Tiêu chuẩn TCVN 13917-2:2023 về Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen bằng phương pháp real-time PCR - Phần 2

• Số hiệu: TCVN13917-2:2023
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2023

Chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu gen adh1 là 135 bp; chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 là 76 bp. Có thể sử dụng thuốc nhuộm reporter và/hoặc thuốc nhuộm quencher tương tự nếu cho các kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

5.7  Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

5.8  Uracil N-glycosylase (UNG), tùy chọn, để giảm thiểu nhiễm chéo PCR.

6  Thiết bị, dụng cụ

6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học phân tử trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

6.2  Máy ly tâm, có tốc độ quay từ 6 000 rpm /min đến 12 000 rpm /min.

6.3  Máy chu trình nhiệt real-time

Thiết bị khuếch đại ADN in vitro và thực hiện các chu trình nhiệt độ-thời gian cần thiết cho PCR. Ngoài ra, máy phải có khả năng kích thích các phân tử huỳnh quang ở các bước sóng quy định và phát hiện đủ ánh sáng huỳnh quang phát xạ của chất đánh dấu huỳnh quang được dùng để thực hiện các phân tích định dạng TaqMan, Sybergreen.

...

...

...

6.5  Pipet, có các dung tích phù hợp

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Đối với hại ngô và sản phẩm từ ngô, nên lấy mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333). Đối với các sản phẩm khác, lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể có liên quan. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thoả thuận với nhau về vấn đề này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện, mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8  Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị phần mẫu thử theo 5.1 của TCVN 7606 (ISO 21571).

Tách chiết/tinh sạch ADN theo 5.2 của TCVN 7606 (ISO 21571). Nên tiến hành tách chiết/tinh sạch ADN theo các phương pháp nêu trong phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571).

Định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch theo 5.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). Nên tiến hành định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch theo các phương pháp nêu trong phụ lục B của TCVN 7606 (ISO 21571).

ADN đã tách chiết/tinh sạch được đánh giá độ tinh sạch theo Điều 6.3 của TCVN 13917-1:2023. Nên sử dụng các phương pháp tách chiết ADN được mô tả trong phụ lục A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). ADN đã tách chiết có thể được đánh giá độ tinh sạch theo Điều 6.4 của TCVN 13917-1:2023.

...

...

...

9.1  Thiết lập real-time PCR^[2]

Chuẩn bị real-time PCR cho trình tự đích đặc hiệu taxon adh1 và trình tự đích đặc hiệu MIR 604 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.

Phương pháp này sử dụng tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μl cho mỗi phản ứng real-time PCR, với các thành phần thuốc thử như trong Bảng 2a và 2b. Thuốc thử phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cẩn thận và ly tâm (trong thời gian từ 20 giây đến 30 giây ở tốc độ từ 6000 rpm trở lên) trước khi lấy bằng pipet. Hỗn hợp thuốc thử PCR được chuẩn bị có chứa tất cả các thành phần trừ ADN mẫu thử. Tổng lượng hỗn hợp thuốc thử PCR cần được chuẩn bị phụ thuộc vào số phản ứng cần thực hiện, bao gồm ít nhất thêm một phản ứng cho mỗi lượng 10 phản ứng cần thực hiện để dự phòng cho phản ứng bổ sung. Số lượng mẫu thử và các phép kiểm chứng lặp lại theo Điều 7.2 của TCVN 13917-1:2023. Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time được nêu trong Bảng 2a và 2b.

Bảng 2a - Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time cho trình tự đích đặc hiệu taxon adh1

Tên thành phần

Nồng độ cuối trong PCR

Nồng độ gốc

Thể tích trên mẫu

(μL)

...

...

...

25 μL

Khuôn mẫu ADN (tối đa 200 ng)

40 ng/μL

5 μL

Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Master Mix^c

(ví dụ Suppl. JumpStart Taq Ready Mix)

2x

...

...

...

Uracil N-glycosylase

Đệm phản ứng (chứa chuẩn nội thụ động ROX)^b

Hỗn hợp dNTP

Sulforhodamine 101^d

MgCl₂

Zm adh1-F

300 nmol/L

10 mmol/L

0,75 μL

...

...

...

300 nmol/L

10 mmol/L

0,75 μL

Đoạn dò adh1

200 nmol/L

10 mmol/L

0,5 μL

Nước

...

...

...

Thêm đến 25 μL

CHÚ THÍCH:

^b ROX: carboxy-X-rhodamine

^c Dung dịch Master Mix phù hợp với từng loại máy chu trình nhiệt real-time

^d Dung dịch Suppl. JumpStart Taq Ready Mix được chuẩn bị bằng cách cho một lượng phù hợp Sulforhodamine 101 và MgCl₂ vào JumpStart Taq Ready Mix từ Sigma. Có thể dùng master mix 2x khác phù hợp với từng loại máy chu trình nhiệt real-time nếu cho kết quả tốt hơn hoặc tương đương.

Bảng 2b - Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time cho trình tự đích đặc hiệu MIR 604

Tên thành phần

Nồng độ cuối trong PCR

Nồng độ gốc

...

...

...

Tổng thể tích phản ứng

25 μL

Khuôn mẫu ADN (tối đa 200 ng)

40 ng/μL

5 μL

Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Master Mix^c

(ví dụ Suppl. JumpStartTaq Ready Mix)

...

...

...

12,5 μL

Uracil N-glycosylase

Đệm phản ứng (chứa chuẩn nội thụ động ROX)^b

Hỗn hợp dNTP

Sulforhodamine 101^d

MgCl₂

MIR 604-F

600 nmol/L

10 mmol/L

...

...

...

MIR 604-R

300 nmol/L

10 mmol/L

0,75 μL

Đoạn dò MIR 604

200 nmol/L

10 mmol/L

0,5 μL

Nước

...

...

...

Thêm đến 25 μL

CHÚ THÍCH:

^b ROX: carboxy-X-rhodamine

^cDung dịch Master Mix phù hợp với từng loại máy chu trình nhiệt real-time

^d Dung dịch Suppl. JumpStart Taq Ready Mix được chuẩn bị bằng cách cho một lượng phù hợp Sulforhodamine 101 và magiê clolua (MgCl₂) vào JumpStart Taq Ready Mix từ Sigma. Có thể dùng master mix 2x khác phù hợp với từng loại máy chu trình nhiệt real-time nếu cho kết quả tốt hơn hoặc tương đương.

Chuẩn bị các ống phản ứng như sau:

a) trộn hỗn hợp thuốc thử PCR, ly tâm trong thời gian trong thời gian 30 giây đến 1 phút ở tốc độ 6 000 rpm trở lên và dùng pipet lấy 20 μl cho vào mỗi ống phản ứng;

b) thêm 5 μl từng ADN mẫu thử hoặc mẫu chuẩn hoặc kiểm chứng ADN đích dương tính hoặc kiểm chứng ADN đích âm tính hoặc nước vào các ống phản ứng tương ứng;

...

...

...

d) chuyển các ống phản ứng đã chuẩn bị vào máy chu trình nhiệt real-time. Bật chương trình thời gian và nhiệt độ như trong Bảng 3.

9.2  Các mẫu kiểm chứng PCR

Có thể sử dụng các mẫu chuẩn được chứng nhận MIR 604 (CRM chứa từ 0 % đến 100 % sự kiện ngô chuyển gen MIR 604) hoặc các mẫu chuẩn tương đương làm mẫu đối chứng dương, vật liệu chuẩn so sánh và vật liệu xây dựng các điểm của đường chuẩn trong phân tích định lượng.

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

9.3  Cài đặt chương trình nhiệt độ và thời gian

Cài đặt chương trình nhiệt độ và thời gian như trong Bảng 3. Việc sử dụng các điều kiện phản ứng và máy chu trình nhiệt real-time khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù hợp cụ thể và cần được kiểm tra xác nhận. Nhiệt độ và thời gian yêu cầu để hoạt hóa enzym phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng 3 - Chương trình nhiệt độ và thời gian

Thông số

Nhiệt độ

...

...

...

Đo huỳnh quang

Số chu kỳ

Tiền PCR: Khử nhiễm (UNG)^e

50 °C

120 s

Không

1

Hoạt hóa và biến tính ban đầu

95 °C

...

...

...

Không

1

Khuếch đại

Biến tính

95 °C

15 s

Không

40

Gắn mồi và kéo dài

...

...

...

60 s

Có

CHÚ THÍCH: ^e Khử nhiễm (UNG) tùy chọn

9.4  Dựng đường chuẩn

Sử dụng ADN mẫu chuẩn (CRM/RM) có nồng độ phần trăm sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 đã biết để dựng đường chuẩn^[5]. Đường chuẩn nên nằm trong phạm vi dải động, bao gồm các giá trị tương ứng với mục đích sử dụng dự kiến, thể hiện dưới dạng phần trăm sự kiện ngô chuyển gen MIR 604^[3]. Pha loãng ADN chuẩn (CRM/RM) về nồng độ xấp xỉ 40 ng/μl và sử dụng 200 ng ADN là điểm chuẩn số một. Đường chuẩn được xây dựng bao gồm 4 đến 5 điểm, mỗi điểm chuẩn lặp lại ít nhất 2 lần đối với cả gen đặc hiệu taxon adh1 và gen đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MIR 604. Các mẫu thử nghiệm được thực hiện đồng thời với đường chuẩn trong cùng một lượt chạy phản ứng real-time^[5].

Đối với mỗi điểm chuẩn, sự khác biệt đối với mỗi giá trị gen đích sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 và gen đích taxon adh1 được tính toán (đó là ΔCt). Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị các giá trị ΔCt của các điểm chuẩn theo logarit số phần trăm gen đích sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 và gen đích taxon adh1. Độ đốc (a) và giao điểm (b) của đường chuẩn (y = ax + b) sau đó được sử dụng để tính hàm lương phần trăm (%) sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 trung bình của các mẫu chưa biết. Giá trị này có thể được tính bằng Excel hoặc trên tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống real-time PCR chuyên biệt.

Tiêu chí chấp nhận của đường chuẩn: Giá trị trung bình của độ dốc của đường chuẩn phải nằm trong dải từ -3,6 đến -3,1; tương ứng với hiệu suất khuếch đại từ 90 % đến 110 %^[5].

10  Tính và biểu thị kết quả

10.1  Phát hiện sự kiện ngô chuyển gen MIR 604

...

...

...

a) Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 được coi là phát hiện được, nếu^[2]:

- khi sử dụng real-time PCR đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MIR 604, có thể quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước [chu kỳ ngưỡng C_t] đã bị vượt quá ngưỡng.

- việc thiết lập các kiểm soát PCR không bổ sung ADN (kiểm soát thuốc thử PCR, kiểm soát chiết âm tính), không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước [chu kỳ ngưỡng C_t] không bị vượt quá ngưỡng.

- việc thiết lập các kiểm soát khuếch đại (kiểm soát ADN đích dương tính, kiểm soát ức chế PCR) thì thu được các giá trị C_t dự kiến.

b) Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 được coi là không phát hiện, khi:

- kết quả được biểu thị là “không xác định”, “không khuếch đại”, không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S cho thấy không có sản phẩm PCR có thể phát hiện được.

- hoặc giá trị huỳnh quang xác định trước [chu kỳ ngưỡng C_t] không bị vượt quá ngưỡng (với [chu kỳ ngưỡng C_t] là giá trị huỳnh quang C_t mẫu chuẩn tương ứng với LOD của phòng thử nghiệm).

Nếu dữ liệu đo huỳnh quang không điển hình thì việc diễn giải tự động không cho kết quả có nghĩa, có thể cần thiết lập thủ công đường nền và ngưỡng trước khi diễn giải dữ liệu. Trong trường hợp này, áp dụng các hướng dẫn cho thiết bị cụ thể được cung cấp cùng phần mềm diễn giải ^[3]).

Việc biểu thị kết quả được nêu trong Điều 7.2 của TCVN13917-1:2023.

...

...

...

Hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 đơn bội, X, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (1):

(1)

Trong đó:

N_{MIR 604}  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MIR 604, tính bằng phần trăm khối lượng (%);

N_taxon  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu taxon adh1, tính bằng phần trăm khối lượng (%).

Tùy theo từng loại máy chu trình nhiệt real-time, hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 có thể được phần mềm của máy tính toán đưa ra kết quả.

11  Yêu cầu đảm bảo chất lượng

Xem Điều 8.2.3 của TCVN 13917-1:2023.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, tùy từng trường hợp cụ thể kết quả phải ghi:

- kết quả mẫu âm tính: "Đối với mẫu A, không phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MIR 604".

- kết quả mẫu dương tính: “Đối với mẫu A, phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MIR 604”.

- kết quả định lượng: “Đối với mẫu A, hàm lượng ADN có nguồn gốc từ sự kiện ngô chuyển gen MIR 604 là X ± u_meas %”, trong đó u_meas là độ không đảm bảo đo.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Joint Research Centre of the European Commission (2011), Quantitative PCR method for detection of maize event MIR604, JRC Compendium of Reference Methods for GMO Analysis.

[2] TCVN 7605-2:2017 (ISO/TS21569-2:2012), Phương pháp phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phần 2: Phương pháp real-time PCR đặc hiệu cấu trúc để phát hiện sự kiện FP967 của dòng hạt lanh và sản phẩm từ hạt lanh.

[3] TCVN 13842-2:2023 (ISO/TS 20224-3), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 3: Phương pháp phát hiện ADN của lợn.

[4] Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing, (2015) JRC Technical Report. European Network of GMO Laboratories (ENGL). European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF). 24 pages.

[5] HOUGS L, GATTO F, GOERLICH O, GROHMANN L, LIESKE K, MAZZARA M, NARENDJA F, OVESNA J, PAPAZOVA N, SCFIOLTENS I, ZEL J. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. JRC technical report. Version 2. 2017. EUR29015 EN. 30 pages.

[6] TCVN 12613:2019 (ISO 21570:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic.

[7] TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Thuật ngữ và định nghĩa.

[8] TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu.