Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8555:2010 Gốm mịn - thử hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu bán dẫn xúc tác quang

• Số hiệu: TCVN8555:2010
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2010

A	là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của mẫu chưa được xử lý, chỉ sau khi cấy ghép
BD	là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của mẫu chưa được xử lý, sau khi được giữ trong khu vực tối
BL	là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của mẫu chưa được xử lý, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L
CD	là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của mẫu đã được xử lý xúc tác quang, sau khi được giữ trong khu vực tối
CL	là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của mẫu đã được xử lý xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L
FBD	là giá trị tăng trưởng, sau khi được giữ trong khu vực tối
FBL	là giá trị tăng trưởng, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L
L	là cường độ chiếu xạ UV
Lmax	là giá trị logarit lớn nhất của vi khuẩn còn sống
Lmean	là giá trị logarit trung bình của vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử
Lmin	là giá trị logarit nhỏ nhất của vi khuẩn còn sống
M	là số lượng vi khuẩn còn sống với phương pháp kết dính thủy tinh
MBA	là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử chưa được xử lý, chỉ sau khi cấy ghép
MBD	là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử chưa được xử lý, sau khi được giữ trong khu vực tối
MBL	là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử chưa được xử lý, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L
MD	là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử đã được xử lý xúc tác quang, sau khi được giữ trong khu vực tối
ML	là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu thử đã được xử lý xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L
N	là số lượng vi khuẩn còn sống với phương pháp kết dính màng
P	là nồng độ vi khuẩn
R	là hệ số pha loãng
RL	là giá trị hoạt tính xúc tác quang kháng khuẩn, sau khi chiếu xạ tại cường độ không đổi (L) trên vật liệu xúc tác quang
∆R	là giá trị hoạt tính xúc tác quang kháng khuẩn có chiếu xạ UV
SL	là giá trị hoạt tính xúc tác quang kháng khuẩn, sau khi chiếu xạ UV có cường độ L
∆S	là giá trị hoạt tính xúc tác quang kháng khuẩn có chiếu xạ UV
V	là thể tích của nước phân hủy cazein đậu nành với lexithin và môi trường polysobat 80 để rửa
Z	là số lượng trung bình của khuẩn lạc trong hai đĩa Petri

5 Nguyên tắc

Tiêu chuẩn này nhằm mục đích phát triển, so sánh, đảm bảo chất lượng, đặc tính, độ tin cậy và tạo ra bộ dữ liệu cho vật liệu xúc tác quang. Phương pháp được sử dụng để nhận được hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu xúc tác quang bởi sự tiếp xúc của mẫu thử với vi khuẩn, dưới bức xạ ánh sáng UV. Phương pháp kết dính màng có thể sử dụng được đối với lá, tấm phẳng hoặc vật liệu hình dạng phẳng. Để tránh hiện tượng màng phủ bị uốn cong vênh, hư hỏng khi phủ lên chất liệu dệt hoặc vải, phương pháp kết dính thủy tinh có thể sử dụng được đối với vải hoặc sợi dệt.

Mẫu được đặt nằm trong đĩa Petri và thể huyền phù vi khuẩn được chảy nhỏ giọt vào mẫu. Khi đó màng kết dính hoặc thủy tinh được đặt lên trên thể huyền phù và kính giữ độ ẩm được đặt lên trên đĩa Petri. Đĩa Petri có chứa mẫu được phơi ra ngoài ánh sáng. Sau khi phơi, vi khuẩn thử nghiệm được rửa ra khỏi mẫu và màng kết dính hoặc thủy tinh. Dung dịch rửa huyền phù này được đo bằng phương pháp đếm vi khuẩn còn sống.

6 Vật liệu

6.1 Vi khuẩn được sử dụng và chuẩn bị phép thử

6.1.1 Phương pháp kết dính màng

a) Staphylococcus aureus

b) Escherichia coli

6.1.2 Phương pháp kết dính thủy tinh

...

...

...

b) Klebsiella pneumoniae

6.1.3 Chuẩn bị vi khuẩn

Chủng vi khuẩn được sử dụng trong phép thử là tương đương với chủng vi khuẩn được mô tả trong Bảng 1 và được bảo quản theo thực thể đã được đăng ký ở Liên đoàn thế giới về bộ sưu tập chủng cấy hoặc Hiệp hội Nhật bản về bộ sưu tập chủng cấy.

Các thao tác vô trùng sử dụng vi sinh vật có thể được tiến hành trong khoang an toàn. Nuôi cấy từng chủng trong môi trường cấy sinh học (môi trường thạch dinh dưỡng), ủ từ 16 h đến 24 h ở 37 °C ± 1 °C và sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C đến 10 °C. Lặp lại nuôi cấy phụ trong 1 tháng bằng cách sao lại quy trình này. Số lượng tối đa của các vi khuẩn từ chủng gốc được truyền bởi sự thu gom vi khuẩn là 10. Vi khuẩn cấy không được sử dụng nếu tồn chứa sau 1 tháng.

CHÚ THÍCH 1: Trong trường hợp vi khuẩn được bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu, số lượng tối đa của các vi khuẩn từ chủng gốc được truyền bởi sự thu gom vi khuẩn là 10.

CHÚ THÍCH 2: Nếu cần, có thể cho phép các phép bổ sung với các vi khuẩn khác.

Bảng 1 - Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm

Loài vi khuẩn

Ký hiệu chủng

...

...

...

Staphylococcus aureus

ATCC 6538P

Sưu tập chủng cấy loại Mỹ

DSM 346

Sưu tập vi sinh vật và chủng cấy tế bào của Đức (DSMZ)

NBRC 12732

Trung tâm tài nguyên sinh học NITE

Escherichia coli

ATCC 8739

...

...

...

DSM 1576

Sưu tập vi sinh vật và chủng cấy tế bào của Đức (DSMZ)

NBRC 3972

Trung tâm tài nguyên sinh học NITE

Klebsiella pneumoniae

ATCC 4352

Sưu tập chủng cấy loại Mỹ

DSM 789

Sưu tập vi sinh vật và chủng cấy tế bào của Đức (DSMZ)

...

...

...

Trung tâm tài nguyên sinh học NITE

6.2 Hóa chất và cách dùng

6.2.1 Nước dinh dưỡng 1/500

Đối với 1000 mL nước tinh khiết, lấy 3,0 g dịch chiết thịt, 10,0 g pepton và 5,0 g natri clorua, cho vào bình và hòa tan thật kỹ. Khi hỗn hợp đã được pha loãng kỹ, sử dụng dung dịch natri hydroxit hoặc axit clohydric để chỉnh pH về (7,1 ± 0,1) ở 25 °C. Sử dụng nước cất để pha loãng môi trường này 500 lần, và sử dụng dung dịch axit clohydric hoặc natri hydroxit để chỉnh pH về (7,0 ± 0,2). Tiệt trùng trong lò hấp ở 121 °C ± 2 °C trong ít nhất 15 min. Sau khi chuẩn bị, nếu nước dinh dưỡng 1/500 không được sử dụng ngay, bảo quản nước ở 5 °C đến 10 °C. Không sử dụng nước dinh dưỡng 1/500 đã pha chế quá 1 tháng.

6.2.2 Nước dinh dưỡng

Đối với 1000 mL nước tinh khiết, lấy 3,0 g dịch chiết thịt, 10,0 g pepton và 5,0 g natri clorua, cho vào bình và hòa tan thật kỹ. Khi hỗn hợp đã được pha loãng kỹ, sử dụng dung dịch natri hydroxit hoặc axit clohydric để chỉnh pH về (7,1 ± 0,1) ở 25 °C. Nếu cần, định lượng hỗn hợp trong ống thử, thêm nút cotton và tiệt trùng trong lò hấp (xem 6.2.1). Sau khi chuẩn bị, nếu nước dinh dưỡng không được sử dụng ngay, bảo quản nước ở 5 °C đến 10 °C. Không sử dụng nước dinh dưỡng 1/500 đã pha chế quá 1 tháng.

6.2.3 Thạch dinh dưỡng

Đối với 1000 mL nước tinh khiết, lấy 3,0 g dịch chiết thịt, 5,0 g pepton và 15,0 g bột thạch, cho chúng vào bình và trộn. Gia nhiệt bình trong nước đang sôi để hòa tan hoàn toàn hỗn hợp. Sử dụng dung dịch natri hydroxit 0,1 mol/L để chỉnh pH về (6,8 ± 0,2) ở 25 °C. Thêm nút cotton và tiệt trùng trong nồi hấp (xem 6.2.1). Sau khi chuẩn bị, nếu thạch dinh dưỡng không được sử dụng ngay, bảo quản thạch ở 5 °C đến 10 °C. Không sử dụng thạch dinh dưỡng đã pha chế quá 1 tháng. Giữ nhiệt độ môi trường từ 45 °C đến 48 °C khi trộn với huyền phù vi khuẩn.

