Gen đích
|
Cặp mồi
|
Trình tự
5’-3’
T. annulata
|
Kích thước
sản phẩm
|
Tams1
|
Mồi xuôi
(forward primer)
|
ATGCTGCAAATGAGGAT
|
785 bp
|
Mồi ngược
(reverse primer)
|
GGACTGATGAGAAGACGATGAG
|
Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn
gen của T. annulata có kích thước sản phẩm 785 bp
Mồi được chuẩn bị như sau:
- Chuẩn bị mồi gốc: mồi ở trạng thái đông
khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi
lắng xuống đáy ống trước khi
mở và hoàn
nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng
độ 100 mM làm mồi gốc.
- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM, pha loãng mồi gốc
bằng nước (3.2.10) (20 ml
mồi gốc và 80 ml nước).
6.2.4.3 Tiến hành phản
ứng
Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị
(6.2.4.2).
Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: dùng bộ kít Taq PCR master mix, Qiagen (Cat.
No. 201443)2)
Thành phần cho một phản ứng được nêu
trong Bảng 2.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thành phần
Thể tích (ml)
Taq PCR Master Mix kít
12,5
Mồi xuôi, 20 mM
0,5
Mồi ngược, 20 mM
0,5
Nước tinh khiết không có nuclease
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tổng thể
tích
20
Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản
ứng:
- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có kích cỡ sản
phẩm đã biết vào
ống phản ứng;
- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.10) vào ống
phản ứng;
- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN bệnh phẩm
(6.2.4.1) vào ống phản ứng.
CHÚ THÍCH:
- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm,
mẫu kiểm chứng dương
và mẫu kiểm chứng âm;
- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong
khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp
phản ứng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bảng 3 - Chu
trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ
Thời gian
Số chu kỳ
94 °C
3 min
1
94 °C
1 min
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60 °C
1 min
72 °C
1 min
40
72 °C
10 min
1
6.2.4.4 Điện di
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Pha agarose (3.2.4) với nồng độ
agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.5) (từ
1,5 gram đến 2 gram agarose với 100ml TAE 1X hoặc TBE 1X) vào chai thủy tinh
250 ml, lắc cho tan.
Sau đó đun dung dịch agarose sôi, để
nguội đến khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 ml chất nhuộm màu (3.2.6) cho
100 ml thạch. Lắc nhẹ để chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo bọt.
Tiến hành đổ dung dịch agarose vào
khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.
Khi bản agarose đông lại thì tiến hành
gỡ lược khỏi bản gel.
Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5),
đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.5) (cùng loại với dung dịch
agarose đã đun) vào bể điện di cho tới khi ngập bản gel.
Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm
ADN để pha agarose
(ví dụ: Sybr
safe ADN gel stain3)) và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản
xuất.
6.2.4.4.2 Chạy điện di
Chuyển 2 ml Loading dye 6X
(3.2.7) vào 8 ml mỗi loại mẫu
(kiểm chứng âm, dương)
(6.2.4.3) và sản phẩm PCR (6.2.4.3) ra trộn đều và cho vào các giếng trên bản
gel (6.2.4.4.1).
Đưa gel vào chạy điện di trong bộ điện
di (4.3.5) với thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm
khuếch đại. Chuyển 10 ml
thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) vào một giếng trên bản gel.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Bản gel sau khi điện di xong được lấy ra và
đọc kết quả trên máy đọc
gel (blue light transilluminator) (4.3.6).
6.2.5 Đọc kết quả
Đặt bản gen lên trên máy đọc gel
(4.3.6):
- Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản
phẩm giống như mẫu kiểm chứng dương và có kích thước 785 bp với điều
kiện mẫu kiểm chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện;
- Mẫu âm tính giống mẫu kiểm chứng âm và
không có vạch sản phẩm xuất hiện;
- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ
nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp
này cần xét nghiệm lại
hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định.
6.3 Phương
pháp ELISA phát hiện kháng thể Theileria
6.3.1 Lấy mẫu
Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến
2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi mắc bệnh Theileria. Sau
khi lấy, rút
pittong lùi ra để tạo
khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống
nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng
45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường,
tránh ánh nắng trực tiếp.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo
quản trong thùng lạnh (nhiệt
độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường
hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu
huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản
trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1)
6.3.3 Chuẩn bị mẫu
Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1)
sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24
h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.
6.3.4 Cách tiến
hành
VÍ DỤ: dùng bộ kit phát hiện
kháng thể Theileria ở trâu bò của
hãng SVANOVA4)
6.3.4.1 Chuẩn bị
nguyên liệu
- Dung dịch đệm: pha loãng dung dịch
PBS - Tween 20 X với
nước cất theo tỷ lệ 1/20 (cho
25 ml PBS Tween 20 X vào
475 ml nước cất), lắc đều. Bảo quản dung dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;
- Dung dịch kháng kháng thể bò: pha loãng dung dịch
kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha
loãng bảo quản ở âm 20 °C.
Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần;
- Pha loãng mẫu kiểm chứng
(âm, dương) và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/100 (cho 5 ml mẫu kiểm chứng hoặc
mẫu bệnh phẩm vào 495 ml
dung dịch đệm).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Các thuốc thử để ở nhiệt
độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trước khi sử dụng;
- Nhỏ 100 ml mẫu kiểm chứng (âm,
dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện
trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh dấu trong đĩa);
- Nhỏ 100 ml mẫu bệnh phẩm đã
pha loãng (6.3.4.1) vào
giếng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2 giếng,
tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng);
- Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm (4.4.1)
trong vòng 30 min;
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch
đệm (6.3.4.1);
- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng
kháng thể bò đã pha loãng (6.3.4.1) vào từng giếng;
- Phủ kín đĩa và ủ
trong tủ ấm
(4.4.1) trong 30 min;
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm
(6.3.4.1);
- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất
vào mỗi giếng;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản
ứng vào mỗi giếng;
- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt
độ phòng trong 30 min;
- Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy
đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min.
6.3.5 Đọc kết quả
- Tính giá trị mật độ quang học (OD) của
mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm.
- Tính tỷ lệ giá trị OD giữa mẫu bệnh
phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm với mẫu kiểm chứng dương (PP) theo công thức sau:
PP =
OD mẫu bệnh phẩm hoặc
mẫu kiểm chứng âm
x 100
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng
giới hạn sau:
1) OD của mẫu kiểm chứng dương: trong
khoảng từ 1,1 đến 2,3
2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn
15
- Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:
1) PP nhỏ hơn 20: mẫu âm tính
2) PP lớn hơn hoặc bằng 20: mẫu dương
tính
CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể
Theileria không thể phân
biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.
6.4 Phương
pháp IFAT phát hiện kháng thể Theileria
6.4.1 Lấy mẫu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.4.2 Bảo quản mẫu
Xem 6.3.2.
6.4.3 Chuẩn bị mẫu
Xem 6.3.3.
6.4.4 Cách tiến
hành
6.4.4.1 Chuẩn bị
kháng nguyên schizont
6.4.4.1.1 Kháng nguyên
schizont trên phiến kính
- Sử dụng kháng nguyên schizont được lấy từ dòng tế bào lympho khi gây nhiễm với T. parva hoặc dòng tế bào đại
thực bào khi gây nhiễm với T. annulata;
- Nuôi cấy 200 ml đến 1 lít tế
bào nhiễm schizont của loài T. parva hoặc T. annulata ở nồng độ 106
tế
bào/ml.
Kiểm tra khi thấy 90 % tế bào bị nhiễm là đạt yêu cầu;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Thu phần cặn, hòa tan với dung dịch
PBS (xấp xỉ 100 ml) để có nồng độ 107
tế bào/ml;
- Nhỏ dung dịch pha loãng ở trên thành
lớp tế bào mỏng lên phiến kính
đã chia thành nhiều ô nhỏ. Khi kiểm
tra ở vật kính 40X thấy mỗi ô chứa khoảng 50 tế bào đến 80 tế
bào;
- Để khô phiến kính trong không khí, cố
định bằng axeton
(3.4.2) trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính
trong tủ lạnh âm sâu
(4.1.1), được ít nhất 1 năm.
