Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6402:1998 sữa – phát hiện salmonella phương pháp chuẩn

• Số hiệu: TCVN6402:1998
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 1998

Sản phẩm	Cỡ mẫu	Môi trường tiền tăng sinh *	Phương pháp chuẩn bị	Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ nhất và thứ hai
Sữa	50ml (2x25ml)	Không	Trộn	225 ml tetrathionat 225 ml xixtin selenit
Sữa bột	25 g	Nước cất có dung dịch xanh briliant	Ngâm 60 phút ± 10 phút, không trộn +	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Bột của dịch tách ra khi sản xuất phomat và bơ, bột bơ loãng	25 g	Nước cất có dung dịch xanh briliant	Trộn	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Lactoza	25 g	225 ml nước pepton có đệm	Trộn	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Casein, phomat	25 g	225 ml nước pepton dung dịch đệm	Trộn ở nhiệt độ tối đa là 45^0C	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Bơ	25 ml	225 ml nước pepton có đệm	Trộn	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Sản phẩm sữa đông lạnh	25 ml	225 ml nước pepton có đệm	Trộn	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
Sữa lên men, sữa chua, curstad và món tráng miệng	25 g	225 ml nước pepton có đệm	Trộn	100 ml tetrathionat 100 ml xixtin selenit
* khi có sử dụng môi trường tiền tăng sinh, sau khi nuôi ấm ở 37^0C trong 20h, cấy truyền 10 ml hỗn hợp mẫu đã cấy này vào mỗi bình môi trường tăng sinh. + Nếu sau 3h nuôi ấm mà sữa bột vẫn chưa hòa tan hết thì lắc bình để trộn.

9.1.3. Sữa bột, chuẩn bị một bình thí nghiệm có nút đựng 225 ml nước cất có thêm 1 ml dung dịch xanh brilliant (5.2.2.4). Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng và đổ lên bề mặt chất lỏng đựng trong bình đậy kín, Không lắc. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút ± 10 phút trước khi đem nuôi ấm.

Không cần chỉnh pH.

9.1.4. Bột của dịch tách ra khi sản xuất phomat và bơ, bột bơ loãng. Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào 1 bình thí nghiệm có nút chứa 225 ml nước cất vô trùng. Lắc cho đến khi hòa tan và thêm 1 ml dung dịch xanh brilliant (5.2.2.4).

9.1.5. Lactoza. Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào 1 bình thí nghiệm có nút chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) và lắc cho đến tan.

9.1.6. Casein, phomat. Cân 25 g mẫu thử một cách vô trùng cho vào cốc đựng mẫu vô trùng của máy nghiền trộn (6.6), và thêm 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) ở nhiệt độ 45^0C±1^0C. Trộn cho đến khi phần mẫu thử phân tán đều (từ 1 phút đến 3 phút). Giữ nhiệt độ không được vượt quá 45^0C.

9.1.7. Bơ. Làm tan chảy mẫu (một lượng nhiều hơn 25 g) trong 1 cốc đựng vô trùng trên nồi cách thủy (6.5) đã chỉnh nhiệt độ ở 45^0C±1^0C.

Lắc mẫu thử đã tan chảy và dùng pipet đã được làm ấm đến khoảng 45^0C lấy 25 ml phần mẫu thử cho vào bình thí nghiệm có chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) và trộn.

9.1.8. Sản phẩm sữa đông lạnh (kể cả kem thực phẩm). Làm tan chảy mẫu (lớn hơn 25 g) trong 1 cốc đựng vô trùng trên nồi cách thủy (6.5) đã chỉnh nhiệt độ 45^0C±1^0C.

Dùng pipet lấy 25 ml mẫu thử cho vào bình thí nghiệm có chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) và trộn.

...

...

...

