
trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy
4-5µm dàn ra lam.
- Ngâm lam bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần
- Ly tâm máu Người bệnh lấy huyết
thanh
- Kháng huyết thanh pha tỷ lệ 1/10
với PBS PH 7,2.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được
cố định trên phiến kính 1-3 giọt kháng huyết thanh đã pha loãng, để 45 phút
trong một hộp ẩm, kín, ở nhiệt độ 37°C.
- Đổ huyết thanh thừa đi rồi
tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm PBS PH 7,2.
- Ngâm bằng dung dịch đệm photphat
PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm,
nhỏ lên một giọt kháng kháng thể huỳnh quang IgG pha theo tỉ lệ của hãng để 45
phút trong hộp ẩm, tối màu ở 37° C.
- Đổ kháng kháng thể huỳnh quang
thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường,
khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt Mouting gắn lamen.
- Kết quả
Kháng thể cần phát hiện có màu
xanh lá cây xem có lắng đọng khoảng gian bào, màng đáy lớp thượng bì hay trung
bì.
4.2. Nhận định kết quả
- Tiêu bản sau khi nhuộm màu
xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang bởi Bác sĩ Giải phẫu bệnh, từ đó
đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả và các thông tin
về bệnh nhân, kết quả xét nghiệm được lưu giữ trong hệ thống phần mềm His bệnh
viện.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tiêu bản cắt ở độ dày 4-5µm
- Tiêu bản bị nhuộm nền: thời
gian ủ với kháng thể quá lâu hoặc pha không đúng tỉ lệ...
- Tiêu bản bị âm tính giả: hạn
sử dụng hóa chất, thời gian ủ với kháng thể không đủ... màu.
- Khi phủ kháng thể lên
bệnh phẩm phải đậy tiêu bản trong buồng kín và tối
- Để hộp kín trong ngăn mát tủ
lạnh bảo quản được 1 tuần.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng xét nghiệm,
đánh giá của Bác sĩ Giải phẫu bệnh.
- Thực hiện nội kiểm nhuộm
MDHQGT: phải có chứng (+) và chứng (-).
- Nếu khi đọc tiêu bản nhuộm
MDHQGT chứng (+) và chứng (-) không đạt thì phải nhuộm lại tiêu bản.
- Kích thước bệnh phẩm trên
tiêu bản tương đương bệnh phẩm lúc tươi.
- Cấu trúc mô và tế bào được giữ
nguyên giống bệnh phẩm lúc tươi.
- Tiêu bản không gấp, không xước
rách, không mất mô.
-Tiêu bản trong, sạch, không thừa
thiếu Bôm gắn lamen
- Không có bọt khí, bọt nước
trên tiêu bản.
- Mã tiêu bản đẹp, bệnh phẩm đặt
đúng vị trí tiêu bản
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Kỹ thuật xét nghiệm Y học xuất
bản năm 1999.
2. Bài giảng Y khoa xuất bản
năm 2001.
3 Hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám
bệnh, chữa bệnh chuyên ngành giải phẫu bệnh – Tế bào bệnh học – Bộ Y tế năm
2013.
78. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP
CHO BỘ 6 KHÁNG THỂ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện
và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
phát hiện kháng nguyên, bộ 6 kháng thể IgA, IgG, IgM, C3c, C4c, C1q.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh
quang bộ 6 kháng thể bản chất là kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
phát hiện kháng nguyên, cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp
giữa kỹ thuật mô bệnh học với kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là:
trong miễn dịch huỳnh quang, chất đánh dấu là các kháng thể được gắn với một chất
nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn
sáng là tia cực tím. Trong phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, muốn
phát hiện mỗi kháng nguyên lại cần có một kháng thể huỳnh quang tương ứng.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật y: 01
- Hộ lý: 01
2.2. Hóa chất, Vật tư:
Các hóa chất để thực hiện nhuộm
miễn dịch huỳnh quang: Kháng thể huỳnh quang bộ 6 marker IgA, IgG, IgM, C3c,
C4c, C1q; keo gắn lamen; dung dịch rửa, bể nhuộm, khuôn nhựa, giá đựng tiêu bản,
lam kính, lamen...
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Tủ ấm 37° và 56°.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Kính hiển vi quang học kiểm
tra mô.
- Kính hiển vi huỳnh quang kết
hợp hệ thống máy tính và phần mềm chụp ảnh.
- Kính phòng hộ, găng tay các
loại.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm tươi (chưa cố định bởi
dung dịch cố đinh) được tiến hành cắt lạnh theo quy trình cắt lạnh bệnh phẩm.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 120 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện đúng tiêu chuẩn an
toàn phòng xét nghiệm.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
- Điều kiện thực hiện kỹ thuật:
Trong môi trường ánh sáng yếu.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy 5
-6 µm.
- Kháng thể huỳnh quang đã pha
theo khuyến cáo của hãng sản xuất.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được
cố định trên phiến kính từ 1-3 giọt kháng thể huỳnh quang đã pha loãng, để 30
phút trong một bể ủ ẩm, kín, ở nhiệt độ phòng 25 - 27 °C.
- Đổ kháng thể huỳnh quang thừa
đi rồi tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm pH 7,2 – 7,6.
- Ngâm bằng dung dịch đệm pH
7,2 – 7,6 trong 30 phút x 2 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm,
nhỏ lên một giọt glycerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá
kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.
Ví dụ: muốn phát hiện virus dại
trong bệnh phẩm mô não người hoặc não súc vật, lấy bệnh phẩm làm phiến đồ hoặc
làm các mảnh cắt lạnh và cố định cồn + ete hoặc bằng aceton. Nhỏ lên phiến kính
một giọt globulin của kháng huyết thanh kháng virus dại đã đánh dấu bằng thuốc
nhuộm huỳnh quang. Trường hợp dương tính, sẽ thấy rõ các tiểu thể Negri trong tế
bào thần kinh bắt huỳnh quang màu xanh lục.
- Kết quả: Kháng nguyên cần
phát hiện có màu xanh lục.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng
và chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mảnh cắt nên được cắt ở độ
dày 5-6µm
- Tiêu bản bị nhuộm nền: thời
gian ủ với kháng thể quá lâu hoặc pha không đúng tỉ lệ...
- Tiêu bản bị âm tính giả: hạn
sử dụng hóa chất, thời gian ủ với kháng thể không đủ...
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng xét nghiệm
theo quy định Bộ Y Tế
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dey P. Basic and Advanced
Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.
2. Robert Lott, Janet
Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in
Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.
3. Specimen Collection &
Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.
79. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP ĐỊNH
LƯỢNG HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Là kỹ thuật phát hiện bán định
lượng nồng độ kháng thể, giúp chẩn đoán theo dõi và tiên lượng bệnh trong máu bệnh
nhân bệnh da bọng nước tự miễn
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
cũng tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học
và kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang,
chất đánh dấu là các kháng nguyên được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang
(fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực
tím. Trong phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, trên các mảnh cắt
là các kháng nguyên đã biết. Nhỏ lên các mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh
(đã pha loãng theo yêu cầu của từng trường hợp chẩn đoán). Nếu trong huyết
thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở các mảnh cắt thì phức
hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành. Phức hợp này có thể phát hiện được
nếu nhỏ lên trên đó một giọt globulin kháng globulin huỳnh quang (kháng người).
Vì vậy, khi kháng nguyên bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người
bệnh có kháng thể.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật y: 01
2.2. Vật tư:
- Dung dịch đệm photphat PH
7,2.
- Kháng kháng thể huỳnh quang
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh đang ở trạng
thái hoạt động.
- Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng.
- Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm.
- Phiến kính, lá kính sạch.
- Bút chì mềm (để ghi tên tuổi
người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
- Giấy thấm, gạc sạch.
- Găng tay, khẩu trang, mũ, kính
bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
- Chổi lông mềm.
- Gel cắt lạnh.
- Cồn tuyệt đối.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm
ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm
tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Huyết thanh người bệnh.
- Da bìu người bệnh không bị bệnh
miễn dịch.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét
nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh,
tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 2 giờ 30 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Labo giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện các quy định của Bộ Y
tế, bệnh viện và khoa phòng về các vấn đề:
- Quy định về an toàn cho người
thực hiện và dự phòng nguy cơ trước, trong và sau phơi nhiễm.
- Quy định hiệu chuẩn vật tư,
thiết bị
- Quy định về an toàn điện và
phòng tránh cháy nổ
- Quy định về an toàn hóa chất:
có bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất
- Quy định kiểm soát môi trường:
đánh giá các yếu tố vi khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, tiếng ồn… theo
quy trình GPB-QTQL-12.1;
- Quy định về an toàn sinh học,
theo quy trình GPB-QTQL-12.2;
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện:
Bệnh phẩm da thân dương vật, của
bệnh nhân không bị bệnh miễn dịch (chưa cố định) được tiến hành cắt lạnh theo
qui trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy
4-5µm dàn ra lam.
- Ngâm lam bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần
- Kháng huyết thanh pha loãng
theo tỷ lệ là 1/10, 1/20, 1/40, 1/80… với PBS PH 7,2.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được
cố định trên phiến kính 1-3 giọt kháng huyết thanh đã pha loãng để 45 phút
trong một hộp ẩm, kín,ở nhiệt độ 37°C.
- Đổ huyết thanh thừa đi rồi
tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm PBS PH 7,2.
- Ngâm bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm,
nhỏ lên một giọt kháng kháng thể huỳnh quang IgG pha theo tỉ lệ của hãng để 45
phút trong hộp ẩm, tối màu ở 37° C .
- Đổ kháng kháng thể huỳnh
quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường,
khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt Mouting gắn lamen.
- Kết quả
Kháng thể cần phát hiện có màu
xanh lá cây xem có lắng đọng khoảng gian bào, màng đáy lớp thượng bì hay trung
bì.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang bởi
Bác sĩ Giải phẫu bệnh, từ đó đưa
ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả và các thông tin
về bệnh nhân, kết quả xét nghiệm được lưu giữ trong hệ thống phần mềm His bệnh
viện.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tiêu bản cắt ở độ dày 4-5µm
- Tiêu bản bị nhuộm nền: thời
gian ủ với kháng thể quá lâu hoặc pha không đúng tỉ lệ...
- Tiêu bản bị âm tính giả: hạn
sử dụng hóa chất, thời gian ủ với kháng thể không đủ...
- Khi phủ kháng thể lên
bệnh phẩm phải đậy tiêu bản trong buồng kín và tối màu.
- Để hộp kín trong ngăn mát tủ
lạnh bảo quản được 1 tuần.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng xét nghiệm,
đánh giá của Bác sĩ Giải phẫu bệnh.
- Thực hiện nội kiểm nhuộm
MDHQGT: phải có chứng (+) và chứng (-).
- Nếu khi đọc tiêu bản nhuộm
MDHQGT chứng (+) và chứng (-) không đạt thì phải nhuộm lại tiêu bản.
- Kích thước bệnh phẩm trên
tiêu bản tương đương bệnh phẩm lúc tươi.
- Cấu trúc mô và tế bào được giữ
nguyên giống bệnh phẩm lúc tươi.
- Tiêu bản không gấp, không xước
rách, không mất mô.
- Tiêu bản trong, sạch, không
thừa thiếu Bôm gắn lamen
- Không có bọt khí, bọt nước
trên tiêu bản.
- Mã tiêu bản đẹp, bệnh phẩm đặt
đúng vị trí tiêu bản
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Kỹ thuật xét nghiệm Y học xuất
bản năm 1999.
- Bài giảng Y khoa xuất bản năm
2001.
- Hướng dẫn quy trình kỹ thuật
khám bệnh, chữa bệnh chuyên ngành giải phẫu bệnh – Tế bào bệnh học – Bộ Y tế
năm 2013.
80. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
TÁCH MUỐI PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Là kỹ thuật phát hiện kháng thể
trong máu để chẩn đoán phân biệt bệnh Pemphigoid và ly thượng bì mắc phải bằng
kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp tách muối (Salt split skin).
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cũng
tương tự kỹ thuật hoá mô miễn dịch: có sự kết hợp giữa kỹ thuật mô bệnh học và
kỹ thuật miễn dịch học, nhưng sự khác biệt là: trong miễn dịch huỳnh quang, chất
đánh dấu là các kháng nguyên được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang
(fluorochrome) có đặc tính phát quang dưới kích thích của nguồn sáng là tia cực
tím. Trong phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, trên các mảnh cắt
là các kháng nguyên đã biết. Nhỏ lên các mảnh cắt một giọt huyết thanh Người bệnh
(đã pha loãng theo yêu cầu của từng trường hợp chẩn đoán). Nếu trong huyết
thanh Người bệnh có kháng thể tương ứng với kháng nguyên ở các mảnh cắt thì phức
hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành. Phức hợp này có thể phát hiện được
nếu nhỏ lên trên đó một giọt globulin kháng globulin huỳnh quang (kháng người).
Vì vậy, khi kháng nguyên bắt màu huỳnh quang có nghĩa là trong huyết thanh Người
bệnh có kháng thể.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật viên Giải phẫu bệnh:
01
2.2. Vật tư:
- Nước muối bão hòa
- Dung dịch đệm photphat PH
7,2.
- Kháng kháng thể huỳnh quang.
2.3. Trang thiết bị:
- Máy cắt lạnh đang ở trạng
thái hoạt động.
- Dao sắc, thớt nhựa sạch,
phẳng.
- Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh
phẩm.
- Phiến kính, lá kính sạch.
- Bút chì mềm (để ghi
tên tuổi người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
- Giấy thấm, gạc sạch.
- Găng tay, khẩu trang,
mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
- Chổi lông mềm.
- Gel cắt lạnh.
- Cồn tuyệt đối.
- Giá đựng tiêu bản (đứng
và nằm ngang).
- Kẹp không mấu, kéo.
- Giấy lọc.
- Lam kính, lamen
- Kính hiển vi 2 mắt để
kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng
tay các loại.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Huyết thanh người bệnh.
- Da bệnh nhân không bị bệnh miễn
dịch
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:
ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên
khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 2 giờ 30 phút
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật : Labo giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN
Thực hiện các quy định của Bộ Y
tế.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện:
Bệnh phẩm tươi (chưa cố định)
được ngâm vào nước muối bão hòa 24 - 72giờ sau đó tiến hành cắt lạnh theo qui
trình cắt lạnh bệnh phẩm.
- Cắt các lát mỏng, có độ dầy
4-5µm dàn ra lam.
- Ngâm lam bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần
- Ly tâm máu Người bệnh lấy huyết
thanh
- Kháng huyết thanh pha tỷ lệ 1/10
với PBS PH 7,2.
- Nhỏ lên các mảnh cắt đã được
cố định trên phiến kính 1-3 giọt kháng huyết thanh đã pha loãng, để 45 phút
trong một hộp ẩm, kín, ở nhiệt độ 37°C.
