Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10412-1:2014 về Khô dầu - glucosinolat - Phần 1 - sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Số hiệu: TCVN10412-1:2014
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2014

1	Desufloglucoiberin	1,07
2	Desulfoprogoitrin	1,09
3	Desulfoepi-progoitrin	1,09
4	Desulfosinigrin	1,00
5	Desulfoglucoraphanin	1,07
6	Desulfogluconapoleiferin	1,00
7	Desulfoglucoalyssin	1,07
8	Desulfogluconapin	1,11
9	Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin	0,28
10	Desulfoglucobrassicanapin	1,15
11	Desulfoglucotropaeolin	0,95
12	Desulfoglucobrassicin	0,29
13	Desulfogluconasturtiin	0,95
14	Desulfo-4-methoxyglucobrassicin	0,25
15	Desulfoneoglucobrassicin	0,20
16	Các desultoglucosinolate khác	1,00

9.3. Tính hàm lượng glucosinolat tổng số

Hàm lượng glucosinolat tổng số, biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, bằng tổng hàm lượng của từng glucosinolat (với diện tích pic tương ứng lớn hơn 1 % của tổng diện tích các pic).

Nếu chênh lệch giữa kết quả của hàm lượng glucosinolat tổng số sử dụng cả hai nồng độ đáp ứng các yêu cầu về độ lặp lại (xem 10.1), chất chuẩn nội không bị nhiễm bẩn. Trong trường hợp này, lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.

Nếu các yêu cầu về độ lặp lại không được đáp ứng, lặp lại quá trình trên hai phần mẫu thử khác nhau và thực hiện phép thử trắng, (8.5) không dùng dung dịch chuẩn nội. Diện tích chất nhiễm bẩn được loại trừ từ diện tích chất chuẩn nội để đưa ra diện tích đúng của chất chuẩn nội được sử dụng theo 9.1. Lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.

Glucotropaeolin (A.2) có thể được sử dụng như là dung dịch chất chuẩn nội theo 8.2.1.

10. Độ chụm

Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B.

10.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 10 % trung bình cộng của hai kết quả với giá trị tối thiểu 1 μmol/g.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 20 % trung bình cộng của hai kết quả với giá trị tối thiểu 2 μmol/g.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

- phương pháp thử đã sử dụng;

- kết quả thử nghiệm thu được;

- kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải đề cập mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

...

...

...

Hình 1 - Ví dụ về sắc ký đồ điển hình

PHỤ LỤC A

(quy định)

Chuẩn bị thuốc thử

A.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước

A.1.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 5 mmol/l

Hòa tan trong nước 207,7 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc 6 tháng trong tủ lạnh đông ở - 18 °C.

...

...

...

Hòa tan trong nước 831,0 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc 6 tháng trong tủ lạnh đông ở - 18 °C.

A.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng một hoặc một số trong ba phép thử sau:

- phân tích HPLC sử dụng phương pháp quy định trong TCVN 10413-1 (ISO 9167-1);

- phân tích sinigrin bằng HPLC (kỹ thuật cặp ion)

- phân tích sinigrin đã silyl hóa và khử sulfat bằng sắc ký khí.

Đối với từng phép thử, sắc ký đồ chỉ có một pic chính chiếm ít nhất 98 % diện tích tổng các píc.

Xác nhận độ tinh khiết bằng cách định lượng glucose tách ra sau khi thủy phân với myrosinase (thioglucosit glucohydrolase; EC 3.2.3.1). Đo glucose bằng phương pháp enzym sử dụng các bộ thử có bán sẵn trên thị trường. Đưa vào tính toán glucose tự do hiện có. Chất này được xác định tương tự nhưng không bổ sung myrosinase. Nồng độ phân tử của glucose tách ra đạt ít nhất bằng 98 % nồng độ phân tử của dung dịch sinigrin đã kiểm tra.

...

...

...

CHÚ THÍCH 8 Glucotropaeolin thường khó phân tách ra khỏi các glucosinolat tự nhiên có hàm lượng thấp.

A.2.1. Glucotropaeolin, dung dịch 5 mmol/l

Hòa tan trong nước 223,8 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc thời gian 6 tháng trong tủ lạnh đông ở - 18 °C.

A.2.2. Glucotropaeolin, dung dịch 20 mmol/l

Hòa tan trong nước 895,0 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc thời gian 6 tháng trong tủ lạnh đông ở -18 °C.

A.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết theo quy trình quy định trong A.1.3.

...

...

...

Xác nhận lại các hệ số đáp ứng của glucotropaeolin, so sánh với sinigrin, tương ứng với các hệ số đáp ứng được đưa ra trong 9.2.

A.3. Sulfatase

A.3.1. Chuẩn bị cột trao đổi ion

Cắt 7 cm phía trên cổ bình 5 pipet Pasteur (5.9) và nút bông thủy tinh (5.8) vào cổ. Đặt pipet thẳng đứng và thêm vào từng lượng vừa đủ resin trao đổi ion (4.7.1), khi nước chảy hết thì thu lấy 500 μl thể tích resin.

Rót 1 ml dung dịch imidazole format (4.4) vào từng pipet và rửa hai lần, mỗi lần 1 ml nước.

A.3.2. Tinh sạch

Cân 25 mg sulfatase loại Helix pomatia typ H1 (4.8), chính xác đến 0,1 mg. Hòa tan trong 2,5 ml nước và chuyển 500 μl dung dịch này vào từng cột đã chuẩn bị trong A.3.1. Rửa từng cột với 1.5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Sau đó thêm 1,5 ml dung dịch natri axetat 0,2 mol/l (4.3) và thu dịch rửa giải từ năm cột vào ống nghiệm.

Cô đặc dịch rửa giải bằng cách lọc, sử dụng bộ Iọc nhúng chìm7) cho đến khi thu được khoảng 100 μl dịch lỏng (không cho sulfatase có khối lượng phân tử cao hơn 5 000 đi qua). Thêm 2,5 ml nước và cô đặc thêm một lần nữa bằng cách lọc cho đến khi còn lại khoảng 100 μl dịch lỏng. Pha loãng đến 2,5 ml bằng nước và bảo quản sulfatase đã tinh sạch trong tủ lạnh  ở -18 °C (với một lượng nhỏ cho phép rã đông một lượng cần thiết để sử dụng ngay).

A.3.3. Kiểm tra hoạt độ sulfatase

...

...

...

Chuẩn bị ba dung dịch như sau:

a) chuyển 1 ml axit axetic vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch;

b) chuyển 1 ml etylen diamin vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch;

c) trộn 73 ml dung dịch a) với 40 ml dung dịch b) và sử dụng dung dịch a) hoặc dung dịch b) để chỉnh hỗn hợp đến pH 5,8 là thích hợp.

Rót 3 ml dung dịch sinigrin 5 mmol/l (A.1.1) vào bình định mức một vạch dung tích 100 ml và pha loãng bằng dung dịch c) đến vạch.

A.3.3.2. Kiểm tra hoạt độ

Dùng pipet chuyển 2 ml dung dịch sinigrin đã bổ sung đệm (A.3.3.1) vào cuvet đo và cuvet so sánh của máy đo phổ hai chùm tia (5.3), được chỉnh đến bước sóng 228 nm với nhiệt độ cuvet là 30 °C. Ở thời gian t = 0, thêm 50 μl sulfatase đã tinh sạch (A.3.2) vào cuvet đo và bật máy ghi ngay. Dừng máy ghi khi không có sự chênh lệch độ hấp thụ (A_e). Dựng đường tiếp tuyến với điểm t = 0 và đo gradient  DA/Dt.

Đơn vị hoạt độ của sulfatase tương ứng với nồng độ 1μmol/min của sinigrin desulfat tạo thành ở 30 °C và pH 5,8.

Hoạt độ của dung dịch đã kiểm tra, được biểu thị bằng đơn vị hoạt độ trên mililit dung dịch sulfatase, theo công thức:

...

...

...

Trong đó:

DA/Dt  là gradient của đường tiếp tuyến tại điểm t = 0, tính bằng đơn vị độ hấp thụ trên phút;

V  là thể tích môi trường phản ứng (ví dụ: 2,05 x 10^-^3 lít), tính bằng lít (I);

De (khoảng 1 500 l.mol^-1.cm^-^1) là chênh lệch giữa hệ số tắt phân tử của sinigrin và desulfosinigrin ở 228 nm; nghĩa là:

Trong đó:

A_e là chênh lệch giữa độ hấp thụ của sinigrin desulfat ở điểm cân bằng và độ hấp thụ ở thời điểm t = 0;

l là chiều dài đường quang thích hợp, tính bằng centimet (ví dụ 1 cm);

c là nồng độ của sinigrin khử sulfat ở điểm cân bằng, tính bằng mol trên lít (mol/l).

...

...

...

mol/l

Trong đó 0,95 là hiệu suất ở điểm cân bằng của sinigrin khử sulfat.

Ngoài ra, hoạt độ của sulfatase có thể được tính theo công thức sau:

A.3.4. Pha loãng

Dùng pipet chuyển 1 ml sulfatase đã tinh sạch (A.3.2) vào bình định mức một vạch dung tích 10 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

Chia dung dịch thành các lượng nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh đông ở - 18 °C.

PHỤ LỤC B

...

...

...

Kết quả phép thử nghiệm liên phòng

Phép thử nghiệm liên phòng thực hiện năm 1992 bởi tổ chức Tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO) đưa ra các kết quả thống kê (được đánh giá theo ISO 57258)) đưa ra trong Bảng B.1. Mười một phòng thử nghiệm tham gia và mỗi phòng thực hiện hai phép xác định trên cùng một mẫu thử. Không có các ngoại lệ.

Bảng B.1 - Xác định hàm lượng glucosinolat trong hạt có dầu

Mẫu

A

A

A

A

A

...

...

...

B

B

B

B

C

C

C

C

C

...

...

...

PRO

GNA

4OH

GBN

TOT

PRO

GNA

4OH

GBN

...

...

...

PRO

GNA

4OH

GBN

Giá trị trung bình (μmol/g chất khô)

13,4

7,8

2,7

0,9

...

...

...

47,5

27,4

12,3

2,2

2,6

5,9

2,6

1,4

0,4

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r

0,41

0,31

0,10

0,08

0,03

1,39

1,18

0,83

...

...

...

0,16

0,21

0,12

0,07

0,03

0,02

Hệ số biến thiên lặp lại (%)

3,09

3,94

...

...

...

9,27

3,66

2,92

4,31

6,78

9,22

6,21

3,61

4,56

...

...

...

8,88

6,75

Độ lặp lại, s_r x 2,83

1,2

0,9

0,3

0,2

0,1

3,9

...

...

...

2,3

0,6

0,5

0,6

0,3

0,2

0,1

0,1

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R

...

...

...

0,73

0,33

0,28

0,15

3,71

2,48

1,80

1,19

0,47

...

...

...

0,29

0,25

0,15

0,18

Hệ số biến thiên tái lập (%)

8,33

9,38

12,27

31,85

...

...

...

7,81

9,06

14,67

53,31

17,83

14,44

11,37

16,02

42,05

...

...

...

Độ tái lập, s_R x 2,83

3,1

2,1

0,9

0,8

0,4

10,4

6,9

5,1

...

...

...

1,3

2,4

0,8

0,7

0,4

0,5

TOT: glucosinolat tổng số

PRO: Progoitrin

GNA: Gluconapin

...

...

...

GBN: Glucobrassicanapin

1) Hệ thống Norganic Millipore là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

2) DEAE Sepharose và Sephadex là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

3) Sulfatase S-9626 (từ Sigma Chemical) với hoạt tính 16 600 đơn vị/g là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

4) Các sản phẩm được đề cập đến là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

5) Các mẫu đối chứng desulfoglucosinolat từ hạt cải dầu có thể nhận từ Community Reference Bureau (Brussels)

6) TCVN 9609:2013 (ISO 5 500:1986) Khô dầu - Lấy mẫu

7) Miltipore PLGC 11k25 là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

...

...

...