Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9129:2011 về Thức ăn chăn nuôi - hàm lượng nitơ hòa tan sau khi xử lí bằng pepsin

• Số hiệu: TCVN9129:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Mẫu thử	Hàm lượng protein thô hòa tan trung bình (g/kg)^1)	r (g/kg)	R (g/kg)
Bột alfalfa	136,6	7,2	26,5
Gluten ngô thức ăn chăn nuôi	141,5	7,9	28,9
Khô dầu dừa	149,5	7,4	31,6
Cỏ ủ chua	192,9	7,9	36,3
Bột xương	512,0	8,9	63,1
Bột lông vũ	574,3	22,1	166,3
^1) Tính theo chất khô.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã dùng;

- kết quả thử nghiệm thu được, biểu thị theo nitơ hòa tan hoặc protein thô hòa tan và trong trường hợp cuối cùng sử dụng hệ số chuyển đổi (ví dụ 6.25);

- nếu độ lặp lại được kiểm tra thì nếu kết quả cuối cùng thu được;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

...

...

...

(Quy định)

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN

Α.1. Phạm vi áp dụng

Phụ lục này quy định phương pháp xác định hoạt độ của pepsin được sử dụng trong phép xác định hàm lượng nitơ hòa tan sau khi xử lý pepsin trong axit clohydric loãng

Α.2. Định nghĩa

Trong phụ lục này, sử dụng định nghĩa sau:

Α.2.1. Đơn vị hoạt độ pepsin (Unit of pepsin activity)

Lượng pepsin được giải phóng trong một phút, trong các điều kiện quy định, lượng nhóm hydroxyl này bắt màu thuốc thử Folin-ciocalteu’s có độ hấp thụ tương đương với 1 µmol tyrosin trong cùng điều kiện.

Α.3. Nguyên tắc

...

...

...

Lọc và bổ sung natri hydroxit và thuốc thử Folin –Ciocalteu. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 750 nm và xác định lượng tyrosin tương ứng từ đường hiệu chuẩn

Α.4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương

Α.4.1. Axit clohydric, c(HCl) = 0,2 mol/l.

Α.4.2. Axit clohydric, c(HCl) = 0,06 mol/l.

Α.4.3. Axit clohydric, c(HCl) = 0,025 mol/l.

Α.4.4. Dung dịch axit tricloaxetic, r(CCl₃CO₂H) = 50 g/l

Α.4.5. Dung dịch natri hydroxyt, c(NaOH)=0,5 mol/l

Α4.6. Thuốc thử Folin – Ciocalteu’s

...

...

...

Để nguội, sau đó gạn dung dịch vào bình định mức 1 lít. Pha loãng bằng nước đến vạch, trộn và lọc. Dung dịch này không được có màu xanh lục.

Trước khi sử dụng, pha loãng 1 thể tích thuốc thử này với 2 thể tích nước.

Α.4.7. Dung dịch hemoglobin

Cân một lượng cơ chất protein-hmoglobin theo phương pháp Anson (khoảng 2 g) tương ứng với 354 mg nitơ và cho vào bình cầu 200 ml có cổ thủy tinh mài và có vạch chai ở 100 ml.

CHÚ THÍCH: xác định hàm lượng nitơ của cơ chất bằng phương pháp Kjeldahl bán vi nếu cần. Hàm lượng nitơ lý thuyết là 17,7% (khối lượng)

Thêm vài mililit axit clohydric loãng (Α.4.2), nối bình cầu với bơm chân không và lắc cho đến khi hemoglobin hòa tan hoàn toàn. Giải phóng chân không và trong khi vẫn tiếp tục lắc, thêm axit clohydric loãng (Α.4.2) đến khoảng 100 ml.

Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.

Α.4.8. Dung dịch chuẩn tyrosin, c(C₉H₁₁NO₃) = 0,2 mmol/l.

Để chuẩn bị dung dịch gốc, hòa tan trong bình định mức 1 lít 181,2 mg tyrosin trong axit clohydric loãng (Α.4.1) và thêm axit clohydric  loãng này đến vạch.

...

...

...

Α.5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường của cụ thể như sau:

Α.5.1. Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 25°C ±1°C.

Α.5.2. Máy đo phổ, có thể thực hiện đo ở bước sóng 750 nm.

Α.5.3. Đồng hồ bấm giờ chính xác, có thể đọc chính xác đến 1s.

Α.5.4. Máy đo pH, có thể đọc chính xác đến 0,1 đơn vị pH.

Α.5.5. Que khuấy thủy tinh, có một đầu dày hơn đầu kia.

Α.6. Các tiến hành

Α.6.1. Chuẩn bị dung dịch

...

...

...

Sử dụng pipet, chuyển 2 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml và pha loãng bằng axit clohydric loãng (Α.4.3) đến vạch. pH của dung dịch này phải là 1,6 ± 0.1

Ngâm bình trong nồi cách thủy (Α.5.1) để ở 25°C.

Α.6.2. Thủy phân

Dùng pipet, chuyển 5,0 ml dung dịch hemoglobin (Α.4.7) vào ống nghiệm và làm ấm đến nhiệt độ 25°C ± 1 °C trong nồi cách thủy (Α.5.1). Thêm 1,0 ml dung dịch pepsin thu được trong Α.6.1 và trộn bằng que khuấy thủy tinh (Α.5.5) với 10 lần di chuyển qua lại. Giữ ống nghiệm trong nồi cách thủy ở 25 °C ±1 °C trong 10 min ± 1 s, thời gian tính từ khi thêm dung dịch pepsin. Thời gian và nhiệt độ phải được quan sát chính xác. Thêm 10,0 ml dung dịch axit tricloaxetic (Α.4.4) đã được làm ấm trước ở nhiệt độ 25°C ± 1°C, trộn và lọc qua giấy lọc khô.

Α.6.3. Hiện màu và đo độ hấp thụ

Sử dụng pipet, chuyển 5,0 ml dịch lọc vào bình nón 50 ml, thêm 10,0 ml dung dịch natri hydroxit (Α.4.5), và 3,0 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (Α.4.6) đã pha loãng, lắc liên tục. Sau 5 min đến 10 min, xác định độ hấp thụ của dung dịch so với nước ở bước sóng 750 nm sử dụng máy đo phổ (Α.5.2) và cuvet có chiều dài đường quang 1 cm.

Α.6.4. Phép thử trắng

Đối với mỗi phép xác định, tiến hành phép thử trắng như sau:

Sử dụng pipet, chuyển 5,0 ml dung dịch hemoglobin (Α.4.7) vào ống nghiệm. Làm ấm đến nhiệt độ 25 °C ± 1 °C trong nồi cách thủy (Α.5.1), thêm 10,0 ml dung dịch axit tricloaxetic (Α.4.4) đã được làm ấm trước đến 25°C ± 1°C, trộn và thêm 1,0 ml dung dịch pepsin thu được trong Α.6.1. Dùng que khuấy thủy tinh để trộn và giữ ống nghiệm trong nồi cách thủy (Α.5.1) ở 25 °C ± 1 °C trong 10 min ± 1 s. Trộn và lọc qua giấy lọc khô. Sau đó thực hiện theo Α.6.3.

...

...

...

Trong một dãy sáu bình nón 50 ml, cho 0 ml (thành phần zero), 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml, và 5,0 ml dung dịch chuẩn tyrosin (Α.4.8), tương ứng với 0 µmol, 0,2 µmol, 0,4 µmol, 0,6 µmol, 0,8 µmol, và 1,0 µmol tyrosin. Khi thích hợp thêm vào mỗi bình, một lượng đủ axit clohydric loãng (Α.4.1) để đưa tổng thể 5,0 ml trong bình.

Thêm vào mỗi bình 10,0 ml dung dịch natri hydroxit (Α.4.5) và 3,0 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (Α.4.6) tổng thể tích là 5,0 ml trong bình.

Thêm vào mỗi bình 10,0 ml dung dịch natri hydroxit (Α.4.5) và 3,0 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (Α.4.6) đã pha loãng, lắc liên tục. Đo độ hấp thụ của từng dung dịch như trong Α.6.3.

Dựng đường chuẩn biểu thị độ hấp thụ dựa vào lượng tyrosin tính bằng micromol.

Α.7. Biểu thị kết quả

Từ đường chuẩn, xác định lượng tyrosin bằng micromol, tương ứng với độ hấp thụ của dung dịch màu, đã hiệu chỉnh với phép thử trắng.

Tính hoạt độ của pepsin ở 25°C ± 1°C, bằng micromol tyrosin trên miligam và trên phút, theo công thức sau:

Trong đó:

...

...

...

m là khối lượng pepsin đã sử dụng trong Α.6.1, tính bằng miligam (mg);

n là lượng tyrosin đọc được từ đường chuẩn, tính bằng micromol (µmol);

t là thời gian phản ứng, tính bằng phút (t=10 min).

CHÚ THÍCH Hai đơn vị hoạt độ pepsin trên miligam thu được bằng phương pháp này tương ứng 3,64 mili đơn vị Anson trên miligam (micromol tyrosin trên miligam trên phút ở 35,5 °C) hoặc 36400 đơn vị thương mại trên gam (micromol tyrosin trên gam trong 10 min ở 35,5 °C).

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi một phép thử nghiệm liên phòng được thực hiện ở cấp quốc tế do ISO/TC 34/SC 10 thực hiện phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [2]. Trong các phép thử này có 19 phòng thử nghiệm tham gia, mỗi phòng thực hiện ba phép xác định trên sáu mẫu thử.

...

...

...

Bột alfalfa

Gluten ngô thức ăn chăn nuôi

Khô dầu dừa

Cỏ ủ chua

Bột xương

Bột lông vũ

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ ngoại lệ

17

18

...

...

...

18

15

17

Hàm lượng protein thô hòa tan trung bình, (g/kg)^1)

136,6

141,5

149,5

192,9

512,0

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại (sr), g/kg

2,5

3,1

2,6

2,8

3,2

7,8

Hệ số biến thiên lặp lại, %

1,8

...

...

...

1,7

1,4

0,6

1,4

Giới hạn độ lặp lại (r) [r=2,8 x sr], g/kg

7,2

8,9

7,4

7,9

...

...

...

22,1

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), g/kg

9,4

10,2

11,2

12,8

22,3

58,8

Hệ số biến thiên tái lập, %

...

...

...

7,2

7,5

6,6

4,4

10,2

Giới hạn tái lập (R) [R=2,8 x sR), g/kg

26,5

28,9

31,6

...

...

...

63,1

166,3

^1) Tính theo chất khô

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc của định nghĩa chung.

[2] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[3] TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.

[1] Hiện nay đã có TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử