TCVN-12371-2-14-2024-Quy-trinh-giam-dinh-vi-khuan-gay-hai-thuc-vat-Phan-2-14

• Số hiệu: TCVN12371-2-14:2024
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2024

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-14:2024

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-14: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS ĐỐM VÒNG THUỐC LÁ (TOBACCO RINGSPOT VIRUS - TRSV)

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-14: Particular requirements for Tobacco ringspot virus (TRSV)

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-14:2024 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

...

...

...

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid

- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus

- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae

- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus

...

...

...

- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus

- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-14: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS ĐỐM VÒNG THUỐC LÁ (TOBACCO RINGSPOT VIRUS - TRSV)

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-14: Particular requirements for Tobacco ringspot virus (TRSV)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định về các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus đốm vòng thuốc lá Tobacco ringspot virus (TRSV) gây bệnh trên mẫu thực vật (hạt, lá, quả).

...

...

...

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1: 2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm (theo điều 3 của TCVN 12371-1:2019) và các thiết bị sau:

3.1  Bể ủ nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C

3.2  Hệ thống đọc bản gel UV thông thường

3.3  Máy chu trình nhiệt (PCR), cho phép thể tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.4  Máy đảo mẫu (máy vortex), tốc độ lắc đạt 1 000 r/min, lắc tròn

3.5  Máy điện di, có công suất tới 150W, điện áp tới 300V và dòng tới 700mA

...

...

...

3.7  Máy nghiền mẫu, có thể nghiền từ 0,1 g đến 1000 g mẫu

3.8  Máy real-time PCR cho phép thể tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.9  Tủ âm, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 80 °C đến âm 20 °C

3.10  Tủ mát, có thể duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12371-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các loại dung dịch tham khảo phụ lục B.

4.1  Agarose: nồng độ 1,5 %

4.2  Axit axetic (CH₃COOH): nồng độ 100%

4.3  Axit boric (H₃BO₃): tinh thể

...

...

...

TRSV-F: 5' - CTT GCG GCC CAA ATC TAT AA - 3’ [3]

TRSV-R: 5' - ACT TGT GCC CAG GAG AGC TA - 3' [3]

4.5  Cặp mồi đặc hiệu cho ToRSV để giám định bằng phương pháp real-time RT-PCR

TRSV-FP: 5' - GGG GTG CTT ACT GGC AAG G - 3' [6]

TRSV-RP: 5' - GCA CCA GCG TAA GAA CCC AA - 3' [6]

4.6  Dung dịch nạp mẫu (loading dye)

4.7  Đệm nhuộm điện di

4.8  Ethylenediaminetetraacetic Axit (EDTA) (C₁₀H₁₆N₂O₈): tinh thể

4.9  Kit nhân gen, bộ gồm các hóa chất sử dụng cho phản ứng RT-PCR (Reverse transcription - polymerase chain reaction) một bước hoặc real-time RT-PCR (Realtime Quantitative Reverse transcription - polymerase chain reaction) một bước đã được thương mại

...

...

...

4.11  Mẫu dò (Probe)

TRSV FAM Probe: 5' - FAM - TGA TTT GCG GCG TAC TG - MGB - 3' [6]

4.12  Mẫu đối chứng dương

4.13  Mẫu đối chứng âm

4.14  Mẫu trắng

4.15  Natri hydroxide (NaOH): tinh thể

4.16  Ni tơ lỏng

4.17  Nước cất

4.18  Nước khử ion

...

...

...

4.20  Thuốc nhuộm axit nucleic

4.21  Tris-Base (C₄H₁₁NO₃): tinh thể

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019. Các bộ phận có thể lấy mẫu để giám định ToBRFV gồm hạt, lá và quả.

5.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản và vận chuyển về phòng giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019.

6  Triệu chứng điển hình của bệnh

Lá bị nhiễm TRSV có biểu hiện triệu chứng còi cọc, hình vòng, sọc kè trên lá. Lá có thể bị úa vàng, mép lá quăn lại, lá bị hoại tử. Lá non có các vết đốm không đều trên toàn bộ phiến lá và có các mép bị biến dạng. Ngoài ra, lá còn có các triệu chứng có thể khác nhau như lá lốm đốm, úa vàng, hoa văn sọc kẻ, khảm và vàng gân lá. [2]

...

...

...

Hạt bị nhiễm virus không có biểu hiện triệu chứng.

Thông tin về phân bố, đặc điểm sinh học của virus TRSV tham khảo ở phụ lục A.

Hình 1 - Triệu chứng gây bệnh của TRSV trên cây thuốc lá [1]

Hình 2 - Triệu chứng gây bệnh của TRSV trên cây dưa chuột [1]

7  Giám định virus gây bệnh

7.1  Giám định bằng phương pháp RT-PCR

7.1.1  Tách chiết RNA

...

...

...

Mẫu hạt cần phải được nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu (3.7) hoặc bằng ni tơ lỏng (4.16) trước khi tách chiết RNA. Sử dụng 2,1 - 2,2 g hạt ớt hoặc 1,3 - 1,4 g hạt cà chua cho một lần nghiền mẫu, tương ứng với một lần giám định (một lần lặp lại). Sau đó, sử dụng 0,1 g mẫu đã được nghiền để thực hiện tách chiết RNA theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kít tách chiết RNA thương mại (4.10).

- Đối với mẫu lá, quả:

Một lần giám định (một lần lặp lại), sử dụng 0,05 g mẫu lá hoặc 0,5 g mẫu quả để thực hiện tách chiết RNA theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kít tách chiết RNA thương mại (4.10).

RNA sau khi tách chiết được bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C (3.9).

7.1.2  Khuếch đại gen

RNA thu được sau khi tách chiết tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.3).

Mẫu đối chứng dương (mẫu nhiễm TRSV) (4.12), mẫu đối chứng âm (mẫu không nhiễm TRSV) (4.13) và mẫu trắng (4.14) (nước khử ion (4.18) sử dụng để chuẩn bị phản ứng RT-PCR) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.4) để giám định TRSV.

Thành phần và thể tích cho một phản ứng RT-PCR được thể hiện như sau:

...

...

...

Nồng độ gốc*

Nồng độ trong phản ứng*

Thể tích*

Dung dịch đệm RT-PCR**

2 X

1 X

10 μl

Hỗn hợp enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) và DNA polymerase**

1 U

...

...

...

0,3 μl

Mồi xuôi TRSV-F (4.4)

10 μM

0,25 μM

0,5 μl

Mồi ngược TRSV-R (4.4)

10 μM

0,25 μM

0,5 μl

...

...

...

10 ng/μl

50 ng

5 μl

Nước khử ion (4.18)

-

-

3,7 μl

Tổng thể tích

...

...

...

20 μl

* Nồng độ, thể tích của từng thành phần hóa chất và nồng độ RNA mẫu sử dụng sẽ thay đổi tùy vào bộ kit nhân gen (4.9).

** Thành phần hóa chất trong bộ kit nhân gen (4.9).

Chu trình nhiệt:

50 °C trong 10 phút

Giai đoạn tổng hợp cDNA (phiên mã ngược)

96 °C trong 5 phút

Giai đoạn tiền biến tính

96 °C trong 30 giây

...

...

...

60 °C trong 30 giây

Lặp lại 35 chu kì

72 °C trong 30 giây

72 °C trong 5 phút

Giai đoạn kết thúc kéo dài

7.1.3  Đọc kết quả

Sản phẩm PCR được trộn với đệm nhuộm điện di (4.7), sau đó điện di bằng máy điện di (3.5) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.20) trong dung dịch đệm điện di TAE (B.1) hoặc TBE (B.2) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.2).

...

...

...

+ Mẫu đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 348 bp trên bản gel.

+ Mẫu đối chứng âm và mẫu blank: không xuất hiện vạch trên bản gel

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 348 bp trên bản gel.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện vạch trên bản gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu cho kết quả PCR không rõ ràng.