- Đổ huyết thanh thừa đi rồi
tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm PBS PH 7,2.
- Ngâm bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
- Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm,
nhỏ lên một giọt kháng kháng thể huỳnh quang IgG pha theo tỉ lệ của hãng để 45
phút trong hộp ẩm, tối màu ở 37° C.
- Đổ kháng kháng thể huỳnh
quang thừa đi, tráng kỹ.
- Ngâm bằng dung dịch đệm
photphat PH 7,2 trong 5 phút x 3 lần.
- Để ráo nước ở nhiệt độ thường,
khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt Mouting gắn lamen.
- Kết quả: Kháng thể cần phát
hiện có màu xanh lá cây xem có lắng đọng màng đáy lớp thượng bì hay trung bì.
4.2. Nhận định kết quả
Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong
sẽ được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang bởi Bác sĩ Giải phẫu bệnh, từ đó đưa
ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
- Trả kết quả và các thông tin
về bệnh nhân, kết quả xét nghiệm được lưu giữ trong hệ thống phần mềm His bệnh
viện.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tiêu bản cắt ở độ dày 4-5µm
- Tiêu bản nhuộm nền: thời gian
ủ với kháng thể quá lâu hoặc pha không đúng tỉ lệ...
- Tiêu bản âm tính giả: hạn sử
dụng hóa chất, thời gian ủ với kháng thể không đủ...
- Khi phủ kháng thể lên
bệnh phẩm phải đậy tiêu bản trong buồng kín và tối màu.
- Để hộp kín trong ngăn mát tủ
lạnh bảo quản được 1 tuần.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng xét nghiệm, đánh
giá của Bác sĩ Giải phẫu bệnh.
- Thực hiện nội kiểm nhuộm
MDHQGT: phải có chứng (+) và chứng (-).
- Nếu khi đọc tiêu bản nhuộm
MDHQGT chứng (+) và chứng (-) không đạt thì phải nhuộm lại tiêu bản.
- Kích thước bệnh phẩm trên
tiêu bản tương đương bệnh phẩm lúc tươi.
- Cấu trúc mô và tế bào được giữ
nguyên giống bệnh phẩm lúc tươi.
- Tiêu bản không gấp, không xước
rách, không mất mô.
- Tiêu bản trong, sạch, không
thừa thiếu Bôm gắn lamen
- Không có bọt khí, bọt nước
trên tiêu bản.
- Mã tiêu bản đẹp, bệnh phẩm đặt
đúng vị trí tiêu bản
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Kỹ thuật xét nghiệm Y học xuất
bản năm 1999.
- Bài giảng Y khoa xuất bản năm
2001.
81. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC HAI MÀU
(DUAL-ISH)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Phát hiện trình tự axit nucleic
đặc hiệu (DNA/RNA) bằng sử dụng đầu dò axit nucleic bổ sung (probe) được đánh dấu.
Quan sát tế bào hoặc mô (tại chỗ) trên lam kính bằng kính hiển vi quang.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
- Phát hiện trình tự axit
nucleic cụ thể (DNA/RNA), Phát hiện các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể
(các dị tật bẩm sinh hoặc mắc phải)
- Phương pháp nhuộm lai tại chỗ
(ISH) nhìn chung cho phép nhận diện được các trình tự DNA hoặc RNA đích nhờ
phương pháp lai lần lượt: mẫu dò của DNA hoặc RNA được đánh dấu với trình tự
đích, một kháng thể sơ cấp gắn được với mẫu dò được đánh dấu, một kháng thể thứ
cấp gắn với kháng thể sơ cấp, một phức hợp enzyme và một cơ chất tạo màu và các
bước rửa xen kẽ trong quá trình nhuộm. Sự hoạt hóa enzyme bởi chất tạo màu tạo
thành sản phẩm phản ứng có màu tại vị trí đích. Mẫu thử sau đó có thể được nhuộm
tương phản và dùng lam kính phủ lên.
- Kết quả được biện luận sử dụng
kính hiển vi quang học
2. CHUẨN BỊ
2.1. Người thực hiện:
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật viên xét nghiệm: 01
Cử nhân sinh học: 01
Nhân lực hỗ trợ: Hộ lý, nhân
viên văn phòng, nhân viên vệ sinh
2.2. Vật tư, hóa chất:
- Dung dịch khử Paraffin
- Dung dịch dầu khoáng phủ tiêu
bản
- Dung dịch tiền xử lý mẫu màng
tế bào
- ISH protease: enzyme tiền xử lý
mẫu ở nhân, ly giải màng nhân, bộc lộ acid nucleic
- Dung dịch đệm tạo môi trường
tối ưu cho phản ứng lai của đoạn dò (ví dụ với gen HER2 và CEP17).
- Hỗn hợp chứa đoạn dò (gen
HER2 và CEP17, bắt cặp đặc hiệu với trình tự đặc trưng cho gen HER2 và CEP17
tương ứng).
- Silver ISH DNP Detection Kit:
bộ kit tạo màu bạc, gắn đặc hiệu với đoạn dò HER2 và cho phản ứng tạo tín hiệu
màu bạc khi quan sát dưới KHV
- RED ISH DIG Detection Kit: bộ
kit tạo màu đỏ, gắn đặc hiệu với đoạn dò CEP17 và cho phản ứng tạo tín hiệu màu
đỏ
- Dung dịch rửa sau phản ứng
lai
- SSC (sodium saline citrate):
dung dịch rửa sau mỗi bước phản ứng
- Hematoxylin: dung dịch nhuộm
nhân
- Dung dịch làm xanh nhân
- Mẫu mô chứng
- Keo gắn phiến kính
- Lam kính thường, lam kính có
gắn chất chống bong, phiến kính
2.3. Trang thiết bị:
- Máy nhuộm lai tự động
- Máy cắt lát mỏng
- Lưỡi dao cắt lát mỏng
- Tủ ấm
- Tủ hút
- KHV quang học
- Tủ lạnh
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
- Khối khối nến chứa u bệnh phẩm
được cắt lát mỏng 3-5 µm và dán lên lam kính chống bong, lam kính tích điện (hoặc
lam tráng silan), và một lam kính sạch nhuộm HE
- Để lam kính trong tủ ấm
60-65°C trong 40-45 phút
- Cài đặt chương trình chạy máy
nhuộm lai tự động.
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm
Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:
ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên
khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật : 720 phút.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật:
- Thực hiện chung với phòng thực
hiện kỹ thuật HMMD, phòng phải có hệ thống thông khí tốt, hệ thống lạnh ổn định
từ 23-26°C.
3. AN TOÀN
3.1. An toàn cho người lao động:
- Sử dụng trang bị bảo hộ cá
nhân như găng tay, kính bảo hộ, khẩu trang và áo blouse;
- Tuân thủ quy trình vận hành
an toàn với hóa chất và thiết bị;
- Quản lý chất thải hóa học một
cách an toàn;
- Thực hiện các biện pháp phòng
ngừa lây nhiễm.
- Được đào tạo về an toàn và sức
khỏe nghề nghiệp để đảm bảo môi trường làm việc an toàn.
3.2. Hiệu chỉnh vật tư thiết
bị:
- Phải có kiểm tra và điều chỉnh
thiết bị để đảm bảo chúng hoạt động chính xác,
- Lịch bảo dưỡng định kỳ
3.3. Phòng, tránh cháy, nổ:
- Sử dụng đúng cách hóa chất và
dung môi dễ cháy,
- Đảm bảo thông gió tốt, bảo quản
hóa chất theo yêu cầu an toàn, sử dụng tủ lạnh chống cháy cho các chất dễ bay
hơi,
- Kiểm tra thiết bị điện định kỳ
để phát hiện hỏng hóc,
- Trang bị bình chữa cháy cùng
các quy trình an toàn sẵn sàng áp dụng.
3.4. Điều kiện lưu trữ hóa
chất, đặc biệt là kháng thể:
- Đảm bảo nhiệt độ, độ ẩm và
ánh sáng phù hợp trong bảo quản.
- Đối với kháng thể, thường được
lưu trữ trong tủ lạnh ở 2-8°C cho sử dụng ngắn hạn hoặc đông lạnh -20°C-80°C
cho sử dụng dài hạn,
- Tránh đông lạnh và rã đông
nhiều lần sẽ làm giảm chất lượng kháng thể.
- Hóa chất dễ cháy cần được bảo
quản trong tủ chống cháy và tách biệt khỏi các chất oxy hóa.
3.5. Quy định về an toàn
sinh học:
- Sử dụng các biện pháp bảo hộ
cá nhân như găng tay, kính bảo hộ, và khẩu trang; thực hành kỹ thuật sinh học
an toàn để tránh nhiễm khuẩn;
- Xử lý và tiêu hủy mẫu bệnh phẩm
theo quy định;
- Bảo dưỡng thiết bị sạch sẽ.
- Đảm bảo không gian làm việc
được giữ sạch sẽ và an toàn, tránh ô nhiễm chéo giữa các mẫu và giữa người với
người.
3.6. Quy định về môi trường:
- Duy trì một không gian làm việc
sạch sẽ, an toàn và có kiểm soát.
- Kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm,
ánh sáng, và thông gió để đảm bảo điều kiện lý tưởng cho cả nhân viên và mẫu
nghiên cứu.
- Tuân thủ các biện pháp xử lý
chất thải hóa học và sinh học một cách an toàn và thân thiện với môi trường.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Các bước thực hiện
B1: Tiền xử lý mẫu mô: 28 phút
B2: Ly giải màng nhân ISH
Protease : 4 phút
B4: Biến tính DNA: 4 phút
B5: Phản ứng lai
(Hybridization): 6 giờ, nhiệt độ ủ 72°C
B6: Thực hiện phản ứng khuếch đại
bạc: 16 phút
B7: Hiển thị màu (Silver
Chromogen): 4 phút
B8: Thực hiện phản ứng khuếch đại
tín hiệu đỏ: 24 phút
B9: Hiển thị màu (Red
Chromogen): 8 phút
B10: Nhuộm tương phản bằng
hematoxylin: 8 phút
B11: Làm xanh nhân: 4 phút
B12: Làm trong, gắn phiến kính
4.2. Nhận định kết quả
- Tiêu bản sau khi nhuộm màu
xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng
và chẩn đoán cho người bệnh
- Quy trình lai tại chỗ tự động
của Ventana tạo ra sản phẩm phản ứng màu bạc và đỏ riêng biệt kết tủa ở vùng
đích được định vị bởi các mẫu dò. Một người đọc đủ tiêu chuẩn có kinh nghiệm về
quy trình lai tại chỗ phải đánh giá các mẫu chứng và đánh giá sản phẩm nhuộm
trước khi biện luận kết quả....
4.3. Trả kết quả và lưu trữ
hồ sơ
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
KHÔNG
CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Khử paraffin không hết
|
Tăng thời gian khử paraffin
hoặc thay thế EZ prep mới
|
|
Điều kiện lai không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai
hoặc buồng lai
|
|
Nhiệt độ rửa sau khi lai
không chính xác
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
hoặc tăng thời gian lai
|
|
Lượng probe không đủ
|
Tăng thêm lượng probe bơm vào
lam
|
|
Digest không đủ
|
Kiểm tra lại nhiệt độ digest
hoặc tăng thêm thời gian
|
|
Thời gian cố định quá dài
|
Kiểm tra lại quy trình cố định
bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định trong khoảng 6-72 giờ
|
TÍN
HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên
bệnh phẩm
|
Tăng thời gian cố định
|
|
Probe phân bố không đồng đều
do có bọt khí
|
Thực hiện lại phản ứng lai và
đảm bảo không có bọt khí
|
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn
|
Tăng thể tích dung dịch lai
khi bơm
|
NHUỘM
NỀN CAO
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Quá trình rửa sau khi lai
|
Kiểm tra lại pH của dung dịch
rửa (7,2-7,5)
|
|
|
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa
|
|
|
Lắc trong quá trình rửa
|
|
|
Tăng thời gian rửa bằng SSC
|
MẤT
HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
|
Nguyên nhân
|
Cách khắc phục
|
|
Sấy tiêu bản không đúng
|
Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy
|
|
Bộc lộ quá mức
|
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ
Giảm thời gian bộc lộ
|
|
Biến tính quá mức
|
Kiểm tra lại nhiệt độ biến
tính
Giảm thời gian biến tính
|
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh giá
kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
2. Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
82. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ (IN SITU
HYBRIDIRATION: ISH)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình nhằm hướng dẫn các bước
thực hiện, cách tiến hành phân tích kết quả và các lưu ý nhằm thực hiện xét
nghiệm lai tại chỗ chung cho các loại mồi dò khác nhau từ mẫu bệnh phẩm là khối
nến.
1.2. Nguyên lý
ISH (In situ hybridization):
Lai tại chỗ là kỹ thuật sử dụng các đầu dò gắn mồi có trình tự bổ sung với
trình tự đích quan tâm trên DNA. Kết quả quá trình lai cho phép xác định sự có
mặt, số lượng cũng như tương quan vị trí của các trình tự đích.
Sử dụng kính hiển vi quang học
để biện giải kết quả xét nghiệm. Các kết quả dương tính hỗ trợ trong phân loại
mẫu bệnh bình thường và bất thường, và được dùng bổ sung với các xét nghiệm mô/tế
bào bệnh học truyền thống khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
- Kỹ thuật y: 02
- Nhân viên hỗ trợ: Hộ lý, nhân
viên văn phòng, nhân viên vệ sinh
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
|
STT
|
Hóa chất
|
|
1
|
Mẫu dò gắn đặc hiệu RNA cần
phát hiện
|
|
2
|
Tạo tín hiệu đỏ cho mRNA mục
tiêu
|
|
3
|
Tạo tín hiệu đen cho mRNA mục
tiêu
|
|
4
|
Enzyme phá màng nhân
|
|
5
|
Dung dịch nhuộm tương phản
|
|
6
|
Dung dich khử paraffin
|
|
7
|
Dung dịch dầu bao phủ lên
tiêu bản mô, ngăn hóa chất bốc hơi
|
|
8
|
Dung dịch rửa tiêu bản
|
|
9
|
Đệm xử lý tế bào
|
|
10
|
Dung dịch xử lý tế bào
|
|
11
|
Mẫu dò lai mRNA chứng dương
|
|
12
|
Mẫu dò lai chứng âm
|
|
13
|
Tiêu bản mẫu chứng dương
|
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần;
- Lam kính thường;
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch;
- Lamelle;
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Ependoff 1.5 ml;
- Đầu côn 20 ul có lọc;
- Đầu côn 200 ul có lọc;
- Đầu côn 1ml có lọc;
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
- Bút chì, giấy A4, bút chì.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Máy lắc;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Tủ hút cho phòng xét nghiệm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng u cần lai hai màu để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu: tên,
tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kỹ thuật:
18 giờ;
- Thời gian thực hiện xét nghiệm:
7 ngày làm việc.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.
