Tiêu chuẩn TCVN 8685-42:2023 về Quy trình kiểm nghiệm Vắc xin phòng bệnh E.coli ở gia cầm

• Số hiệu: TCVN8685-42:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

Trong đó:

N: mật độ vi khuẩn trong 1 ml canh trùng.

C: số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.

V: thể tích (ml) cấy ở mỗi đĩa.

n₁: số đĩa của độ pha loãng ban đầu (2 đĩa).

n₂: số đĩa của độ pha loãng tiếp theo (2 đĩa).

d: độ pha loãng ban đầu.

- Pha canh trùng 2 x 10^9 CFU/ml như sau:

Lấy số vi khuẩn đã tính được ở trên (N- theo công thức B.1) chia cho số vi khuẩn cần dùng (2 x 10^9 CFU/ml) ta được một thông số (X). Sau đó ta lấy 1ml canh trùng nguyên ban đầu cộng với số ml (Y) nước muối sinh lý. Số ml của Y = X - 1 ( điều kiện X ≥ 1), (B.2).

...

...

...

Lấy 3 x 10^9 CFU/ml chia cho 2 x 10^9 CFU/ml được thông số là 1,5. Để được canh trùng 2 x 10^9 CFU/ml ta sẽ lấy 1 ml canh trùng 3 x 10^9 CFU/ml và thêm vào 0,5 ml nước muối sinh lý. Hỗn dịch cuối cùng là canh trùng cần pha.

B.3.6  Chế huyết thanh tối miễn dịch

- Ngày thứ 1: tiêm 2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ (B.1.3) theo đường dưới da.

- Ngày thứ 7: tiêm tiếp 0,2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 11: tiêm tiếp 0,5 mL canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 15: tiêm tiếp 1 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 19: tiêm tiếp 1,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 23: tiêm tiếp 2 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 27: tiêm tiếp 2,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

...

...

...

- Ngày thứ 35: tiêm tiếp 3,5 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 39: tiêm tiếp 4 ml canh trùng (B.3.5) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Một tuần sau mũi tiêm cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ, chắt huyết thanh. Đó chính là huyết thanh tối miễn dịch.

B.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên thân (B.3.3) thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U (B.2.5).

- Bố trí thí nghiệm.

+ Giếng thí nghiệm: A1 đến H8;

+ Giếng đối chứng âm: A9 đến H10;

+ Giếng đối chứng dương: A11 đến H12.

...

...

...

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên.

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Dùng pipet đa kênh (B.2.6) hút 50 μl dung dịch PBS vào mỗi giếng thí nghiệm (A1 đến H8);

+ Dùng pipet đa kênh (B.2.6) hút 50 μl huyết thanh (B.3.4) cho vào giếng đầu tiên và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl;

+ Dùng pipet đa kênh (B.2.6) hút 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3) cho vào các giếng (A1 đến H8);

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm (A9 đến H10): Dùng pipet đơn kênh (6.3) hút 50 μl dung dịch PBS (B.1.7) và 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3);

+ Đối chứng dương (A11 đến H12): Dùng pipet đơn kênh (6.3) hút 50 μl huyết thanh tối miễn dịch (B.3.6) và 50 μl kháng nguyên thân (B.3.3).

...

...

...

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng;

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra phản ứng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm đều ở đáy giếng;

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Ví dụ phản ứng ELISA kiểm tra kháng thể E.coli O78

C.1  Vật liệu thử

...

...

...

C.1.2  Nước cất 2 lần.

C.1.3  Bộ Kit ELISA.

C.2  Thiết bị, dụng cụ

C.2.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

C.2.2  Pipet đa kênh, thể tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl.

C.2.3  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 vòng/phút đến 2400 vòng/phút.

C.2.4  Máy đọc Elisa, có bước sóng 405 nm đến 650 nm.

C.3  Cách tiến hành

C.3.1  Đặt lần lượt 2 giếng đối chứng dương, đối chứng âm, mẫu kiểm tra và giếng blank trên đĩa phủ trước theo thứ tự định sẵn. Cho dung dịch vào đáy mỗi giếng mà không chạm vào thành bên. Dùng pipet hút các chất chuẩn và mẫu lên xuống để trộn đều trước khi cho vào giếng. Tránh tạo bọt hoặc bong bóng.

...

...

...

C.3.3  Nhỏ 50 μl mẫu đã được pha loãng thích hợp (độ pha loãng 1:4, ví dụ: 10 μl mẫu pha với 40 μl Samμle Diluent Buffer) vào các giếng có mẫu thử nghiệm. Gõ nhẹ vào đĩa (hoặc sử dụng máy lắc) để trộn.

C.3.4  Dán và ủ đĩa ở 37 °C (C.2.1) trong 30 phút.

C.3.5  Tháo miếng dán và đổ bỏ dung dịch trong đĩa. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa. Làm đầy vào từng giếng 300 μl bằng cách sử dụng pipet đa kênh (C.2.2) hoặc máy rửa tự động (khuyến cáo thời gian ngâm khoảng 1 đến 2 phút). Việc loại bỏ hoàn toàn chất lỏng ở mỗi bước là điều cần thiết để đạt được hiệu quả tốt. Sau lần rửa cuối cùng, loại bỏ phần còn lại bằng cách hút hoặc gạn. Lật ngược đĩa và thấm vào khăn giấy sạch thấm nước.

C.3.6  Nhỏ 50 μl dung dịch Detection Reagent vào mỗi giếng (trừ giếng đối chứng). Dán đĩa và ủ ở 37 °C trong 30 phút.

C.3.7  Tháo miếng dán, loại bỏ dung dịch và lặp lại bước (C.3.5) (thực hiện bước này 5 lần).

C.3.8  Nhỏ 50 μl cơ chất A và 50 μl cơ chất B vào mỗi giếng. Gõ nhẹ đĩa để trộn đều. Dán đĩa và ủ ở 37 °C trong 10 phút. Tránh để đĩa tiếp xúc với ánh sáng.

C.3.9  Nhỏ 50 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, nên trộn đều và nhanh để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính của enzym.

C.3.10  Đảm bảo không có dấu vân tay hoặc nước dưới đáy đĩa. Chất lỏng trong giếng không có bọt. Đặt đĩa vào máy đọc ELISA (C.2.4) và đọc ở bước sóng 450 nm để thu được các giá trị mật độ quang học (Optical density - OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

C.4  Công thức tính kết quả

...

...

...

(C.1)

- Đối chứng âm trung bình (NCx) =

(C.2)

- OD mẫu trung bình (ODtb) =

(C.3)

Giá trị CUT OFF = Đối chứng âm (C.1) + 0,15.

...

...

...

PCx (C.1) ≥ 1,0.

NCx (C.2) ≤ 0,15.

ODx của Control zero (giếng blank) ≤ 0,15.

Nếu PCx (C.1) ≥ 1,0, NCx (C.2) ≤ 0,15, và ODx của Control zero ≤ 0,15 kết quả hợp lệ, nếu ngược lại thì kết quả không hợp lệ.

C.6  Diễn giải kết quả

Nếu OD mẫu (C.3) < CUT OFF, mẫu thử nghiệm âm tính.

Nếu OD mẫu (C.3) ≥ CUT OFF, mẫu thử nghiệm dương tính.

Phụ lục D

...

...

...

Triệu chứng và bệnh tích của bệnh E.coli gia cầm

D.1  Triệu chứng

Gia cầm bị bệnh thường xù lông, xệ cánh, ít vận động, mào thâm xám, ăn kém hoặc bỏ ăn. Khi bị nặng, gia cầm sinh tiêu chảy, phân loãng, vàng, xanh lẫn nhiều bọt khí, khó thở, nhịp thở tăng, tỷ lệ chết tăng dần và chết nhiều.

D.2  Bệnh tích

Ở độ tuổi vịt hoặc gà sử dụng làm thí nghiệm thường có bệnh tích của thể nhiễm trùng huyết kế phát sau khi bị những bệnh về đường hô hấp như: bệnh hô hấp mãn tính, Newcastle, bệnh viêm phế quản.

Biểu hiện bên ngoài là gà mệt mỏi, kém ăn, chết sau 5 ngày phát bệnh. Khi mổ vào bên trong sẽ thấy bệnh tích là viêm phế quản, viêm phổi, viêm túi khí. Trường hợp viêm túi khí là bệch tích phổ biến nhất, sẽ thấy có nhiều dịch nhầy trắng ở bên trong. Một số bệnh tích nữa như viêm cơ tim, viêm màng bao tim...

Nhiễm trùng huyết kế phát sau khi bị những bệnh về đường tiêu hóa: bệnh tích đặc trưng nhất là gan bị sưng phù, chuyển sang màu xanh của mật, lách sưng sung huyết, xuất hiện nhiều hạt ở gan, ruột, manh tràng...

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2019). 46 VT- 2019/KN1 - Quy trình kiểm nghiệm vắc xin phòng bệnh E.coli gia cầm.