TIÊU
CHUẨN QUỐC GIA
TCVN
13262-3:2020
THUỐC
BẢO VỆ THỰC VẬT – PHẦN 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM AUXINS BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pesticides -
Part 3: Determination of auxins group content by high performance liquid
chromatographic method
Lời nói đầu
13262-3: 2020 do Cục Bảo vệ thực vật biên
soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THUỐC BẢO VỆ
THỰC VẬT – PHẦN 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM AUXINS BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pesticides -
Part 3: Determination of auxins group content by high performance liquid
chromatographic method
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định
tổng hàm lượng hoạt chất nhóm auxins thực vật gồm ((indole-3-acetic acid (IAA),
indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA), indole-3-
carboxylic acid (ICA)) trong thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao. Thông tin giới thiệu hoạt chất nhóm auxins xem Phụ lục A.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết
cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố
thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố
thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân
tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
3 Nguyên tắc
Tổng auxins thực vật gồm (indole-3-acetic
acid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA),
indole-3-carboxylic acid (ICA)) được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao, sử dụng cột pha đảo (C18) với detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,...
hoặc tương đương), ở bước sóng 280 nm. Kết quả định danh được xác định dựa trên
sự so sánh giữa thời gian lưu của píc mẫu thử và píc chuẩn. Kết quả định lượng
được xác định dựa trên đường chuẩn.
4 Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân
tích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696)
hoặc có độ tinh khiết tương đương.
4.1 Chất chuẩn
indole-3-acetic acid (IAA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.3 Chất chuẩn
indole-3-propionic acid (IPA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.
4.4 Chất chuẩn
indole-3-carboxylic acid (ICA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.
4.5 Axetonitril (C2H3N),
dùng cho sắc ký lỏng.
4.6 Metanol (CH4O),
dùng cho sắc ký lỏng.
4.7 Axit axetic băng (C2H4O2),
dùng cho sắc ký lỏng.
4.8 Dung dịch axit axetic, nồng độ
khoảng 0,8 % theo thể tích
Dùng pipet (5.3) lấy 8 ml axit axetic băng
(4.7) cho vào cốc dung tích 1000 ml (5.1) có chứa sẵn 1000 ml nước cất. Siêu âm
10 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.9 Dung dịch chuẩn gốc
4.9.1 Dung dịch chuẩn gốc IAA, nồng độ
khoảng 1000 mg/l
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
4.9.2 Dung dịch chuẩn gốc IBA, nồng độ
khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g
chất chuẩn IBA (4.2), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2),
hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội
đến nhiệt độ phòng.
4.9.3 Dung dịch chuẩn gốc IPA, nồng độ
khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g
chất chuẩn IPA (4.3), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2),
hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội
đến nhiệt độ phòng.
4.9.4 Dung dịch chuẩn gốc ICA, nồng độ
khoảng 500 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g
chất chuẩn ICA (4.4), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 20 ml (5.2),
hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội
đến nhiệt độ phòng.
4.10 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung
gian
Nồng độ IAA, IBA, IPA khoảng 100 mg/l, nồng
độ ICA khoảng 50 mg/l
Dùng pipet chia vạch (5.3) hút 2 ml các dung
dịch chuẩn gốc IAA (4.9.1), IBA (4.9.2), IPA (4.9.3), ICA (4.9.4) vào bình định
mức 20 ml (5.2), định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để
nguội đến nhiệt độ phòng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dãy dung dịch chuẩn làm việc IAA, IBA, IPA
nồng độ khoảng 5; 10; 20; 50; 80 mg/l
Dãy dung dịch chuẩn làm việc ICA, nồng độ
khoảng 2,5; 5; 10; 25; 40 mg/l
Dùng pipet chia vạch (5.3) lấy chính xác 0,5;
1; 2; 5; 8 ml dung dịch chuẩn trung gian IAA, IBA, IPA, ICA (4.10) vào lần lượt
5 bình định mức 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm
trong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
CHÚ THÍCH 1:
1) Chất chuẩn bảo quản trong tủ mát ở 4 °C ±
2 °C;
2) Nếu sử dụng cân có cấp chính xác 0,0001 g
thì lượng mẫu và chuẩn tăng lên 10 lần;
3) Dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn
trung gian nên bảo quản ở 4 °C ± 2 °C, nên sử dụng trong vòng 1 tháng kể từ
ngày pha;
4) Dung dịch chuẩn phải kiểm tra chất lượng
trước khi sử dụng.
5) Dung dịch chuẩn làm việc nên sử dụng ngay
sau khi pha từ dung dịch chuẩn trung gian.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường
của phòng thử nghiệm cụ thể như sau:
5.1 Cốc thủy tinh, dung tích
100 ml; 1000 ml.
5.2 Bình định mức, dung tích
10 ml; 20 ml; 50 ml.
5.3 Pipet chia vạch, dung tích
0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 5 ml; 10 ml.
5.4 Xyranh bơm mẫu, dung tích 50
μl, chia vạch đến 1 μl. hoặc bơm mẫu tự động
5.5 Màng lọc xyranh PTFE, có kích
thước lỗ 0,45 μm, đường kính 25 mm.
5.6 Bể siêu âm, tần số siêu
âm từ 40 kHz đến 100 kHz
5.7 Cân phân tích, có độ chính
xác đến 0,00001 g và 0,0001 g.
5.8 Sàng rây, đường kính lỗ
0,2 mm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.10 Thiết bị lọc
Dùng được cho màng lọc dung môi đường kính 13
mm, kích thước lỗ 0,45 μm để lọc dung môi pha động của HPLC
CHÚ THÍCH 2: Lọc dung môi pha động qua màng
lọc trước khi dùng để kéo dài thời gian sử dụng của cột.
5.11 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng
cao,
được trang bị như sau:
- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc
tương đương);
- Hệ thống bơm cao áp;
- Buồng điều nhiệt cột tách;
- Máy tích phân hoặc máy vi tính;
- Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm,
cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương;
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6 Lấy mẫu và chuẩn
bị mẫu
6.1 Lấy mẫu
Tiêu chuẩn này không qui định việc lấy mẫu.
Nên lấy mẫu theo TCVN 12017 : 2017
6.2 Chuẩn bị mẫu
Mẫu cần được làm đồng nhất trước khi cân: Đối
với mẫu dạng lỏng phải lắc đều, nếu bị đông đặc do nhiệt độ thấp cần được làm
tan chảy ở nhiệt độ (30 ± 2) °C; đối với mẫu dạng bột phải được trộn đều; đối
với mẫu dạng hạt thì phải nghiền mịn và rây qua rây có đường kính lỗ 0,2 mm
(5.8), trộn đều làm mẫu phân tích.
7 Cách tiến hành
7.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Dùng cân phân tích (5.7) cân 2 phần mẫu thử
mỗi phần khoảng 2 g, chính xác đến 0,0001 g vào cốc dung tích 100 ml (5.1),
thêm 10 ml metanol (4.6). Đặt vào bể siêu âm (5.6), siêu âm 30 min, để nguội
đến nhiệt độ phòng, chuyển toàn bộ vào bình định mức 20 ml (5.2), tráng rửa 2
lần mỗi lần 3 ml metanol (4.6). Định mức đến vạch bằng metanol (4.6), lọc qua
màng lọc xyranh 0,45 μm (5.5) trước khi bơm vào thiết bị.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Các điều kiện vận hành sắc ký sau đây được
cho là thích hợp:
Pha động: Axetonitril (4.5): dung dịch axit
axetic (4.8) =20 : 80 (theo thể tích)
Cột phân tích: Cột RP C18, dài 250 mm, đường
kính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương
Bước sóng: 280 nm
Tốc độ dòng: 1 ml/min
Thể tích bơm mẫu: 10 μl
Nhiệt độ buồng cột: 25 °C
7.3 Dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện tích
píc và nồng độ chất chuẩn) của mỗi hoạt chất tại 5 điểm có nồng độ tương ứng
dung dịch chuẩn làm việc (4.11).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Dùng xyranh (5.4) bơm điểm nồng độ thấp nhất
trong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.11) cho đến khi số đo diện tích của pic
chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt dung dịch chuẩn làm việc
từ nồng độ thấp đến cao (4.11) và dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần ( số
đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 % so với giá trị ban đầu).
Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha
loãng dung dịch mẫu thử bằng metanol (4.6).
8 Tính kết quả
Hàm lượng hoạt chất auxins trong mẫu là tổng
hàm lượng các loại auxins được quy định trong mục 1, X, biểu thị bằng
miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức:
trong đó:
X0i là nồng độ
của auxins thứ i trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít
(mg/l);
V là thể tích dung môi
chiết mẫu mililit (ml)
m là khối lượng mẫu
thử, tính bằng gam (g)
Pi là độ tinh khiết của
chất chuẩn auxins thứ i
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết
đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn
tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong
tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có
ảnh hưởng tới kết quả;
Phụ
lục A
(Tham
khảo)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.1 Giới thiệu hoạt chất
indole-3-acetic acid
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: indole-3-acetic acid
- Tên hóa học: IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl)
axetic acid
- Công thức phân tử: C10H9NO2
- Khối lượng phân tử: 75,19
- Nhiệt độ nóng chảy: 162 °C đến 165 °C
- Độ hòa tan: Không tan trong nước, tan trong
ethanol: 50 mg/ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2 Giới thiệu hoạt chất
indole-3-butyric acid
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: indole-3-butyric acid
- Tên hóa học: IUPAC: 4- (1H-indol-3-yl)
butanoic acid
- Công thức phân tử: C12H13NO2
- Khối lượng phân tử: 203,24
- Nhiệt độ nóng chảy: 125 °C
- Dạng bên ngoài: Tinh thể, màu trắng đến
vàng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: indole-3-propionic acid
- Tên hóa học: IUPAC: 3-(1H-indole-3-yl) propanoic
acid
- Công thức phân tử: C11H11NO2
- Khối lượng phân tử: 189,21
- Nhiệt độ nóng chảy: 134 °C đến 135 °C
- Dạng bên ngoài: Tinh thể màu trắng.
A.4 Giới thiệu hoạt chất
indole-3-carboxylic acid
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- Tên hoạt chất: indole-3-carboxylic acid
- Tên hóa học: IUPAC: 1H-indole-3-carboxylic
acid
- Công thức phân tử: C9H7NO2
- Khối lượng phân tử: 161,16
- Nhiệt độ nóng chảy: 205 °C đến 209 °C
- Dạng bên ngoài: Tinh thể màu trắng.
A.5 Hiệu suất thu hồi và giới hạn
định lượng
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ 80 % đến
110 %
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- IAA: 50 mg/kg
- IBA: 20 mg/kg
- IPA: 50 mg/kg
- ICA: 50 mg/kg
- Độ lặp lại của phương pháp, CV ≤ 7 %.
Phụ
lục B
(Tham
khảo)
Thông tin về sắc ký đồ điển hình của nhóm
auxins
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Thư mục tài
liệu tham khảo
[1] TCVN 12017: 2017 Thuốc bảo vệ thực
vật- Lấy mẫu
[2] Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép
sử dụng ở Việt Nam
[3] Manual pesticides
[4] Determination of plant hormones in
fertilizers by high-performance liquid chromatography with photodiode array
detection: Method development and single-laboratory validation
[5] .“Current analytical methods for plant
auxin quantification- a review”, analytica Chimica Acta, journal homepage: www.elsevier.com/locate/aca
[6] .“HPLC-based in quantification of
indole-3-axetic acid in the primary root tip of maize”, JNBT, Vol.3 No1,
p.40-45.