3. AN TOÀN:
- Thực hiện theo quy định an
toàn phòng xét nghiệm của Bộ y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Cắt mẫu có độ dày 4 μm, lát cắt
dày hơn 4 μm có thể cần xử lý protease mạnh hơn so với khuyến cáo và có thể xuất
hiện bong bóng nhân do paraffin dư thừa trong mô.
- Khối nến bệnh phẩm của bệnh
nhân cắt mảnh và dán lên 2 tiêu bản có sẵn mẫu chứng âm và mẫu chứng dương. Cắt
1 tiêu bản để thực hiện kỹ thuật nhuộm hematoxylin – Eosin thông thường. Mẫu chứng
giúp đánh giá tiêu bản xét nghiệm nhuộm đạt hay không đạt.
+ Tiêu bản chứa chứng dương để
xác định sự bảo tồn mRNA trên mẫu bệnh nhân. Nếu tiêu bản này âm tính có nghĩa
là mRNA trên mô bệnh không còn được bảo tồn, mRNA bị phá hủy.
+ Tiêu bản chứng âm sử dụng để
đánh giá kết quả nhuộm nền, nhuộm không đặc hiệu trên mô bệnh.
4.2. Quy trình nhuộm tự động:
Bước 1: Tiền xử lý mẫu mô: 28
phút
Bước 2: Ly giải màng nhân: 4
phút
Bước 3: Biến tính DNA: 4 phút
Bước 4: Phản ứng lai 6 giờ, nhiệt
độ ủ 72°C
Bước 5: Thực hiện phản ứng khuếch
đại bạc: 16 phút
Bước 6: Hiển thị màu đen: 4
phút
Bước 7: Thực hiện phản ứng khuếch
đại tín hiệu đỏ: 24 phút
Bước 8: Hiển thị màu đỏ: 8 phút
Bước 9: Nhuộm nhân tế bào bằng
hematoxylin: 8 phút
Bước 10: Làm xanh nhân: 4 phút
Bước 11: Làm trong, gắn lamen
4.3. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.3.1. Đọc kết quả
- Quy trình nhuộm tự động tạo
ra sản phẩm phản ứng màu xanh kết tủa tại vị trí DNA hoặc RNA đích.
- Bác sĩ giải phẫu bệnh phải
đánh giá chứng âm và chứng dương trước khi đọc kết quả trên mẫu bệnh phẩm. Nếu lam
chứng nhuộm màu không thích hợp, thì kết quả nhuộm trên mẫu bệnh được coi là
không hợp lệ.
+ Kiểm tra lam chứng dương trước
để xác định rằng tất cả các thuốc thử đang hoạt động đúng. Sự hiện diện của sản
phẩm phản ứng màu xanh trong các tế bào đích là dấu hiệu của phản ứng dương
tính.
+ Chứng âm được kiểm tra sau chứng
dương để xác minh tính đặc hiệu của phản ứng. Không nên có bất kỳ sự nhuộm màu
đặc hiệu nào trên chứng âm. Nếu nhuộm màu xảy ra, nó cho thấy phản ứng chéo
không đặc hiệu với các tế bào hoặc các thành phần của tế bào. Các tế bào nguyên
vẹn nên được sử dụng để đọc kết quả nhuộm màu vì các tế bào hoại tử hoặc thoái
hóa thường bắt màu không đặc hiệu.
- Kết quả đánh giá trên mẫu bệnh
phải được đánh giá cùng với chứng âm dưới kính hiển vi quang học.
+ Kết quả là âm tính khi không
phát hiện được chuỗi DNA hoặc RNA trong tế bào đích.
+ Kết quả dương tính là sự xuất
hiện của tín hiệu màu xanh trong tế bào đích.
Hình thái mô học của mẫu nên được
đánh giá cùng tiêu bản nhuộm HE.
4.3.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở;
Lưu khối nến và tiêu bản theo
quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước xét nghiệm
5.1.1. Mẫu phẩm không đủ u (dưới
100 tế bào) hoặc chất lượng không đạt:
- Nguyên nhân: Do mảnh sinh thiết
quá nhỏ hoặc do các bước trong quy trình giải phẫu bệnh không đạt làm bệnh phẩm
có thể mất kháng nguyên.
- Khắc phục: Đánh giá bằng tiêu
bản nhuộm Hematoxylin nếu không đạt cần chọn lại mẫu phẩm khác của bệnh nhân. Nếu
không có mẫu phẩm khác cần sinh thiết lại (nếu có thể). Nếu không thể sinh thiết
lại cần khuyến cáo bác sĩ chỉ định.
5.1.2. Những sai sót về hoá chất,
trang thiết bị
Hoá chất phải được đảm bảo đúng
khuyến cáo của nhà sản xuất, theo dõi môi trường bảo quản. Trang thiết bị được
hiệu chuẩn, hiệu chỉnh định kì. Các sai sót về hoá chất, vật tư, trang thiết bị
cần khắc phục theo Quy trình quản lý tương ứng.
5.2. Trong quá trình nhuộm
- Theo dõi quá trình nhuộm của
máy để kịp thời xử lý các sự cố khi máy báo lỗi. Khi hệ thống báo lỗi, máy dừng
hoạt động, cần phải chuyển sang các bước tiếp theo nhuộm bằng tay ngay sau đó,
không được để bệnh phẩm trên tiêu bản bị khô.
- Reset lại máy bằng cách khởi
động lại hệ thống. Hệ thống lỗi phức tạp mà người sử dụng không có khả năng xử
lý cần gọi kỹ sư của hãng để được hỗ trợ kịp thời.
5.3. Sau xét nghiệm
5.3.1. Chứng âm nền:
- Nguyên nhân: Bộc lộ quá mức.
- Khắc phục: Test dải nhiệt độ
và thời gian bộc lộ để tìm vị trí nhiệt độ và thời gia tối ưu cho phương pháp
nhuộm. Nhuộm lại bệnh phẩm.
5.3.2. Chứng dương âm tính:
- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; bộc
lộ kháng nguyên chưa đạt; thời gian phản ứng với kháng thể một quá ngắn; kháng
thể một pha loãng lồng độ chưa tối ưu.
- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới;
cắt các tiêu bản chứng dương để test tìm ra thời gian bộc lộ kháng nguyên, thời
gian phản ứng với kháng thể 1, tỉ lệ pha loãng kháng thể 1 sao cho tối ưu. Nhuộm
lại bệnh phẩm.
5.3.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm:
- Nguyên nhân: Tiêu bản khi thực
hiện nhuộm bị nghiêng hoặc hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào
khô sẽ không bắt màu thuốc nhuộm.
- Khắc phục: Cân bằng lại hệ thống
máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực hiện quy trình tiêu bản luôn được để
trong hệ thống kín gió. Nhuộm lại bệnh phẩm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Specimen collection & Transport
guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
Freida Carson: Histotechnoloy,
3rd editon, 2017.
83. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN MÀU (CISH)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này hướng dẫn các bước
thực hiện, cách tiến hành phân tích kết quả và các lưu ý nhằm thực hiện xét
nghiệm lai tại chỗ gắn màu chung cho các loại mồi dò khác nhau từ mẫu bệnh phẩm
là khối nến.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
CISH (chromogenic in situ
hybridization): Lai tại chỗ gắn màu là kỹ thuật sử dụng các đầu dò gắn mồi
có trình tự bổ sung với trình tự đích quan tâm trên DNA. Kết quả quá trình lai
cho phép xác định sự có mặt, số lượng cũng như tương quan vị trí của các trình
tự đích.
Sử dụng kính hiển vi quang học
để biện giải kết quả xét nghiệm. Các kết quả dương tính hỗ trợ trong phân loại
mẫu bệnh bình thường và bất thường, và được dùng bổ sung với các xét nghiệm mô/tế
bào bệnh học truyền thống khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 01
Nhân lực hỗ trợ: Hộ lý, nhân
viên văn phòng, nhân viên vệ sinh
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
|
STT
|
Tên hóa chất
|
|
1
|
Mẫu dò gắn đặc hiệu RNA cần
phát hiện
|
|
2
|
Tạo tín hiệu xanh cho mRNA mục
tiêu
|
|
3
|
Enzyme phá màng nhân
|
|
4
|
Dung dịch nhuộm tương phản
|
|
5
|
Dung dich khử paraffin
|
|
6
|
Dung dịch dầu bao phủ lên
tiêu bản mô, ngăn hóa chất bốc hơi
|
|
7
|
Dung dịch rửa tiêu bản
|
|
8
|
Đệm xử lý tế bào
|
|
9
|
Dung dịch xử lý tế bào
|
|
10
|
Mẫu dò lai mRNA chứng dương
|
|
11
|
Mẫu dò lai chứng âm
|
|
12
|
Tiêu bản mẫu chứng dương
|
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần;
- Lam kính thường;
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch;
- Lamelle;
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Ependoff 1.5 ml;
- Đầu côn 20 ul có lọc;
- Đầu côn 200 ul có lọc;
- Đầu côn 1ml có lọc;
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
- Bút chì, giấy A4, bút chì.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Máy lắc;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Tủ hút cho phòng xét nghiệm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại);
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng u cần lai hai màu để đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay
sau khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm
bảo chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kỹ thuật:
8 giờ;
- Thời gian trả kết quả: 7
ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
- Thực hiện theo quy định an
toàn phòng xét nghiệm của Bộ y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Cắt mẫu có độ dày 4 μm, lát cắt
dày hơn 4 μm có thể cần xử lý protease mạnh hơn so với khuyến cáo và có thể xuất
hiện bong bóng nhân do paraffin dư thừa trong mô.
- Khối nến bệnh phẩm của bệnh
nhân cắt mảnh và dán lên 2 tiêu bản có sẵn mẫu chứng âm và mẫu chứng dương. Cắt
1 tiêu bản để thực hiện kỹ thuật nhuộm hematoxylin – Eosin thông thường. Mẫu chứng
giúp đánh giá tiêu bản xét nghiệm nhuộm đạt hay không đạt.
+ Tiêu bản chứa chứng dương để
xác định sự bảo tồn mRNA trên mẫu bệnh nhân. Nếu tiêu bản này âm tính có nghĩa
là mRNA trên mô bệnh không còn được bảo tồn, mRNA bị phá hủy.
+ Tiêu bản chứng âm sử dụng để đánh
giá kết quả nhuộm nền, nhuộm không đặc hiệu trên mô bệnh.
4.2. Quy trình nhuộm tự động:
Bước 1: Tiền xử lý mẫu mô: 28
phút
Bước 2: Ly giải màng nhân: 20
phút
Bước 3: Biến tính DNA: 1 phút
Bước 4: Hiển thị màu xanh mục
tiêu: 60 phút
Bước 5: Nhuộm đỏ tương phản: 4
phút
Bước 6: Làm trong, gắn lamelle.
4.3. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.3.1. Đọc kết quả
- Quy trình nhuộm tự động tạo
ra sản phẩm phản ứng màu xanh kết tủa tại vị trí Gen đích.
- Bác sĩ giải phẫu bệnh phải
đánh giá chứng âm và chứng dương trước khi đọc kết quả trên mẫu bệnh phẩm. Nếu
lam chứng nhuộm màu không thích hợp, thì kết quả nhuộm trên mẫu bệnh được coi
là không hợp lệ. Lưu ý không nên sử dụng vật kính 100X.
+ Kiểm tra lam chứng dương trước
để xác định rằng tất cả các thuốc thử đang hoạt động đúng. Sự hiện diện của sản
phẩm phản ứng màu xanh trong các tế bào đích là dấu hiệu của phản ứng dương
tính.
+ Chứng âm được kiểm tra sau chứng
dương để xác minh tính đặc hiệu của phản ứng. Không nên có bất kỳ sự nhuộm màu
đặc hiệu nào trên chứng âm. Nếu nhuộm màu xảy ra, nó cho thấy phản ứng chéo
không đặc hiệu với các tế bào hoặc các thành phần của tế bào. Các tế bào nguyên
vẹn nên được sử dụng để đọc kết quả nhuộm màu vì các tế bào hoại tử hoặc thoái
hóa thường bắt màu không đặc hiệu.
- Kết quả đánh giá trên mẫu bệnh
phải được đánh giá cùng với Negative reagent control dưới kính hiển vi quang học.
+ Kết quả là âm tính khi không
phát hiện được chuỗi Gen trong tế bào đích.
+ Kết quả dương tính là sự xuất
hiện của tín hiệu màu xanh trong tế bào đích.
Hình thái mô học của mẫu nên được
đánh giá cùng tiêu bản nhuộm H&E.
4.3.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm
Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ
theo quy định của cơ sở;
Lưu khối nến và tiêu bản theo
quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước xét nghiệm
5.1.1. Mẫu phẩm không đủ u (dưới
100 tế bào) hoặc chất lượng không đạt:
- Nguyên nhân: Do mảnh sinh thiết
quá nhỏ hoặc do các bước trong quy trình giải phẫu bệnh không đạt làm bệnh phẩm
có thể mất kháng nguyên.
- Khắc phục: Đánh giá bằng tiêu
bản nhuộm Hematoxylin nếu không đạt cần chọn lại mẫu phẩm khác của bệnh nhân. Nếu
không có mẫu phẩm khác cần sinh thiết lại (nếu có thể). Nếu không thể sinh thiết
lại cần khuyến cáo bác sĩ chỉ định.
5.1.2. Những sai sót về hoá chất,
trang thiết bị
Hoá chất phải được đảm bảo đúng
khuyến cáo của nhà sản xuất, theo dõi môi trường bảo quản. Trang thiết bị được
hiệu chuẩn, hiệu chỉnh định kì. Các sai sót về hoá chất, vật tư, trang thiết bị
cần khắc phục theo Quy trình quản lý tương ứng.
5.2. Trong quá trình nhuộm
- Theo dõi quá trình nhuộm của
máy để kịp thời xử lý các sự cố khi máy báo lỗi.
Khi hệ thống báo lỗi, máy dừng
hoạt động, cần phải chuyển sang các bước tiếp theo nhuộm bằng tay ngay sau đó,
không được để bệnh phẩm trên tiêu bản bị khô.
- Reset lại máy bằng cách khởi
động lại hệ thống. Hệ thống lỗi phức tạp mà người sử dụng không có khả năng xử
lý cần gọi kỹ sư của hãng để được hỗ trợ kịp thời.
5.3. Sau xét nghiệm
5.3.1. Chứng âm nền:
- Nguyên nhân: Bộc lộ quá mức.
- Khắc phục: Test dải nhiệt độ
và thời gian bộc lộ để tìm vị trí nhiệt độ và thời gia tối ưu cho phương pháp
nhuộm. Nhuộm lại bệnh phẩm.
5.3.2. Chứng dương âm tính:
- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; bộc
lộ kháng nguyên chưa đạt; thời gian phản ứng với kháng thể một quá ngắn; kháng
thể một pha loãng lồng độ chưa tối ưu.
- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới;
cắt các tiêu bản chứng dương để test tìm ra thời gian bộc lộ kháng nguyên, thời
gian phản ứng với kháng thể 1, tỉ lệ pha loãng kháng thể 1 sao cho tối ưu. Nhuộm
lại bệnh phẩm.
5.3.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một
phần mẫu bệnh phẩm:
- Nguyên nhân: Tiêu bản khi thực
hiện nhuộm bị nghiêng hoặc hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào
khô sẽ không bắt màu thuốc nhuộm.
- Khắc phục: Cân bằng lại hệ thống
máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực hiện quy trình tiêu bản luôn được để
trong hệ thống kín gió. Nhuộm lại bệnh phẩm.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
Freida Carson: Histotechnoloy,
3rd editon, 2017.
84. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN HUỲNH QUANG
(FISH)
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích của kỹ thuật
Quy trình này hướng dẫn các bước
thực hiện, cách tiến hành phân tích kết quả và các lưu ý nhằm thực hiện xét
nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang chung cho các loại mồi dò khác nhau từ mẫu bệnh
phẩm là khối nến nhằm xác định các khuếch đại gen.
1.2. Định nghĩa, nguyên lý
Lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH)
là một kỹ thuật di truyền tế bào phân tử, sử dụng các đầu dò huỳnh quang có
trình tự bổ sung với trình tự đích quan tâm trên DNA. Kết quả quá trình lai cho
phép xác định sự có mặt, số lượng cũng như tương quan vị trí của các trình tự
đích.
Kính hiển vi huỳnh quang có thể
được sử dụng để xác định vị trí mồi dò huỳnh quang liên kết với nhiễm sắc thể.
Các kết quả dương tính hỗ trợ trong phân loại mẫu bệnh bình thường và bất thường,
và được dùng bổ sung với các xét nghiệm mô/tế bào bệnh học truyền thống khác.
2. CHUẨN BỊ
2.1. Nhân lực
Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01
Kỹ thuật y: 02
Nhân lực hỗ trợ: Hộ lý, nhân
viên văn phòng, nhân viên vệ sinh
2.2. Vật tư, hoá chất
2.2.1. Hoá chất
- Bộ kit có đầu dò gen cần phát
hiện gắn huỳnh quang.
- Bộ kit xử lý mô cho kỹ thuật
FISH paraffin pretreatment reagent kit .
- Cồn 70°, 900, 100°.
- Toluen.
- Nước cất 2 lần.
2.2.2. Vật tư tiêu hao.
- Dao cắt tiêu bản sử dụng một
lần;
- Lam kính thường;
- Lam kính chuyên dụng cho kỹ
thuật hóa mô miễn dịch;
- Lamelle;
- Que tãi bệnh phẩm.
- Khay đá.
- Giá để tiêu bản.
- Ependoff 1.5 ml;
- Đầu côn 20 ul có lọc;
- Đầu côn 200 ul có lọc;
- Đầu côn 1ml có lọc;
- Khăn sạch.
- Găng tay.
- Nhãn in .
- Nước cất.
- Bút chì, giấy A4, bút chì.
2.3. Trang thiết bị:
- Kính hiển vi quang học, 1 đầu
và nhiều đầu có gắn camera (nếu có);
- Kính hiển vi huỳnh quang kèm
hệ thống phần mềm hỗ trợ phân tích;
- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt
vi phẫu);
- Hệ thống nhuộm hóa mô;
- Máy nhuộm tiêu bản
Hematoxylin Eosin;
- Máy gắn lamelle tự động;
- Bể dàn tiêu bản;
- Máy lắc;
- Tủ lạnh;
- Tủ ấm;
- Tủ hút cho phòng xét nghiệm;
- Máy in nhãn;
- Máy lọc nước RO 2 lần
- Pipet định mức 1000 microlit
- Pipet định mức 200 microlit
- Pipet định mức 50 microlit
- Các dụng cụ và thuốc tẩy
trùng để làm sạch dụng cụ;
- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng
nhựa đựng hóa chất sau pha;
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml,
100ml và 50ml.
- Hệ thống lưu trữ tiêu bản, khối
nến.
- Máy tính, máy in;
- Hệ thống công nghệ thông tin
có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in
barcode, hệ thống thu âm,…) và lưu trữ bệnh phẩm.
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:
- Bệnh phẩm là các mẫu nến có
vùng u cần đánh giá.
- Khối nến bệnh phẩm đạt chất
lượng cần có các yêu cầu sau:
+ Bệnh phẩm được cố định ngay sau
khi mổ trong formalin trung tính 10% với thời gian tối ưu là 6h-14h, nhằm đảm bảo
chất lượng Nucleic acid trong tế bào được giữ nguyên trạng thái, đồng thời
không bị tiểu hủy do enzyme nội sinh.
+ Các quy trình mô bệnh học tạo
ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.
+ Mô u đủ số lượng để nhuộm
(>100 tế bào).
2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:
- Có đầy đủ thông tin về người
bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm,
yêu cầu xét nghiệm.
+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm
sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, loại mẫu.
+ Có ghi rõ tiền sử bệnh lý,
phác đồ điều trị bổ trợ, thời gian điều trị, đánh giá đáp ứng trên lâm sàng và
chẩn đoán hình ảnh (nếu có), tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.
+ Thời gian thực hiện xét nghiệm
giải phẫu bệnh, điều kiện lưu trữ. Ghi ngày giờ nhận, người bàn giao và người
nhận.
- Đối chiếu chỉ định và mẫu:
tên, tuổi, loại bệnh phẩm,…
2.6. Thời gian thực hiện kỹ
thuật:
- Thời gian thực hiện kỹ thuật:
8 giờ;
- Thời gian trả kết quả: 7
ngày.
2.7. Địa điểm thực hiện kỹ
thuật
Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh
3. AN TOÀN:
- Thực hiện theo quy định an
toàn phòng xét nghiệm của Bộ y tế
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm
- Kỹ thuật viên cắt 03
lát bệnh phẩm dày 4 μm trên các lam kính: 1 lát dán trên lam thường nhuộm HE cắt
theo quy trình Nhuộm Hematoxylin – eosin (HE) trên các mảnh mô; 2 lát dán lên
tiêu bản có sẵn chứng âm và chứng dương.
- Bác sỹ Giải phẫu bệnh
đánh giá tiêu bản nhuộm HE, khoanh vùng lựa chọn.
- Cử nhân sinh học căn cứ
vào vùng khoanh trên tiêu bản nhuộm loại bỏ phần bệnh phẩm không cần thiết trên
tiêu bản còn lại.
- Mẫu chứng giúp đánh giá tiêu
bản xét nghiệm nhuộm đạt hay không đạt.
+ Tiêu bản chứa chứng dương để
xác định sự bảo tồn DNA trên mẫu bệnh nhân. Nếu tiêu bản này âm tính có nghĩa
là DNA trên mô bệnh không còn được bảo tồn, DNA bị phá hủy.
+ Tiêu bản chứng âm sử dụng để
đánh giá kết quả nhuộm nền, nhuộm không đặc hiệu trên mô bệnh.
4.2. Các bước nhuộm:
4.2.1. Xử lý mẫu bệnh phẩm
- Chuẩn bị dung dịch bộc lộ:
Cho 50 ml dung dịch pretreatment vào Jar chuyên dụng. Ủ Jar ở 90 - 98°C trong
30 phút trước khi bắt đầu xét nghiệm;
- Chuẩn bị lam kính với bệnh phẩm
dầy 4-5ul, ủ bệnh phẩm ở 56 - 60°C trong 30 phút trước khi bắt đầu xét nghiệm;
- Loại paraffine bằng cách ngâm
lam trong Toluen 5 phút (lặp lại 3 lần);
- Chuyển lam lần lượt sang cồn
100, 90, 70% trong 3 phút;
- Chuyển lam sang nước tinh khiết
trong 3 phút;
- Ngâm lam trong dung dịch rửa
trong 3 phút;
- Ngâm lam trong Pretreatment solution
trong 30 phút ở 90 - 98°C;
- Chuyển lam sang nước tinh khiết
trong 3 phút;
- Ngâm lam trong dung dịch rửa
trong 3 phút;
- Loại bỏ dung dich thừa;
- Nhỏ lên lam dung dịch chứa
Protease (Protease Solution) trong 10 – 60 phút, theo dõi sự thoái biến của
protein trên kính hiển vi quang hoc. Khi trên màng nhân tế bào xuất hiện các lỗ
nhỏ và màng nhân nở ra thì quá trình sử lý có thể dừng lại;
- Ngâm lam lần lượt trong cồn
75%, 85%, 100% trong 1 phút;
- Để khô trong 2-5 phút.
4.2.2. Lai DNA với đầu dò huỳnh
quang
- Chuyển toàn bộ lam kính sau
khi xử lý vào phòng tối;
- Nhỏ 10 ul kit xác định gen đột
biến lên lam kính và đậy lamen;
- Phủ mép lamen bằng nhựa cao
su (rubber cement);
- Chuyển lamen vào máy lai và
chọn chương trình lai (72 °C – 10 phút; 37 °C trong 14 - 20 giờ);
- Sau khi quá trình lai kết
thúc, chuẩn bị 2 jar chứa 50 ml dung dịch rửa, ủ dung dịch rửa 30 phút ở 37 °C
trước khi làm bước tiếp theo. Cẩn thận loại bỏ rubber cement, tránh làm ảnh hưởng
đến mẫu;
- Ngâm lam trong dung dich rửa
sau lai ở 37 °C cho đến khi lamen bong ra;
- Ngâm lam trong dung dich sau
lai ở 37 °C trong 5 phút;
- Để khô lam tự nhiên;
- Nhỏ lên lam 10ul DAPI và đậy
lamen ủ 15 phút.
4.3. Nhận định kết quả và
báo cáo
4.3.1. Đọc kết quả
- Khởi động kính hiển vi huỳnh
quang, cho kính chạy 10 – 15 phút trước khi đọc kết quả.
- Khởi động máy tính và bật phần
mềm phân tích kết quả tích hợp với kính hiển vi huỳnh quang: Meta sytem Isis.
- Kiểm tra kết quả lai
trên các mẫu đối chứng.
- Phân tích kết quả mẫu bệnh phẩm
dựa trên các kênh mầu huỳnh quang tương ứng với các đầu dò của bộ kit.
- Đánh giá theo tiêu chuẩn để kết
luận bất thường về gen theo các tiêu chuẩn của từng loại đột biến. Ví dụ: Khuếch
đại gen Her2 đánh giá theo tiêu chuẩn ASCO/CAP.
4.3.2. Báo cáo, trả kết quả xét
nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở;
Lưu khối nến và tiêu bản theo quy định của cơ sở.
5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
5.1. Trước xét nghiệm
5.1.1. Mẫu phẩm không đủ u (dưới
100 tế bào) hoặc chất lượng không đạt:
- Nguyên nhân: Do mảnh sinh thiết
quá nhỏ hoặc do các bước trong quy trình giải phẫu bệnh không đạt làm bệnh phẩm
có thể mất kháng nguyên.
- Khắc phục: Đánh giá bằng tiêu
bản nhuộm Hematoxylin nếu không đạt cần chọn lại mẫu phẩm khác của bệnh nhân. Nếu
không có mẫu phẩm khác cần sinh thiết lại (nếu có thể). Nếu không thể sinh thiết
lại cần khuyến cáo bác sĩ chỉ định.
5.1.2. Những sai sót về hoá chất,
trang thiết bị
Hoá chất phải được đảm bảo đúng
khuyến cáo của nhà sản xuất, theo dõi môi trường bảo quản. Trang thiết bị được
hiệu chuẩn, hiệu chỉnh định kì. Các sai sót về hoá chất, vật tư, trang thiết bị
cần khắc phục theo Quy trình quản lý tương ứng.
5.2. Trong quá trình nhuộm
- Theo dõi quá trình nhuộm của
máy để kịp thời xử lý các sự cố khi máy báo lỗi. Khi hệ thống báo lỗi, máy dừng
hoạt động, cần phải chuyển sang các bước tiếp theo nhuộm bằng tay ngay sau đó,
không được để bệnh phẩm trên tiêu bản bị khô.
- Reset lại máy bằng cách khởi
động lại hệ thống. Hệ thống lỗi phức tạp mà người sử dụng không có khả năng xử
lý cần gọi kỹ sư của hãng để được hỗ trợ kịp thời.
5.3. Trong phân tích
Tín hiệu yếu hoặc không
có tín hiệu
- Nguyên nhân 1: Không
có đoạn trình tự đích;
Khắc phục: Sử dụng đối chứng để
kiểm tra.
- Nguyên nhân 2: Mẫu được
cố định không đúng cách;
Khắc phục: Tối ưu hóa lại quá
trình cố định. Sử dụng formaline 10% cố định trong 6-14 giờ.
- Nguyên nhân 3: Không
thực hiện đúng cách quá trình sử ly với pepsin; Khắc phục: Tối ưu hóa thời
gian ủ pepsin, tăng hoặc giảm nếu cần thiết.
- Nguyên nhân 4: Probe bị
bốc hơi;
Khắc phục: Tạo buồng lại
ẩm bằng hơi nước và dán kín lamen bằng Rubbercement.
Tín hiệu bị nhiễu, mầu nền
mạnh
- Nguyên nhân: do mẫu
không được làm khô trước khi lai, lượng probe đưa vào quá nhiều, hoặc nồng độ
dung dịch rửa quá cao;
Khắc phục: Phải để mẫu
khô hoàn toàn trước khi lai, tính toán lương probe đưa vào cho phù hợp và tối
ưu lại nồng độ dung dich rửa.
Mô bị tiêu biến
- Nguyên nhân: Do mẫu cố
định không tốt, thời gian bộc lộ quá lâu hoặc thời gian ủ pepsin quá dài;
Khắc phục: Kiểm tra lại
thời gian cố định mẫu, thời gian bộ lộ và thời gian ủ với pepsin (khi u với
pepsin phải vừa ủ vừa quan sát trên kính hiển vi để theo dõi mức độ tiêu biến của
mô).
Tín hiệ u bị chồ ng lấp
- Nguyên nhân: Do cắt mẫu
bệnh phẩm quá dày; Khắc phục: Bảo đảm độ dày của mẫu 2 – 5 um.
Couterstain yếu
- Nguyên nhân: Do chất
lượng DAPI không đảm bảo hoặc do lượng DAPI cho lên mẫu không đủ hoặc thời gian
ủ DAPI quá ngắn;
Khắc phục: Kiểm tra lại
chất lượng DAPI, cho lượng DAPI và ủ DAPI tối thiểu 15 phút trước khi đọc trên
kính hiển vi huỳnh quang.
6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG
- Thực hiện nội kiểm và đánh
giá kết quả nội kiểm theo quy định.
- Tham gia, thực hiện và đánh
giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Specimen collection &
Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.
Pratical Guide to Specimen
Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American
Pathologists.
Tài liệu hướng dẫn của nhà sản
xuất