- Cân phân tích (d:0,001)
|
- Cân kỹ thuật (d:0,1)
|
- Máy đo pH
|
- Máy đếm khuẩn lạc
|
- Micropipet: 50-20àl; 200-100àl; 500-500àl
|
3.1.1.4. Máy cất nước 2 lần.
3.1.1.5. Dụng cụ thuỷ tinh
- Bình tam giác: 250 ml
- Cốc thuỷ tinh: 100,250, 500,1000 ml
- Cốc định lượng: 50, 100,500 ml
- Petri: ứ90mm
- ống nghiệm: 18x180mm
3.1.2.
Hoá chất (Đức hoặc Pháp)
- TZC (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Cao nấm men
- Cao thịt
- Pepton
- Sacharoza
- Glucoza
- Tinh bột tan
- MgSO4
- KNO3
- NaNO3
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- NaCl
- FeSO4
- K2HPO4
- KH2PO4
-
HCl
- NaOH
3.1.3. Chuẩn
bị
3.1.3.1.
Khử trùng dụng cụ
Các
dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy, nhiễm vi
sinh vật và xác định hoạt tính của vi sinh vật
phải được khử trùng bằng cách sấy ở
nhiệt độ 1700C - 1750C không ít hơn 1
giờ trong tủ sấy hoặc giữ ở áp suất
1,0 Atmotphe (tương đương 1210C) không ít hơn
30 phút trong nồi hấp khử trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn héo xanh (R. solanacearum):
-
Môi trường đặc hiệu: Môi trường TZC-aga
Thành
phần môi trường (gam/lít)
Pepton:
10,00
Casein hydrolysate:
1,00
Glucose:
5,00
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,05 *
Thạch:
15,00
Nước cất:
1 lít
(* Bổ sung 1ml dịch
0,5 % TZC vô trùng trong 100 ml môi trường đã khử trùng
trước khi đổ ra đĩa petri).
- Môi trường nuôi cấy tăng sinh khối:
Môi trường SPA
Thành phần môi trường (gam/lít)
Pepton:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sacharoza:
20,00
K2H PO4:
0,50
MgSO4.7H2O:
0,25
Thạch:
15,00
Nước cất:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
pH: 7,2-7,4
(pH môi trường được điều
chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
b. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đối
kháng:
Trong trường hợp đã biết rõ loài vi
sinh vật đối kháng cần xác định hoạt
tính, môi trường được sử dụng để
nuôi cấy là môi trường đặc hiệu hoặc
môi trường có thành phần thích hợp cho sự sinh
trưởng phát triển của loài vi sinh vật đã biết.
Trường hợp chưa biết chính xác vi
sinh vật cần xác định hoạt tính, lựa chọn
một trong các môi trường nuôi cấy như sau:
- Môi trường cho vi khuẩn: Môi trường
Thạch-Thịt-Pepton
Thành phần môi trường (gam/lít)
Pepton:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cao thịt:
3,0
Thạch:
15,0
Nước cất:
1 lít
pH: 6,5-7,5
(pH môi trường được điều
chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thành phần môi trường (gam/lít)
NaNO3 :
3,0
Sacharoza:
30,0
KH2PO4 :
1,0
MgSO4.7H2O:
0,5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15,0
Nước cất:
1 lít
pH: 6,0-6,5
(pH môi trường được điều
chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
- Môi trường cho xạ khuẩn: Môi trường
Gauze
Thành phần môi trường (gam/lít)
Tinh bột tan:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
KNO3:
1,00
KH2PO4 :
0,50
MgSO4.7H2O:
0,50
NaCl:
0,50
FeSO4:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thạch:
15,00
Nước cất:
1 lít
pH: 7,0
(pH môi trường được điều
chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
3.1.3.3. Huyền phù vi sinh vật:
a. Dịch vi khuẩn R.
solanacearum:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Pha loãng mẫu: Dùng micropipet vô trùng lấy ra 10ml
dịch vi khuẩn R.solanacearum đưa
vào bình thuỷ tinh chứa 90ml dung dịch muối sinh lý vô
trùng (0,85% NaCl trong nước cất), trộn đều bằng
thiết bị trộn cơ học. Dùng micropipet vô trùng tiếp
tục lấy 1ml huyền phù cho vào ống nghiệm chứa
9 ml nước muối sinh lý vô trùng, trộn đều bằng
thiết bị lắc cơ học. Quá trình này được
lặp lại cho đến khi được huyền phù
vi khuẩn có mật độ đạt 106-107 CFU/ml.
b. Dịch vi sinh vật đối kháng:
Vi sinh vật đối kháng được nuôi
cấy trong môi trường (mục 3.1.3.2.b) ở điều kiện nhiệt độ,
pH và thời gian thích hợp với từng loài sao cho mật
độ sau nuôi cấy cần đạt 109-1010 CFU/ml.
3.1.4. Tiến
hành
3.1.4.1. Cấy mẫu vi khuẩn R. solanacearum
Dùng micropipet vô trùng hút 0,05ml từ huyền phù vi
khuẩn R. solanacearum (mục
3.1.3.3.a) cấy vào đĩa petri chứa 20ml môi trường
SPA-aga đã chuẩn bị sẵn.
Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch vi khuẩn
tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô
trùng gạt đều cho đến khi dịch vi khuẩn
thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không để
dịch vi khuẩn dính vào thành đĩa petri.