7.2  Giám định bằng phương pháp real-time RT-PCR

7.2.1  Tách chiết RNA

Thực hiện tách chiết RNA theo điều 7.1.1.

...

...

...

RNA thu được sau khi tách chiết tiến hành phản ứng real-time RT-PCR trong máy real-time PCR (3.6).

Mẫu đối chứng dương (mẫu nhiễm TRSV) (4.12), mẫu đối chứng âm (mẫu không nhiễm TRSV) (4.13) và mẫu trắng (4.14) (nước khử ion (4.18) sử dụng để chuẩn bị phản ứng real-time RT-PCR) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.5) và mẫu dò (4.11) (sử dụng mẫu dò Taqman) để giám định TRSV.

Thành phần và thể tích cho một phản ứng real-time RT-PCR được thể hiện như sau:

Tên hóa chất

Nồng độ gốc*

Nồng độ trong phản ứng*

Thể tích*

Dung dịch đệm cho real-time RT-PCR**

...

...

...

1 X

10 μl

Hỗn hợp enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) và DNA polymerase**

1 U

0,015 U

0,3 μl

Mồi xuôi TRSV-FP (4.5)

10 μM

0,25 μM

...

...

...

Mồi ngược TRSV-RP (4.5)

10 μM

0,25 μM

0,5 μl

Mẫu dò TRSV FAM Probe (4.11)

10 μM

0,1 μM

0,2 μl

RNA mẫu

...

...

...

50 ng

5 μl

Nước khử ion (4.18)

-

-

3,5 μl

Tổng thể tích

...

...

...

* Nồng độ, thể tích của từng thành phần hóa chất và nồng độ RNA mẫu sử dụng sẽ thay đổi tùy vào bộ kit nhân gen (4.9).

**Thành phần hóa chất trong bộ kit nhân gen (4.9).

Chu trình nhiệt:

45 °C trong 10 phút

Giai đoạn tổng hợp cDNA (phiên mã ngược)

95 °C trong 10 phút

Giai đoạn tiền biến tính

95 °C trong 15 giây

Lặp lại 40 chu kì

...

...

...

7.2.3  Đọc kết quả

Kết quả phản ứng real-time RT-PCR được hiển thị trên màn hình máy real-time PCR (3.8).

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Mẫu đối chứng dương: xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu đối chứng âm và mẫu blank: không xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện đường chuẩn khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct = 0.

+ Mẫu kiểm tra có giá trị chu kỳ ngưỡng 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ nhiễm virus. Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện giám định lại để khẳng định kết quả.

...

...

...

Mẫu giám định được kết luận là nhiễm virus đốm vòng thuốc lá (TRSV) khi:

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng RT-PCR (7.1)

Hoặc

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng real-time RT-PCR (7.2).

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

Thông tin về mẫu giám định

Tên loài

Phương pháp giám định

...

...

...

Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Virus đốm vòng thuốc lá

Tên khoa học: Tobacco ringspot virus

Vị trí phân loại:

...

...

...

Họ: Secoviridae

Chi: Nepovirus

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Ả Rập Saudi, Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Iran, Israel, Nhật Bản, Kyrgyzstan, Nepal, Sri Lanka, Trung Quốc; Châu Âu: Ba Lan, Bỉ, Đan Mạch, Đức, Georgia, Hà Lan, Hungary, Hy Lạp, Litva, Nga, Pháp, Serbia, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ, Thụy Sĩ, Ukraine, Vương quốc Anh, Ý; Châu Đại Dương: New Zealand, Papua New Guinea, Úc; Châu Mỹ: Argentina, Brazil, Canada, Chile, Cuba, Dominica, Mexico, Mỹ, Uruguay, Venezuela; Châu Phi: Ai Cập, Công, Malawi, Maroc, Nigeria, Zambia.

A.3  Ký chủ

Ớt (Capsicum annuum), Dưa hấu (Citrullus lanatus), Dưa lê/ Dưa lưới (Cucumis melo), Dưa chuột (Cucumis sativus), Bí ngòi (Cucurbita pepo), Hoa lay ơn lai (Gladiolus hybrids), Đậu tương (Glycine max), Thuốc lá (Nicotiana tabacum), Cà chua (Solanum lycopersicum), Việt quất (Vaccinium sp.).

A.4  Đặc điểm sinh học

TRSV thường xuất hiện ở tất cả các bộ phận của cây ký chủ, bao gồm cả hạt.

...

...

...

TRSV truyền qua hạt giống ở Họ bầu bí và đậu tương nhưng có thể xảy ra ở nhiều vật chủ khác. Đối với đậu tương, tỷ lệ lan truyền hạt giống lên đến 100%. Các loài cỏ dại truyền qua hạt giống, bao gồm cây Dền (Amaranthus hybridus), cây Hoa nở ngày (Gomphrena globosa), cây Cúc bạc (Senecio vulgaris) và cây Bồ công anh (Taraxacum officinale). [7]

Sự lây truyền TRSV bởi động vật chân đốt chủ yếu trên cây đậu tương, vì sự lây lan quan sát được trên đồng ruộng nhanh hơn so với dự kiến. Các véc tơ có thể mang TRSV như rệp, bọ cánh cứng, châu chấu, bọ trĩ, nhện nhện, đặc biệt là loài ong mật châu Âu Apis melifera. [7]

TRSV cũng được lây truyền qua phấn hoa ở cây thuốc lá, dưa chuột, đậu tương, cà chua và việt quất, ở đậu tương, phấn hoa bị nhiễm sẽ làm giảm khả năng thụ tinh. [7]

Trên cây thuốc lá, TRSV tạo ra các đường vòng trên tán lá, lá bị còi cọc, chậm lớn. [4]

Phụ lục B

(Quy định)

Cách pha các dung dịch

B.1  Dung dịch đệm điện di TAE

...

...

...

2 ml

Tris-Base (4.21)

4,84 g

Axit acetic (4.2)

1,15 ml

Nước cất (4.17)

1000 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25 °C). Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.2  Dung dịch đệm điện di TBE

...

...

...

4 ml

Tris-Base (4.21)

10,8 g

Axit boric (4.3)

5,5 g

Nước cất (4.17)

1000 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25 °C). Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.3  Dung dịch 0,5 M EDTA (pH = 8)

...

...

...

18,61 g

Nước cất (4.17)

100 ml

Hoà tan lượng EDTA trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M (B.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.4  Dung dịch 1M NaOH

NaOH (4.15)

4 g

Nước cất (4.17)

100 ml

...

...

...

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Tổ chức giám định

....................................

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------

………., ngày ... tháng ... năm 20…...

...

...

...

KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH SINH VẬT GÂY HẠI

Kính gửi: ........................................................................

1. Tên mẫu:

2. Mã số mẫu:

3. Tình trạng mẫu:

4. Ngày nhận mẫu:

5. Nội dung giám định:

TT

Chỉ tiêu giám định

...

...

...

Kết quả giám định

1

Tobacco ringspot virus (TRSV)

TCVN 12371-2-14:2024

Nhiễm/ không nhiễm

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT

(hoặc người giám định)

(ký, ghi rõ họ và tên)

...

...

...

LÃNH ĐẠO TỔ CHỨC GIÁM ĐỊNH

(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

____________________________________________________________

Ghi chú:

- Kết quả ghi trong phiếu này chỉ có giá trị đối với mẫu giám định tại phòng thí nghiệm.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI, (2021). Tobacco ringspot virus.

[2] IPPC, (2006). ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

...

...

...

[4] PM, E. (2017). 7/2 (2) Tobacco ringspot virus. EPPO Bull, 47 (2), 135-145.

[5] TCVN 12371-1:2019. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoμlasma gây bệnh thực vật, Phần 1: yêu cầu chung.

[6] Yang, W., Zheng, Y., Chen, Z., Zhang, G., & Wu, S. (2007). Detection of Tobacco ringspot virus by RT-Realtime PCR. Acta Phytophylacica Sinica, 34(2), 157-160.

[7] https://gd.eppo.int/taxon/TRSV00