TIÊU CHUẨN
NGÀNH
10 TCN
819:2006
QUI
TRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS
Procedure for
isolation and identification of Streptococcus suis
1.
Phạm vi áp dụng
Qui trình này áp
dụng cho công tác xét nghiệm trong phong thí nghiệm.
2.
Khái niệm
- Streptococcus suis
là nguyên nhân của nhiều quá trình bệnh lý như viêm màng não, nhiễm trùng huyết
trong thời kỳ sơ sinh, viêm cuống phổi, viêm khớp và rối loạn sinh sản
(Tarradas C. và CS., 1994)
- Nhiều chủng S.
suis có khả năng gây bệnh cho lợn. Hai chủng huyết thanh quan trong
là S. suis typ 1 (nhóm S) và typ 2 (nhóm R),
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- S. suis type 2
(R) gây bệnh cho lợn từ sau cai sữa cho đến 6 tháng tuổi
- Người làm công tác
thú y, tiếp xúc thường xuyên với lợn hoặc thịt lợn tưoi sống có thể
bị nhiễm S. suis type 2 và mắc bệnh viêm màng não, viêm nội tâm
mạc và nhiễm trùng huyết.
3.
Nguyên liệu và dụng cụ
3.1 máy móc
- Tủ ấm 37oC
- Tủ sấy
- Buồng cấy
- Kính hiển vi có vật
kính dầu, vật kính khô hoặc phản pha
- Nồi hấp ướt
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng
3.2 Dụng cụ
- Panh, kéo nhỏ
- Đèn cốn
- Que cấy
- Đĩa petri để đổ môi
trường
- Lam kính
- Kính lúp
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
3.3 Môi trường – hoá
chất – Nguyên liệu
- Môi trường chọn
lọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu có bổ xung polymicin B và
crystal violet)
- Môi trường thạch
máu cừu/bò
- Môi trường đường
inulin, mannitol, raffinose, trehalose,
- Môi trường
Voges- Proskauer (VP)
- Môi trường nước
thịt có 6,5% Nacl.
- Huyết thanh chuẩn
streptococcus nhóm D (R,S)

1. Lấy mẫu bệnh
phẩm
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2. Soi kính hiển vi
- Mủ và khuẩn lạc
sau khi phân lập được dùng để phết kính nhuộm gram
- Vi khuẩn
streptococcus suis bắt màu gram (+) có dạng hình cầu hơi dài hoặc hình
quả trứng thường đứng đơn lẻ, xếp đôi, ít khi chuỗi ngắn.
3. Phân lập
- Xử lý vô trùng
phía ngoài (đối với các bệnh phẩm là tổ chức) bằng đốt nóng cán
panh rồi áp vào bề mặt ngoài của tổ chức. Tổ chức ở phía trong
được dùng cho phân lập vi khuẩn.
- Bệnh phẩm được
cấy lên các loại môi trường thạch máu (bò, ngựa, cừu) và môi trường
chọn lọc (chuẩn bị môi trường xem phụ lục), nuôi cấy ở 37oC,
trong 24 h
- Khuẩn lạc S. suis
mọc sau thời gian nuôi cấy có dạng nhỏ (khoảng 1-2mm) tròn trơn bóng
láng hoặc nhẵn, thường gây dung huyết alfa hoặc không dung huyêt.
- Các khuẩn lác nghi
S.suis cần phải được giám định
4.
Giám định vi khuẩn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hoặc không, dựa
vào một số tính chất cơ bản sau của streptococcus suis (bảng 1)
để giám định:
(Các phương pháp
để kiểm tra các tính chất sinh hoá trên được mô tả trong phần phụ
lục)
Bảng 1: Một số tính chất
cơ bản của Streptococcus suis dùng cho giám định
Chủng streptococcus
Nhóm huyết thanh
Tính chất dung
huyết
H ình thái khuẩn lạc
Voges- Proskauer
Thuỷ phân aesculin
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Lactose
Mannitol
Raffinose
Trehalose
Mọc trên 6,5% NaCl
S. suis type 1
D(S)
α, β, KDH
nhỏ, tròn trơn
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
-
+
-
-
-
+
-
S. suis type 2
D(R)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
nhỏ, tròn trơn
-
+
(+)
-
-
(+)
+
-
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.
Định typ huyết thanh
- Vi khuẩn sau giám
định cần phải được kiểm tra tính chất kháng nguyên theo phân nhóm
Lancefield bằng kit thương mại Latex Agglutination test cho S. suis
(Wellcome Diagnostics; Difco laboratories; Scott Laboratories và Diagnostic
Products Corporation).