Đợi 20-30 phút cho bề mặt thạch
khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 1cm
khoan lỗ thạch ở phần tâm của đĩa
petri, loại bỏ phần thạch vừa khoan. Lưu ý
dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn tách và gạt nhẹ
nhàng thỏi thạch, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề
mặt thạch xung quanh lỗ đục.
Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dùng pipet vô trùng hút 0,05ml dịch vi sinh vật
đối kháng đưa vào lỗ khoan đã chuẩn bị
ở trên (mục 3.1.4.1), giữ ở điều kiện
nhiệt độ từ 300C đến
370C và thời gian từ 48 đến
72 giờ tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật cần xác
định hoạt tính. Lưu ý trong quá trình chuyển dịch
mẫu cần giữ cho các đĩa petri trên mặt
phẳng, không để dịch vi sinh vật đối
kháng tràn trên bề mặt đĩa thạch.
3.1.5. Đọc kết quả
Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật
đối kháng được thể hiện thông qua vòng
vô khuẩn (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ khoan chứa
dịch vi sinh vật đối kháng) được tính bằng
trung bình cộng giá trị kích thước vòng vô khuẩn của
3 lần lặp lại biểu thị bằng công thức:
Kích thước vòng vô khuẩn
(mm) = D-d
Trong đó: D là đường kính
vòng vô khuẩn (mm)
d là đường kính lỗ thạch (mm)
3.2. Xác định hoạt
tính đối kháng trên cây trồng
3.2.1. Dụng cụ, thiết
bị, vật tư
- Dụng cụ và thiết bị: Như mục
3.1.1
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.2.2. Chuẩn bị
3.2.2.1. Đất trồng, hạt giống, phân
bón
Thử nghiệm tiến hành trên đất khử
trùng tơi xốp có hàm lượng hữu cơ không nhỏ
hơn 1,5% và bảo đảm có độ pH trong khoảng
6,0 đến 6,5. Đất trồng được đựng
trong các chậu vại hoặc khay với lượng
đất phù hợp cho từng đối tượng cây
chủ.
Hạt hoặc củ giống sử dụng là
hạt hoặc củ giống sạch, mẫn cảm với
bệnh héo xanh vi khuẩn và được khử trùng bề
mặt bằng dung dịch 4% H2O2.
Phân bón được sử dụng với liều
lượng và chủng loại theo qui trình chung đối
với từng loại cây trồng.
3.2.2.2. Dịch vi sinh vật
a. Dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh (R. solanacearum)
Vi khuẩn héo xanh (R. solanacearum) được
nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa đặc
hiệu (môi trường TZC-aga). Chọn những khuẩn
lạc có độc tính cao (như mục 3.1.3.3), cấy truyền
trên môi trường thạch nghiêng SPA và nuôi ở nhiệt
độ 28-300C.
Sau 48 giờ, chuyển toàn bộ sinh khối từ
ống giống vào 5 ml nước cất vô trùng. Trộn
đều hỗn hợp và pha loãng trong nước cất
vô trùng để đạt được mật độ
6 x 108CFU/ml.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Vi sinh vật đối kháng được chuẩn
bị theo mục 3.1.3.3.b
3.2.3. Tiến hành
3.2.3.1. Bố trí thử nghiệm
Thử
nghiệm được tiến hành với 2 công thức:
Đối chứng (nhiễm vi khuẩn R.solanacearum) và
thí nghiệm (nhiễm hỗn hợp vi sinh vật đối
kháng với vi khuẩn R. solanacearum). Mỗi công thức
được lặp lại không ít hơn 3 lần với
tổng số cây ít nhất là 50 cây.
Thí nghiệm
được thực hiện trong buồng sinh trưởng,
bảo đảm hạn chế tối đa ảnh
hưởng của các yếu tố phi thí nghiệm.
3.2.3.2. Tiến
hành thử nghiệm
Vi sinh vật
đối kháng được nhiễm vào đất
trước khi gieo trồng với mật độ vi sinh
vật 108 CFU/g đối với công thức
thí nghiệm.
Ngâm hạt
hoặc củ giống trong dịch vi khuẩn gây bệnh
héo xanh (R. solanacearum) đã được chuẩn bị
trong thời gian 30 phút.
Gieo trồng
hạt hoặc củ đã nhiễm vi khuẩn gây bệnh
héo xanh (R. solanacearum) vào đất vô trùng đối với
công thức đối chứng và đất đã
được nhiễm vi khuẩn đối kháng đối
với công thức thí nghiệm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Trong thời
gian 30 ngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi
nhận hàng ngày tình trạng sức khoẻ của cây trồng
(không có triệu chứng bệnh hoặc có triệu chứng
bệnh từ mức có một lá héo rũ đến toàn
cây bị héo rũ).
3.2.4. Tính
toán kết quả
% cây bị
bệnh được tính theo công thức:
Tỷ lệ cây bị bệnh
(%) =
Trung bình cộng số cây bị
bệnh
x 100
Trung bình cộng số cây
điều tra
(Số
cây bị bệnh được tính là tất cả các cây
có ít nhất
một lá bị héo rũ)
So sánh tỷ
lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm với
công thức đối chứng và đánh giá hoạt tính
đối kháng của vi sinh vật theo các cấp độ
sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tỷ lệ cây bệnh (%)
Mức độ hoạt
tính đối kháng
1
10-30
Hoạt tính cao
2
31-50
Hoạt tính khá
3
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hoạt tính trung bình
4
71-90
Hoạt tính yếu
5
>90
Không có hoạt tính