Chú thích 1 – Để đơn giản việc kiểm tra khi mẫu kiểm tra gồm nhiều “phần mẫu thử” 25 g được lấy ra từ 1 lô sữa hoặc sản phẩm sữa xác định, cần kiểm tra, và khi chứng minh được việc tạo thành mẫu chung (gộp chung các phần mẫu thử) không làm ảnh hưởng đến kết quả của sữa hoặc sản phẩm sữa thì có thể gộp lại các phần mẫu thử. Thí dụ, nếu kiểm tra 10 “phần mẫu thử”, mỗi phần 25 g, ta kết hợp 10 đơn vị với nhau để tạo thành một phần mẫu thử là 250 g và đem hòa tan hoặc khuếch tán trong 2,25 l môi trường tiền tăng sinh. Hoặc cách khác, các phần mẫu thử 10 ml của môi trường tiền tăng sinh từ 10 phần mẫu thử riêng rẽ có thể được kết hợp lại đem tăng sinh trong 1l môi trường tăng sinh chọn lọc.

Chú thích 2 – Kiểm tra pH của huyền phù và chỉnh đến 6,8±0,1 nếu thấy cần, trừ khi có quy định khác.

9.1.10. Nuôi ấm. Nuôi ấm các bình thí nghiệm đã chuẩn bị theo 9.1.3 đến 9.1.9 trong khoảng thời gian từ 16h đến 20h, trong tủ ấm ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

9.2. Tăng sinh

9.2.1. Cho 10 ml huyền phù đã nuôi ấm (9.1) vào 1 bình thí nghiệm có chứa 100 ml môi trường tăng sinh thứ nhất (5.2.2); lấy 10 ml huyền phù đã nuôi ấm khác cho vào 1 bình thí nghiệm chứa 100 ml môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai (5.2.3). Trong trường hợp đối với sữa, lấy một cách vô trùng 25 ml mẫu thử cho vào 225 ml môi trường tăng sinh thứ nhất (5.2.2) và 25 ml khác sữa cho vào 225 ml môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai (5.2.3).

9.2.2. Nuôi ấm môi trường tăng sinh thứ nhất đã cấy trong khoảng thời gian từ 18h đến 24h trong 1 nồi cách thủy hoặc trong tủ ấm (6.4) ở nhiệt độ 43^0C±0,5^0C, và môi trường chọn lọc thứ hai đã cấy trong khoảng thời gian từ 18h đến 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

9.3. Ria cấy và đọc kết quả

9.3.1. Dùng que cấy vòng lấy từ mỗi một bình thí nghiệm (9.2) một vòng đầy ria cấy lên bề mặt 1 đĩa môi trường chọn lọc thứ nhất (5.2.4) và lên bề mặt môi trường chọn lọc thứ hai (5.2.5) sao cho thu được các khuẩn lạc phân tách tốt. Tiếp tục nuôi ấm các bình thí nghiệm (xem 9.3.3).

9.3.2. Nuôi ấm các đĩa từ 20h đến 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

...

...

...

Chú thích 1 – Khi thời gian hạn chế, có thể nuôi ấm môi trường tăng sinh trong một chu kỳ đơn từ 18h đến 24h.

9.3.4. Sau khi nuôi ấm, kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình (xem 9.3.5) trên các đĩa (9.3.2 và 9.3.3). Nếu các khuẩn lạc mọc yếu và không điển hình cho Salmonella, nuôi ấm tiếp các đĩa trong 20h đến 24h nữa trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C và kiểm tra lại các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình.

Chú thích 1 – Khi thời gian hạn chế, có thể nuôi ấm các môi trường đặc chọn lọc trong một chu kỳ đơn từ 20h đến 24h.

9.3.5. Các khuẩn lạc Salmonella điển hình có thể có các đặc tính sau đây:

a) Trên môi trường đặc chọn lọc thứ nhất (5.2.4) các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu nâu hoặc màu đen có ánh kim. Một số chủng cho ra các khuẩn lạc xanh lá;

b) Trên thạch xanh brilliant/đỏ phenol (5.2.5.2) các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng với vùng môi trường bao quanh đỏ tươi;

c) Trên thạch XLD (5.2.5.3) các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu đỏ, có hoặc không có các điểm đen ở giữa.

d) Trên thạch Hektoen enteric (5.2.5.4) các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có các điểm đen ở giữa.

