Primer
1
|
5'-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3'
(tiến)
|
Primer
2
|
5'-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3'
(lùi)
|
Chu trình nhân gien
1 vòng
94°C -
2 phút
37°C -
1 phút
35
vòng
94°C -
1 phút
55°C -
1 phút
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
72°C - 3 phút
1 vòng
72°C
for 7 phút
Giữ ở 4oC đến khi
chạy điện di
Chạy điện di sản phẩm PCR
- Pha thạch Agar 1% bằng dung dịch đệm TAE,
đun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược)
- Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điện
di có đệm TAE
- Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch
loading với tỷ lệ 1/10 và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch Agar (10 µl/mẫu)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
c. Đọc kết quả:
- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính
có vạch với kích cỡ 446 bp
- Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không
có vạch.
5.3.2. Phát hiện
kháng thể:
Sử dụng phương
pháp trung hoà (SN – Serum Nertralization) để phát hiện kháng thể:
Phương pháp này được thực hiện trên trứng vịt có phôi, hoặc trên tế
bào DEF
Mẫu: là huyết
thanh vịt nghi mắc bệnh.
5.3.2.1. Trên trứng
vịt có phôi:
10-14 ngày tuổi.
- Chuẩn bị:
+ Xử lý mẫu huyết
thanh ở 56oC /30p.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ Pha loãng virus
DTV liều 100 EID50.
- Tiến hành:
+ Trộn virus DTV và
huyết thanh kiểm tra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1
+ Ủ hỗn hợp kháng
nguyên – kháng thể ở tủ ấm 37oC/1h .
+ Tiêm hỗn hợp trên
vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.
+ Trứng được ấp
tiếp ở 37oC trong 14 ngày.
+ Soi trứng. Loại
bỏ những phôi chết trước 24h.
- Đánh giá kết
quả:
+ Phôi chết xảy ra
trong 4-10 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.3.2.2. Trên tế
bào xơ phôi vịt DEF:
- Chuẩn bị:
+ Làm và pha loãng
tế bào DEF với số lượng cần thiết (4x105 tế bào/ml).
+ Xử lý mẫu huyết
thanh ở 56oC /30p.
+ Pha loãng virus
DTV chuẩn liều 100 TCID50(50% Tissue culture infective dose).
- Tiến hành: Trên
đĩa nuôi cấy 96 lỗ.
+ Cho môi trường
nuôi cấy MEM: 50µl/lỗ vào các lỗ của đĩa.
+ Cho mẫu huyết
thanh kiểm tra: 50µl vào lỗ đầu tiên, cột 1.
+ Pha loãng mẫu
huyết thanh theo cơ số 2 (1/2, 1/4,...) từ cột 1-12.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ Ủ đĩa nuôi cấy ở
tủ ấm CO2 ở 37oC/1h .
+ Đổ bỏ hỗn hợp
trên, cho môi trường MEM (không bổ sung FCS) 100µl/lỗ.
+ Ủ tiếp đĩa nuôi
cấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC trong 5-7 ngày.
- Đánh giá kết
quả:
+ Kiểm tra bệnh lý
tế bào (CPE) trong 3-7 ngày. Tế bào có biểu hiện to tròn và tụ lại
từng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào bị hoại tử.
+ Tính toán chỉ
số trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed và
Muench.
6.
Kết luận:
- Nếu kết quả phân
lập và giám định (bằng phương pháp trung hòa VN) dương tính với kháng
huyết thanh chuẩn, kết luận có virus Dịch tả vịt.
- Nếu kết quả PCR
dương tính, kết luận dương tính virus Dịch tả vịt.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Nếu kết quả phân lập âm tính, PCR âm
tính, kết luận âm tính virus Dịch tả vịt.
7. Tài liệu tham khảo
1. Manual of standards for diagnosis tests
and vaccines (OIE).
2. Manual of standards for diagnosis tests (Thailand).
PHỤ
LỤC
1. Công thức pha môi trường:
• Dung dịch PBSx10:
Thành phần:
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
KCl
2,0gr
Na2HPO4 11,5gr
KH2PO4 2,0gr
Pha loãng với
1000ml nước cất, điều chỉnh pH = 7,2.
Hấp tiệt trùng,
bảo quản ở 4oC.
• 7% NaHCO3:
Thành phần:
NaHCO3 7gr
Nước cất 100ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
• 3% L-glutamine:
Thành phần:
L-glutamine 3
gr
Nước
cất 100ml
Lọc vô
trùng, bảo quản ở -20oC. Pha loãng virus VGV chuẩn liều 100
TCID50.
• TPB – Tryptose
Photphat Broth:
• Thành phần:
Tryptose Photphat 29,5gr
Nước cất
1000ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
• Trypsine 2,5% (10x):
Thành phần:
Trypsine 2,5gr
PBS 100ml
Lắc qua
đêm ở 4oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20oC.
• Môi trường
nuôi cấy tế bào MEM:
Thành
phần:
Eagle’s
minimum essential medium (MEM) 430 ml
Tryptose Photphat
Broth (TPB) 50 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
7% NaHCO3
5 ml
Kháng sinh (Peni. +
Strep.) 5 ml
Fetal calf serum
(FCS) 5 ml
2. Phương pháp làm
tế bào Xơ phôi vịt
Sử dụng phôi vịt 9
-10 ngày tuổi.
1 - Mổ trứng, lấy
phôi vịt.
2 - Rửa phôi trong
dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.
3 - Cắt bỏ đầu,
chân, cánh và các cơ quan phủ tạng, thu hoạch gan phôi.
4 - Rửa phôi 1-2
lần trong dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 - Tách tế bào
bằng dung dịch Trypsine ấm 0,25% và lắc nhẹ 250v/p trong 15 phút.
7 - Thu hoạch tế
bào đã tách cho vào môi trường MEM + 10% huyết thanh FCS, bảo quản
trong phích đá.
8 - Nhắc lại bước
6-7.
9 - Ly tâm huyễn
dịch tế bào 1500v/p, ở 4oC trong 5 phút.
10 - Rửa 1 lần với
môi trường nuôi cấy.
11 - Đếm và pha
loãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FCS), lượng tế bào
cần thiết tối thiểu 4x105 tế bào/ml.
4. Công thức tính
chỉ số trung hoà NI của Reed and Muench.
4.1. Phương pháp
trung hoà virus (VN):
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Virus
pha loãng (log10)
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
NI
Hthanh
(-)
*5/5
4/5
1/5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.5
Hthanh
(+)
5/5
5/5
0/5
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
2.5
4.0
*: số chết/số tiêm.
Chỉ số NI là sự chênh lệch giữa EID50
(hoặc LD50, TCID50)của lô đối chứng (+) và (-)
Chỉ số NI = 4.0