6.
Tài liệu tham khảo
Quinn P.L. và Carter
G.R. 1994. Veterinary clinical microbiology. USA
Swine disease. 1994, USA.
Cẩm nang chẩn đoán
tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. 2002, Viện thú y quốc gia
– JICA.
Sydney M. F. and
Ellen J. B. 1986. Bailey Diagnostic and Scott’s Microbiology. Ed 7th.
The C. V. Moshy Company, Missouri, USA.
Richard F. 2002. What
Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes. Clinical
Microbiology Reviews, 15; 4, p. 613-630.
Tarradas C., Arenas
A., Maldonado A., Luque I., Miranda A. and Perea A. 1994. identification of Streptococcus
suis Isolated from Swine: Proposal for Biochemical Parameters. Journal
of Clinical Microbiology, 32; 2 p. 578-580.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Gottschalk M.,
Higgins R. ans Boudreau M. 1993. Use of polyvalent coagglutination reagents for
serotyping of streptococcus suis. Journal of Clinical Microbiology. 31;
8, p. 2192-2194.
Florence B. H., Roland C.,
Annie L., Marcelo G., Jean-Yves C. and Marylene K. 2001. The Canadian
journal of veterinary research. 65, p. 196-200.
Gottschalk M.,
Lacouture S. and Odierno L. 1999. Immunomagnetic isolation of streptococcus serotypes
2 and from swine tonsils. Journal of clinical microbiology. 37; 9, p. 2877-2881
KT. BỘ
TRƯỞNG
THỨ
TRƯỞNG
Bùi
Bá Bổng
PHỤ
LỤC
1. Chuẩn bị thạch
máu
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Thạch máu cơ
bản/ Blood agar base
- Máu cừu/bò sạch
bệnh
- Nước cất
Chuẩn bị theo
hướng dẫn của nhà sản xuất
- Thạch máu cơ bản
được hoà với nước cất theo tỉ lệ rồi đun cho tan hết, sau đó hấp ở
121oC 15 phút. Sau khi hấp để nguội đến khoảng 37oC
thi cho thêm 5-7% máu cừu hoặc bò, lắc nhẹ cho đều rồi đổ ra đĩa
Petri.
2. Chuẩn bị môi
trường chọn lọc
Hiện nay có rât
nhiêu loại môi trường dùng cho phân lập vk Streptococcus tuy nhiên những
loại môi trường sau thường hay được dùng.
a) Edwards modified
medium
Nguyên liệu:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Máu cừu/bò
- Colistin
- Oxonlinic acid
- Nước cất
Chuẩn bi
- sau khi chuẩn theo
hướng dẫn của nhà sản xuất có thể bổ xung colistin 5 mg/L and
oxonlinic acid 2,5 mg/L and 5% máu cừu/bò để làm tăng khả năng mọc của
vi khuẩn.
Vì trong môi trường
Edward có chứa aesculin nên môi trường này có thể dùng để kiểm tra
tính chât thuỷ phân aesculin của vi khuân có thể nhận biết nếu khuẩn
lạc và môi trường có màu đen (hay dương tính thuỷ phân aesculin)
b) Môi trường thạch
máu được bổ xung polymyxin B và Crystal violet
- Thạch máu cơ
bản/ Blood agar base
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nước cất
- polymyxin B
- Crystal violet
Chuẩn bị
- Môi trường thạch
máu sau chuẩn bi theo hướng dẫn của nhà sản xuất như đă nói ở phần
chuẩn bị thạch máu được bổ xung thêm polymyxin B 10 mg/L và Crystal
violet 1mg/L ngay sau khi cho máu vào môi trường.
3. Phương pháp kiểm
tra khả năng sản sinh acetoin trong môi trường VP
Các môi trường và
hoá chất cần có bao gồm:
a) Môi trường VP
thương phẩm, có chứa peptoné, glucose và buffer
Chuẩn bị như sau:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Glucose 5g
Dipotasium phosphate 5g
Nước cất 1000ml
b) Thuốc thử A
Alpha naphthol (Sigma
Chemical Co.) 5g
Ethyl alcohol (thuần
khiết) 100ml
Hoà tan Alpha
naphthol trong một lượng nhỏ Ethyl alcohol rồi đổ thêm cho đủ 100 ml
trong bình thuỷ tinh tam giác. Giữ trong lọ nâu ở nhiệt độ 4oC
c) Thuốc thử B
Potassium hydroxide
(KOH) 40g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- KOH phải được pha
trong bình thuỷ tinh đặt trong nước lạnh để tránh sinh nhiệt. Khi cân
KOH phải cân thật nhanh vì KOH dễ hút ẩm và là chất ăn da khi bị ẩm,
sau đó cho vào bình thuỷ tinh rồi cho một lượng khoảng 90ml nước cất.