Chú thích – Do việc nhận biết các khuẩn lạc Salmonella đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm, và do vẻ ngoài của chúng trên các môi trường nhận diện có thể thay đổi tùy chủng hoặc tùy lô môi trường, nên phải chọn các khuẩn lạc nghi ngờ và khuẩn lạc điển hình để kiểm tra tiếp.

...

...

...

9.4.1. Chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Để khẳng định, lấy năm khuẩn lạc điển hình hoặc có nghi ngờ từ mỗi đĩa của từng môi trường chọn lọc (xem 9.3.4).

Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó đem khẳng định.

Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt các địa thạch dinh dưỡng đã được làm khô trước (5.2.6) sao cho các khuẩn lạc mọc phân tách rõ ràng.

Nuôi ấm các đĩa đã cấy thời gian từ 18h đến 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

Lấy các khuẩn lạc thuần khiết để khẳng định đặc tính sinh hóa và huyết thanh.

9.4.2. Khẳng định tính sinh hóa

Chú thích – Có thể sử dụng hệ thống chẩn đoán nhanh có bán sẵn trên thị trường thay cho trình tự mô tả trong 9.4.2.1 đến 9.4.2.8 để khẳng định sinh hóa các khuẩn lạc Salmonella nếu chúng phù hợp với mục đích. Cần tuân theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

9.4.2.1. Nuôi cấy. Dùng que cấy vòng để cấy từ mỗi giống vi khuẩn thu được từ các khuẩn lạc đã chọn trong 9.4.1, vào các môi trường chỉ định trong 9.4.2.2 đến 9.4.2.7.

...

...

...

Nuôi trong tủ ấm 24h đặt ở nhiệt độ 37^0C±1^0C. Diễn giải sự biến đổi ở các môi trường như sau:

Cột thạch:

Màu vàng:

glucoza dương tính (lên men glucoza)

Màu đỏ hoặc không đổi màu:

glucoza âm tính (không lên men glucoza)

Màu đen:

có tạo thành sunfua hidro

Có bọt khí hoặc có vết nứt:

...

...

...

Bề mặt thạch nghiêng:

Màu vàng:

lactoza và/hoặc xacaroza dương tính (có sử dụng lactoza và/hoặc xacaroza)

Màu đỏ hoặc không đổi màu:

lactoza và/hoặc xacaroza âm tính (không sử dụng lactoza hoặc xacaroza)

Các giống Salmonella điển hình cho tính kiềm (màu đỏ) trên thạch nghiêng, có sinh khí và axit (màu vàng), ở cột thạch, và (khoảng 90% trường hợp có sinh sunfua hidro (làm đen thạch).

Khi có 1 chủng Salmonella lactoza dương tính được phân lập, mặt nghiêng thạch TSI sẽ có màu vàng. Do đó, việc khẳng định sơ bộ các giống Salmonella không được chỉ dựa vào kết quả thử trên thạch TSI (xem 9.4.3).

9.4.2.3. Thạch ure (5.2.8). Ria cấy lên bề mặt nghiêng của thạch. Nuôi trong 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C và thỉnh thoảng kiểm tra.

Nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải phóng amoniac, làm đổi màu đỏ phenol sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím.

...

...

...

Nuôi trong 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

Màu đỏ tía xuất hiện sau khi vi khuẩn sinh trưởng là phản ứng dương tính. Màu vàng là phản ứng âm tính.

9.4.2.5. Phát hiện β-galactosidaza. Hòa 1 vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào 1 ống nghiệm có chứa 0,25 ml dung dịch muối (5.2.14).

Thêm 1 giọt toluen (5.2.15) và lắc ống nghiệm. Đặt ống nghiệm này vào nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C và để yên vài phút.

Thêm 0,25 ml thuốc thử β-galactosidaza (5.2.10) và lắc trộn.

Đặt lại ống nghiệm vào nồi cách thủy để ở nhiệt độ 37^0C±1^0C và để yên 24h.

Có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính. Phản ứng thường xẩy ra sau 20 phút.

9.4.2.6. Môi trường thử phản ứng Voges – Proskeuer (VP) (5.2.11). Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào 1 ống nghiệm vô trùng chứa 3 ml môi trường VP (5.2.11.1).     

Nuôi 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

...

...

...

Việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính.

9.4.2.7. Môi trường thử phản ứng indol (5.2.12). Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào 1 ống nghiệm chứa 5 ml môi trường tripton/triptophan (5.2.12.1).

Nuôi 24h trong tủ ấm (6.3) ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

Sau khi nuôi ấm, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs (5.2.12.2).

Có tạo thành vòng màu đỏ là phản ứng dương tính. Vòng màu vàng nâu là phản ứng âm tính.

9.4.2.8. Suy luận từ các thử nghiệm sinh hóa. Salmonella thông thường cho các phản ứng như thấy trong bảng 2 (xem chú thích 1 của bảng 2).

9.4.3. Khẳng định về huyết thanh

9.4.3.1. Khái quát. Việc phát hiện sự có mặt các kháng nguyên Salmonella O, Vi và H được tiến hành bằng sự dính kết trên phiến kính với huyết thanh tương ứng trên các khuẩn lạc thuần khiết (9.4.1) và sau khi đã loại trừ các chủng dính kết.

9.4.3.2. Loại trừ các chủng tự dính kết. Cho một giọt dung dịch muối (5.2.14) lên 1 phiến kính đã rửa sạch. Dàn đều khuẩn lạc cần thử nghiệm trong giọt dung dịch này sao cho thu được 1 thể huyền phù đục đồng nhất.

...

...

...

Quan sát kết quả trên nền đen, tốt nhất nên dùng kính lúp.

Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có dính kết thì chủng này được coi là tự dính kết và không cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên không thể thực hiện được.

9.4.3.3. Kiểm tra kháng nguyên O. Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, tiến hành theo 9.4.3.2 bằng cách lấy một giọt kháng huyết thanh O (5.3) thay cho dung dịch muối.

Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính. Sử dụng tuần tự một kháng huyết thanh đa và đơn giá.

9.4.3.4. Kiểm tra kháng nguyên Vi. Tiến hành theo 9.4.3.2, nhưng sử dụng một giọt kháng huyết thanh Vi (5.3) thay cho dung dịch muối.

Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính.

9.4.3.5. Kiểm tra kháng nguyên H. Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự dính kết thuần khiết lên thạch dinh dưỡng thể nửa đặc (5.2.13).

Nuôi môi trường này từ 18h đến 24h ở nhiệt độ 37^0C±1^0C.

Dùng giống cây này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành theo 9.4.3.2, nhưng sử dụng một giọt kháng huyết thanh H (5.3) thay cho dung dịch muối.

...

...

...

9.4.4. Suy luận từ các phản ứng sinh hóa và huyết thanh. Bảng 3 cho phép nội suy từ các thử nghiệm khẳng định (xem 9.4.2) và (9.4.3) được tiến hành trên các khuẩn lạc chọn lọc (xem 9.4.1).

9.4.5. Khẳng định cuối cùng. Các chủng được coi là Salmonella, hoặc có thể là Salmonella, (xem bảng 3) gửi đến một trung tâm giữ chuẩn Salmonella đã được công nhận để khẳng định lần cuối.

Việc gửi mẫu này phải kèm theo tất cả các thông tin cần thiết liên quan đến chủng vi khuẩn đó.

10. Các giống vi khuẩn cấy để kiểm chứng

Để kiểm tra về khả năng đảm bảo cho Salmonella phát triển của các môi trường tăng sinh và nhận biết cần cấy một giống Salmonella chuẩn vào các bình thí nghiệm chứa hai loại môi trường tăng sinh (9.2). Tiếp theo tiến hành với các bình kiểm tra như đối với các giống vi khuẩn cấy thử nghiệm để chứng minh rằng giống vi khuẩn đối chứng dương tính có thể phát triển được.

Bảng 2 – Phản ứng sinh hóa của Salmonella

Môi trường khẳng định sinh hóa

Phản ứng âm tính hoặc dương tính

Phần trăm chủng Salmonella cho phản ứng (xem chú thích 2)

...