6.4.4.1.2 Kháng nguyên schizont huyền
phù
- Lấy khoảng 500 ml tế bào nhiễm T.
parva, T. annulata hoặc T. taurotragi ở nồng độ 106 tế bào/ml đem
ly tâm ở gia tốc 200 g bằng máy ly tâm
lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C, phần cặn thu được rửa 2 lần trong 100 ml dung
dịch PBS lạnh. Có thể kiểm tra các tế bào bằng thuốc nhuộm eosin hoặc trypan blue
(3.4.5);
- Phần cặn được hòa tan bằng cách nhỏ từng
giọt dung dịch pha loãng (axeton và
formaldehyd 0,1 %
(3.4.3)
theo tỷ lệ 4/1). Đảo
nhẹ nhàng và liên tục đến khi đạt huyền phù. Để ổn định các tế bào dạng huyền
phù trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) trong 24 h;
- Rửa, ly tâm ở gia tốc 200 g bằng máy
ly tâm lạnh (4.5.1) trong 20 min ở 4 °C các tế bào trên 3 lần với dung dịch nước
muối sinh lý 0,9 % lạnh. Phần cặn cuối cùng được pha với dung dịch nước muối
sinh lý 0,9 % để đạt dạng huyền phù với nồng độ 107 tế bào/ml;
- Kháng nguyên được bảo quản trong
dung dịch natri azide 0,2 % (3.4.4) (dung dịch chống phân hủy) ở tủ lạnh
(4.1.2) trong 2 tuần hoặc ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu lưu giữ trong thời gian dài.
6.4.4.2 Chuẩn bị
kháng nguyên piroplasm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Kiểm tra máu của con vật gây nhiễm, khi lượng
piroplasm trong máu đạt khoảng 10 % thì lấy 100 ml máu từ tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa
heparine hoặc EDTA, lắc nhẹ nhàng;
- Cho thêm 2 lít dung dịch PBS. Ly tâm dung dịch ở
gia tốc 500 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C. Bỏ phần dung dịch
phía trên thu lấy phần cặn (hồng
cầu). Lặp lại bước này 3 lần;
- Sau khi rửa xong, pha loãng hồng cầu
trong PBS theo tỷ lệ 1/2. Nhỏ 5 ml dung dịch pha loãng lên từng điểm trên phiến kính;
- Phiến kính được làm khô ở nhiệt độ
phòng;
- Cố định phiến kính trong aceton lạnh
4 °C trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) ít
nhất 1 năm.
CHÚ THÍCH: Do không thể nuôi cấy giai đoạn
piroplasm của Theileria
spp. nên kháng nguyên piroplasm được lấy từ máu của con vật nhiễm bệnh. Đối với loài
T. parva, T. annulata hoặc T. taurotragi, gây nhiễm thực nghiệm
trên bê cắt lách bằng cách tiêm dưới da hoặc gây nhiễm trên ve. Đối
với loài T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. mutan hoặc T.
velifera thường gây
nhiễm trên bê cắt
lách qua đường tĩnh mạch hoặc
ve.
6.4.4.2.2 Kháng nguyên
piroplasm huyền phù
- Phương pháp này áp dụng cho T.
parva;
- Lấy 100 ml máu của con vật gây nhiễm T. parva
ở mức cao và làm tương tự như kháng nguyên schizont huyền phù.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Pha loãng kháng nguyên schizont
(6.4.4.1.2) hoặc piroplasm ở dạng huyền phù (6.4.4.2.2) trong dung dịch PBS
theo nồng độ từ 1/2 đến 1/16. Ở nồng độ pha
loãng nào mà có khoảng 50 tế bào đến 80 tế bào nhiễm schizont hoặc 150 đến 200
hồng cầu nhiễm được
nhìn thấy dưới vật kính 40 X thì
dùng nồng độ đó để chuẩn hóa kháng nguyên;
- Kiểm tra kháng nguyên với huyết
thanh kiểm chứng âm và huyết thanh kiểm chứng dương tính để xác định mức
độ dương tính mạnh, trung bình và yếu.
- Đánh giá kết quả:
1) Huyết thanh kiểm chứng dương: có
màu huỳnh quang;
2) Huyết thanh kiểm chứng âm: không có màu huỳnh
quang.
6.4.4.4 Tiến hành phản ứng IFAT
6.4.4.4.1 Đối với kháng
nguyên schizont hoặc piroplasm trên phiến kính
- Bước 1: giải đông phiến kính phủ
kháng nguyên ở 4 °C trong 30 min và sau đó để tiếp 30 min ở nhiệt độ phòng;
- Bước 2: vô hoạt mẫu bệnh phẩm trong
30 min trong nồi hấp ướt ở 56 °C;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bước 4: nhỏ 25 ml của mỗi huyết thanh pha
loãng vào từng
điểm kháng nguyên;
- Bước 5: ủ phiến kính
trong hộp ẩm ở nhiệt độ
phòng trong 30 min;
- Bước 6: rửa bỏ huyết thanh
thừa từ phức hợp kháng nguyên - kháng thể ở trên bằng cách nhúng phiến kính
liên tiếp trong 2 lọ dung dịch PBS, mỗi lần 10 min;
- Bước 7: cho vào mỗi giếng 20 ml dung dịch kháng
kháng thể bò được gắn chất màu huỳnh quang (fluorescein
isothiocyanat - FITC) ở độ pha loãng thích hợp (nồng độ pha loãng phụ
thuộc vào từng phòng thí nghiệm);
- Bước 8: để phiến kính trong hộp ẩm ở nhiệt độ
phòng trong 30 min;
- Bước 9: gắn lamen lên trên phiến
kính bằng một giọt dung dịch chứa PBS và glycerol (3.4.6) (tỷ lệ PBS/glycerol
là 1/1);
- Bước 10: đọc phiến kính bằng kính hiển vi huỳnh
quang (4.5.2).
6.4.4.4.2 Đối với
kháng nguyên schizont huyền phù
- Bước 1: giải đông kháng nguyên ở nhiệt
độ phòng;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bước 3: để khô phiến kính ở
nhiệt độ phòng hoặc 37 °C;
- Bước 4: pha loãng huyết thanh kiểm
chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm ở nồng độ 1/40 trong dung dịch
lymphocyte lysate (3.4.7) (195 ml lymphocyte lysate với 5 ml huyết thanh);
- Bước 5: giống từ bước 4 đến bước 10
trong mục 6.4.4.4.1.
6.4.4.4.3 Đối với
kháng nguyên piroplasm huyền phù
- Bước 1: đánh tan kháng nguyên
piroplasm huyền phù. Pha loãng kháng nguyên theo các bước đã chuẩn hóa ở trên
(6.4.4.3);
- Bước 2: để phiến kính khô ở nhiệt độ
phòng hoặc 37 °C (4.4.1);
- Bước 3: pha loãng huyết
thanh kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm ở nồng độ 1/40 trong dung dịch lymphocyte
lysate (3.4.7) (195 ml
lymphocyte lysate với 5 ml huyết thanh);
- Bước 4: giống từ bước 4 đến bước 10
trong mục 6.4.4.4.1.
6.4.5 Đọc kết quả
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Mẫu dương tính đối với
Theileria khi có màu huỳnh quanh giống với màu của đối chứng
dương;
- Mẫu âm tính đối với Theileria khi
không có màu huỳnh quang giống với màu của đối chứng âm.
7 Kết luận
Trâu bò được kết luận là mắc bệnh
Theileria khi có các đặc điểm dịch
tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm
kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong
tiêu chuẩn này.
Phụ lục A
(Quy định)
Thành phần và chuẩn bị thuốc thử
A.1 Dung dịch muối
đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Natri hydrophosphat (Na2HPO4) 9,47 g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4) 9,08 g
Nước cất 900
ml
A.1.2 Chuẩn bị
Hòa tan natri hydrophosphat và kali
dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng
PBS thương mại và chuẩn
bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.2 Dung dịch
Giemsa,
10 %
Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen
blue) 1 phần
Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1) 9 phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.3 Dung dịch đệm
TAE hoặc TBE
A.3.1 Thành phần
Dung dịch TBE 10X 100 ml
Nước khử ion 900 ml
A.3.2 Chuẩn bị
Lấy 100 ml dung dịch TBE 10X hòa chung với 900
ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
A.4 Dung dịch muối
đệm phosphat (PBS), pH 7,2
A.4.1 Thành phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kali clorua (KCI) 0,2 g
Dinatri hidrophosphat (Na2HPO4) 1,15 g
Kali dihidrophosphat (KH2PO4) 0,2 g
Nước cất 1 000 ml
A.4.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh
pH đến 7,2 bằng axit clohydric.
Bảo quản ở 4 °C.
Phụ lục B
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Quy trình tách chiết ADN
CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng
hóa chất nguy hiểm
và có khả năng gây hại nếu
thao tác không cẩn thận. Do vậy,
nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các
hóa chất này. Luôn
luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện
các thao tác này.
Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít
DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau:
B.1 Pha dung dịch
- Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm
125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm
đặc;
- Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm
160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch AW2
đậm đặc.
B.2 Cách tiến
hành
- Bước 1: ly giải mẫu
• Với mẫu phủ tạng (6.2.3): nhỏ 180 ml
dung dịch ATL vào ống 1.5 ml chứa phần dịch nổi sau khi được
xử lý (6.1.4.1); nhỏ 20 ml protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex
(4.3.3), ủ ở 56 °C
đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3)
15 s trước khi chuyển sang bước 2;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Bước 2: nhỏ 200 ml dung dịch AL vào ống;
trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15
min;
- Bước 3: nhỏ 200 ml etanol từ 96
% đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3).
- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch
trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng
máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu
mới; nhỏ 500 ml dung dịch
AW 1, ly tâm ở gia tốc 6
000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu
mới; nhỏ
500
ml dung dịch AW
2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 3 min, loại bỏ ống
thu;
- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5
ml hoặc 2 ml sạch;
- Bước 8: nhỏ 50 ml dung dịch AE vào giữa
màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống
1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min;
- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5
ml hoặc 2 ml có chứa ADN;
Bảo quản ADN trong tủ lạnh (4.1.2)
nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu
thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
THƯ MỤC TÀI
LIỆU THAM KHẢO
[1] Kirvar E, llhan T, Katzer F,
Hooshmand Rad P, Zweygarth
E, Gerstenberg C, Phipps P, Brown CG. Detection
of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tams1 gene
sequences.
Parasitology. 2000 Mar, 120(Pt3):245-54.
[2] Theileria parva (T.parva-Ab). Available
at:
http://www.veritastk.co.jp/attached/853/lnsert_T_parva_19-2990-00-03.pdf
[3] Phạm Văn Khuê và Phan Lục,
1996, Giáo trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông nghiệp I.
240-242.
[4] Carina M Hall., Joseph D Busch.,
Glen A Scoles., Kristina A Palma-Cagle., Massaro W Ueti., Lowell S Kappmeyer
and David M Wagner, Genetic characterization of Theileria equi infecting horses
in North America: evidence for a limited source of U.S. introductions.
Parasites & Vectors 2013, 6:35
[5] Doliveira C., Vandermerve
M., Habela M., Jacquiet P. &
Jongejan F., 1995. Detection of Theileria annulata in blood samples of carrier cattle by
PCR.
J. Clin. Microbiol. 33, 2665-2669.
[6] Identification of Theileria
species and characterization of Theileria parva stocks. Available at: http://www.fao.org/wairdocs/ilri/x5549e/x5549e0t.htm
1) Thông
tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn
định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự
nếu cho các kết quả tương đương.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3) Thông tin
này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể
sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương
đương.
4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn
và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này.
Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.