Sau khi lắc cho tan thì cho thêm 10ml cho đủ lượng. Chất thử này được
giữ trong bình nhưa ở nhiệt độ 4oC.
d) Phương pháp kiểm
tra:
- Sau khi nuôi cấy
vi khuẩn phân lập được trong môi trường VP ít nhất 48 giờ ở nhiệt độ
37oC lấy 2,5 ml canh trùng cho vào 1 ống nghiệm nhỏ vô trùng.
Sau đó cho 0,6 ml (6 giọt) thuốc thử A rồi 0,2 ml (2 giọt) thuốc thử B.
Sau khi cho các thuốc thử , lắc nhẹ ống nghiệm rồi để 15 phút đem đọc
kết quả:
- Nếu môi trường
có màu hồng là phản ứng dương tính, màu vàng hoặc không màu là âm
tính.
4. Phương pháp kiêm
tra khả năng thuỷ phân aesculin
- Có thể dùng môi
trường Edward để kiểm tra tính chất này như đă nói ở phần chuẩn bị
môi trường Edward.
- Hoặc có thể
dùng môi trường lỏng có chứa aesculin được chuẩn bị như sau để kiẻm
tra
Aesculin 1g
Peptone water 1000ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sau khi cho các
thành phần vào với nhau, lắc cho tan rồi hấp ở 115oC trong
10 phút. Giữ ở nhiệt độ 4oC. Nuôi cấy trong môi trường này
ở 37oC và theo dõi trong 7 ngày nếu môi trường chuyển từ
màu nâu sậm sang màu đen là dương tính.
5. Phương pháp kiểm
tra khả năng lên men đường (inulin, lactose, mannitol, raffinose, trehalose).
a) Chuẩn bị môi
trường
Peptone water 100ml
Chỉ thị màu
andrade 1ml
Sau khi cho các
thành phần vào với nhau, lắc cho đều rồi chia vào các ống nghiệm,
mỗi ống 4 ml.
b) Chỉ thị mau
andrade
Fucsin acid 0,5g
Nước cất 100ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nghiền fucsin
trong cối sứ nhỏ mịn rồi hoà vào nước cất cho tan hết. Cho vào từ từ
dung dịch NaOH-1N, vừa cho vừa lắc đến khi nào mầu từ đỏ tươi chuyển
thành đỏ nâu, rồi đến khi vàng úa, vàng thẫm thì thôi (lượng NaOH
nhỏ vào thường từ 12-17 ml, trung bình 16 ml là vừa). Để lắng 1-2 giờ
rồi lọc qua giấy lọc. Hấp ướt 120oC trong 15 phút.
c) Dung dịch đường
Trehalose 10g
Nước cất 100ml
Hoà tan Trehalose (inulin,
lactose, mannitol, raffinose) trong nước cất rồi hấp ở 110oC
trong vòng 20 - 30 phút. Dung dịch đường được giữ ở nhiệt độ 4oC.
d) Phương pháp kiểm
tra:
- Mỗi ống môi
trường peptone có chỉ thị màu andrade (4ml) được cho 0,3 ml dung dịch
đường. Cấy giống vi khuẩn phân lập được vào môi trường rồi để tủ ấm
37oC sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả.
- Nêu môi trường
không thay đổi màu. màu vẫn vàng tức là vk không sinh acid, phản ứng
âm tính.
- Nếu môi trường
chuyển từ màu vàng sang đỏ tức là vi khuẩn sinh acid, phản ứng dương
tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
a) Chuẩn bị môi
trường
Nước Peptone 100ml
NaCl 6,5g
- Cho các thành
phần vào nhau rồi lắc cho tan, chia vào các ống (mỗi ống 5ml) sau đó
hấp ướt ở 110oC trong vòng 20 phút. Cất ở 4oC.
b) Phương pháp kiểm
tra
- Cây vi khuẩn vào
ống môi trường để ở 37oC sau 24 giờ đem ria cấy lại trên môi
trường chọn lọc nếu có vi khuẩn mọc trên môi trường chọn lọc có
nghĩa là vi khuẩn đã sống được trong môi trường có 6,5% NaCl. Ngược
lại vi khuẩn không có khả năng mọc trong môi trường có 6,5% NaCl .