...

...

+

%

100

TSI glucoza (sinh khí) (9.4.2.2) 

+

91,9 (xem chú thích 3)

TSI lactoza  (9.4.2.2) 

-

99,2

...

...

...

-

99,5

TSI hidro sunfua (9.4.2.2) 

+

91,6

Phân giải ure (9.4.2.3)

-

100

Lyxin decacboxyl (9.4.2.4)

...

...

...

94,6

Phản ứng β-galatoxidaza (9.4.2.5)

-

98,5 (xem chú thích 4)

Phản ứng Voges – Proskauer (9.4.2.6)

-

100

Phản ứng indol (9.4.2.7)

-

...

...

...

Chú thích 1 – W H Ewing và M M Bali. Các phản ứng sinh hóa của Salmonella (1966)

Chú thích 2 – Số phần trăm này chỉ chứng tỏ rằng không phải tất cả các chủng Salmonella cho các phản ứng ký hiệu + hoặc -; Phần trăm này có thể thay đổi theo từng nước và theo từng loại sản phẩm thực phẩm.

Chú thích 3 – Salmonella typhi là vi sinh vật kỵ khí.

Chú thích 4 – Các Salmonella nhóm III (Arizona) cho các phản ứng lactoza dương tính hoặc âm tính nhưng luôn luôn cho phản ứng β-galactosidaza dương tính. Các Salmonella nhóm II có thể cho phản ứng lactoza âm tính nhưng có thể cho phản ứng β-galactosidaza dương tính.  

Bảng 3 – Suy luận từ các phép thử khẳng định

Các phản ứng sinh hóa

Tự dính kết

Các phản ứng huyết thanh

Suy luận

...

...

...

Không

Kháng thể O, Vi hoặc H dương tính

Các chủng được coi là Salmonella

Điển hình

Không

Tất cả phản ứng âm tính

Có thể là Salmonella

Điển hình

Có

...

...

...

Phản ứng không điển hình

Không

Kháng nguyên O, Vi hoặc H dương tính

Phản ứng không điển hình

Không

Tất cả phản ứng âm tính

Không được coi là Salmonella

11. Biểu thị kết quả

Theo kết quả suy luận, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Salmonella trong phần mẫu thử xác định theo đơn vị khối lượng tính bằng gam hay thể tích, tính bằng mililit mẫu thử.

...

...

...

Báo cáo kết quả phải ghi số hiệu của tiêu chuẩn này và kết quả thu được. Cũng phải nêu tên môi trường đặc chọn lọc thứ hai (5.2.5.1) đã sử dụng và tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Báo cáo kết quả cũng bao gồm các thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

PHỤ LỤC A

SƠ ĐỒ TIẾN HÀNH THỬ

Phần mẫu thử, 25 g

PHỤ LỤC B

...

...

...

B.1. Đặc tính vi khuẩn học

Hạn chế việc phân tán vi khuẩn Proteus lên môi trường thạch xanh brillian/đỏ phenol khi việc phát triển của Salmonella không bị ức chế.

B.2. Phương pháp thử

B.2.1. Môi trường

Chuẩn bị môi trường thạch xanh brillian/đỏ phenol theo 5.2.5.1 nhưng có các nồng độ của xanh brillian khác nhau trong phạm vi từ 4,5 mg/l đến 6 mg/l.

B.2.2. Cách tiến hành

Cấy khuẩn lạc thuần khiết Proteus chuyển động và khuẩn lạc Salmonella thần khiết lên các đĩa thạch có các nồng độ xanh brillian khác nhau và để các đĩa này trong tủ ấm (6.3) ở 37^0C±1^0C không quá 24h.

Nồng độ xanh brillian thích hợp cho Salmonella phát triển thành các khuẩn lạc màu hồng điển hình có đường kính từ 1 mm đến 2 mm, còn hạn chế việc phát triển Proteus, tức là loại này không mọc lan rộng.

Nên dùng nồng độ xanh brillian này để chuẩn bị dung dịch xanh brillian (xem 5.2.2.4).