6.2.4 Nước phân hủy đậu nành-cazein với lexithin và polysorbat 80 (SCDLP)

...

...

...

6.2.5 Dung dịch muối sinh lý

Đối với 1000 mL nước tinh khiết, lấy 8,5 g natri clorua, cho vào bình và hòa tan hoàn toàn. Nếu cần, định lượng trong ống thử và tiệt trùng trong nồi hấp (xem 6.2.1). Sau khi chuẩn bị, nếu dung dịch muối sinh lý không sử dụng ngay thì bảo quản ở 5 °C đến 10 °C. Không sử dụng dung dịch muối sinh lý đã pha chế quá 1 tháng.

6.2.6 Dung dịch muối sinh lý để rửa

Đối với 1000 mL nước tinh khiết, lấy 8,5 g natri clorua, cho vào bình và hòa tan hoàn toàn. Thêm 2,0 g chất hoạt động bề mặt không ion và pha loãng. Nếu cần, định lượng 20 mL dung dịch trong ống thử hoặc bình Erlenmeyer và tiệt trùng trong nồi hấp (xem 6.2.1). Sau khi chuẩn bị, nếu dung dịch muối sinh lý để rửa không sử dụng ngay thì bảo quản ở 5 °C đến 10 °C. Không sử dụng dung dịch muối sinh lý đã pha chế quá 1 tháng để rửa.

6.2.7 Chất hoạt động bề mặt không ion

Polyoxyetylen sorbitan monooleat (polysorbat 80).

7. Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị, dụng cụ thử nghiệm cho phép khảo cứu hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu xúc tác quang khi cho chiếu xạ UV kích hoạt chất xúc tác quang. Thiết bị bao gồm nguồn sáng và khoang chứa mẫu thử. Ví dụ về hệ thống thử chỉ ra trong Hình 1.

...

...

...

1 nguồn sáng

2 tấm kim loại đục lỗ

3 que thủy tinh

4 giấy lọc

5 mẫu thử

6 màng kết dính hoặc thủy tinh

7 kính giữ ẩm

Hình 1 - Sơ đồ thiết bị thử nghiệm

7.1 Màng kết dính

...

...

...

CHÚ THÍCH: Dữ liệu tham khảo đối với các màng kết dính xem trong Phụ lục B.

7.2 Kính kết dính

Kính kết dính bao gồm tấm kính có chiều dày ít nhất hoặc bằng 1,1 mm, có mức độ truyền qua trên 85 % trong dải 340 nm đến 380 nm. Các tấm được cắt ra có kích thước (40 ± 2) mm.

CHÚ THÍCH: Dữ liệu tham khảo đối với các tấm kính kết dính xem trong Phụ lục B.

7.3 Kính giữ ẩm

Kính giữ ẩm bao gồm các tấm kính có chiều dày nhỏ hơn hoặc bằng 1,1 mm, có mức độ truyền qua trên 85 % trong dải 340 nm đến 380 nm. Các tấm được cắt để che hoàn toàn đĩa Petri.

7.4 Ống thủy tinh hoặc đũa thủy tinh

Ống thủy tinh hoặc đũa thủy tinh được chuẩn bị bằng cắt ống hoặc đũa có chiều dài từ 10 cm đến 15 cm và uốn có dạng chữ U hoặc V.

7.5 Đèn huỳnh quang ánh sáng xanh đen

...

...

...

7.6 Thiết bị đo bức xạ ánh sáng tử ngoại

Cường độ chiếu xạ phải được đo tại vị trí mẫu thử. Thiết bị đo bức xạ UV phải được hiệu chuẩn đối với nguồn sáng được sử dụng hoặc hiệu chỉnh để xác định độ nhạy nằm trong dải sóng được hấp thụ bởi mẫu thử xúc tác quang.

7.7 Tấm kim loại đục lỗ

Nếu không thể nhận được cường độ quy định bằng cách điều chỉnh chiều cao nguồn sáng, làm giảm cường độ bằng cách sử dụng tấm kim loại đục lỗ (xem Hình 2 và 3) trực tiếp dưới đèn.

Kích thước tính bằng milimet

CHÚ DẪN

1 Vị trí đèn

2 lỗ (đường kính khoảng 5 đến 15)

...

...

...

Kích thước tính bằng milimet

CHÚ DẪN

1 vị trí đèn

2 lỗ (đường kính khoảng 5 đến 15)

Hình 3 – Tấm kính loại đục lỗ đối với cường độ ánh sáng 0,001 mW/cm^2

8. Mẫu thử

8.1 Phương pháp kết dính màng

Cắt phần phẳng của vật liệu hình vuông kích thước (50 ± 2) mm x (50 ± 2) mm. Các vật liệu phải có độ dày lên đến 10 mm. Sử dụng vật liệu làm mẫu hình dạng tiêu chuẩn. Chuẩn bị 9 miếng của mẫu không xử lý và 6 miếng của mẫu đã xử lý xúc tác quang. Nếu không thể có các mẫu không xử lý thì sử dụng các tấm kính thay thế cẩn thận tránh nhiễm vi sinh vật và lây nhiễm chéo các mẫu.

...

...

...

8.2 Phương pháp kết dính thủy tinh

Cắt vật liệu hình vuông kích thước (50 ± 2) mm x (50 ± 2) mm làm mẫu. Chuẩn bị 9 miếng của vải tiêu chuẩn và 6 miếng của mẫu đã xử lý xúc tác quang, cẩn thận tránh nhiễm vi sinh vật và lây nhiễm chéo các mẫu.

Đặt từng mẫu vào trong đĩa thủy tinh Petri. Đặt các đĩa vào trong rổ sợi dây kim loại, đậy lá nhôm lên trên và tiệt trùng trong lò hấp. Sau khi tiệt trùng, lấy lá nhôm ra, chuyển nắp đậy đĩa đến bàn sạch và làm khô mẫu trong khoảng 60 min.

9. Cách tiến hành

Biểu đồ phương pháp thử được nêu trong Hình 4 và 5.

9.1 Phương pháp kết dính màng

9.1.1 Sử dụng vòng platin chuyển các vi khuẩn đã lưu giữ vào môi trường cấy thạch dinh dưỡng và nuôi cấy ở (37 ± 1) °C trong 16 h đến 24 h. Chuyển vi khuẩn sang môi trường thạch dinh dưỡng mới và ủ ở (37 ± 1) °C trong 16 h đến 20 h. Phân tán đều một lượng nhỏ vi khuẩn thử nghiệm trong NB 1/500 bằng vòng platin, và đo đếm vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học hoặc phương pháp thích hợp khác. Pha loãng huyền phù vi khuẩn này bằng NB 1/500 để có được nồng độ 6,7 x 10^5 tế bào/mL đến 2,6 x 10^6 tế bào/mL và sử dụng dung dịch thu được làm dung dịch huyền phù vi khuẩn cho thử nghiệm. Nếu thể huyền vi khuẩn không được sử dụng ngay thì bảo quản ở 0 °C và sử dụng trong vòng 4 h.

Hình 4 - Biểu đồ của phương pháp kết dính màng

...

...

...

Hình 5 - Biểu đồ của phương pháp kết dính thủy tinh

9.1.2 Đặt giấy lọc đã tiệt trùng kiểm soát độ ẩm trong đáy của đĩa Petri đã tiệt trùng, thêm lượng thích hợp nước tiệt trùng, xen vào giữa ống hoặc đũa thủy tinh để ngăn sự tiếp xúc giữa mẫu thử và giấy lọc, đặt mẫu thử lên bề mặt đã xử lý xúc tác quang. Lấy chính xác 0,15 mL huyền phù vi khuẩn thử nghiệm bằng pipet đã tiệt trùng và nhỏ giọt lên bề mặt mỗi mẫu thử. Đặt màng lên trên giọt huyền phù, ấn nhẹ để giọt huyền phù dàn đều trên bề mặt màng một cách nhẹ nhàng sao cho không bị chảy huyền phù ra biên màng thử. Sau đó đặt kinh giữ ẩm trên mặt trên đĩa Petri. Giữ lại 3 mẫu không xử lý xúc tác quang để đếm số tế bào sống sót ngay sau khi cấy huyền phù vi khuẩn thử, số còn lại tiến hành thử với điều kiện có chiếu xạ như mô tả trong 9.3.

CHÚ THÍCH 1: Thêm 4 mL đến 6 mL nước tiệt trùng vào trong từng đĩa Petri là đủ.

CHÚ THÍCH 2: Lượng huyền phù quy định có thể gây ra sự rò rỉ ở biên màng mẫu xúc tác quang hoặc không đủ để dán đều huyền phù trên bề mặt Trong trường hợp như vậy, có thể chấp nhận giảm một nửa hoặc tăng gấp đôi lượng huyền phù quy định. Tuy nhiên, ngay cả khi lượng huyền phù vi khuẩn để cấy có thay đổi thì số tế bào trên mỗi mẫu thử phải bằng số tế bào trên mẫu thử kích thước tiêu chuẩn, với 1,0 x 10^5 tế bào đến 4,0 x 10^5 tế bào.

Lượng huyền phù vi khuẩn thử nghiệm để nuôi cấy trong trường hợp mẫu thử kích thước không tiêu chuẩn phải tỷ lệ với diện tích bề mặt màng xúc tác quang được sử dụng trong mẫu thử.

9.1.3 Đối với 3 mẫu không xử lý xúc tác quang đã được cấy huyền phù vi khuẩn để thử nghiệm (thử vi khuẩn với mẫu sau khi cấy), dùng cặp nhíp vô trùng bỏ màng kết dính và mẫu thử không xử lý xúc tác quang vào túi stomacher. Lưu ý phải cẩn thận để tránh chảy huyền phù vi khuẩn ra ngoài mẫu thử và màng dính. Cho thêm 10 ml dung dịch SCDLP, xoa bóp kỹ lưỡng bằng tay mẫu thử và màng dính từ ngoài túi stomacher và rửa vi khuẩn thử nghiệm ra dung dịch. Nhanh chóng sử dụng dung dịch vừa rửa ra này để thực hiện phép đo số tế bào sống sót.

Có thể sử dụng dụng cụ khác tương tự túi stomacher nếu chúng cho kết quả giống nhau.

9.1.4 Đối với các mẫu thử của 9.3.3 và 9.3.4, tiến hành rửa giống như cách trong 9.1.3.

9.2 Phương pháp kết dính thủy tinh

...

...

...

a) Cấy chủng gốc vào môi trường thạch dinh dưỡng bằng vòng platin. Ủ trong 24 h đến 48 h ở (37 ± 1) °C (quá trình ủ A). Giữ môi trường ở 5 °C đến 10 °C và sử dụng trong vòng 1 tuần.

b) Cho 20 mL chủng cấy dinh dưỡng vào bình Erlenmeyer dung tích 100 mL. Dùng vòng platin gom khuẩn lạc từ quá trình ủ A, cấy và ủ với việc khuấy (110 min^-^1 với biên độ khoảng 3 cm) trong 18 h đến 24 h ở (37 ± 1) °C (quá trình ủ B).

c) Cho 20 ml chủng cấy dinh dưỡng vào bình Erlenmeyer dung tích 100 mL. Thêm 0,4 mL huyền phù vi khuẩn của quá trình ủ B với nồng độ vi khuẩn 1 x 10^8 tế bào/mL đến 2 x 10^8 tế bào/mL và ủ với việc khuấy (110 rpm với biên độ khoảng 3 cm) trong (3 ± 1) h ở (37 ± 1) °C để đạt 10^7 tế bào/mL (quá trình ủ C).

d) Đánh giá nồng độ vi khuẩn trong quá trình ủ C sử dụng phương pháp hấp thụ quang hoặc quan sát bằng kính hiển vi quang học. Dùng nước cất pha loãng nước dinh dưỡng 20 lần ở nhiệt độ phòng, để nguội và sử dụng để điều chỉnh nồng độ vi khuẩn của quá trình ủ C đến (1 ± 0,3) x 10^5 tế bào/mL. Sử dụng huyền phù thu được làm vật liệu thử nghiệm. Nếu huyền phù vi khuẩn thử nghiệm không được sử dụng ngay, bảo quản ở 0 °C và sử dụng trong vòng 4 h.

9.2.2 Đặt giấy lọc tiệt trùng kiểm soát độ ẩm trong đáy đĩa Petri đã tiệt trùng, thêm lượng thích hợp nước tiệt trùng, xen ở giữa ống thủy tinh hoặc đũa thủy tinh để ngăn sự tiếp xúc giữa mẫu thử và giấy lọc, đặt tấm kính đã tiệt trùng trên đó và đặt mẫu thử lên kính tiệt trùng với bề mặt đã xử lý xúc tác quang lên trên. Dùng pipet đã tiệt trùng lấy chính xác 0,2 mL huyền phù vi khuẩn thử nghiệm và nhỏ giọt lên từng mẫu thử. Đặt tấm kính lên trên giọt huyền phù vừa được nhỏ và ấn nhẹ để huyền phù trải dàn đều trên toàn bộ bề mặt kính một cách nhẹ nhàng sao cho huyền phù không chảy ra ngoài biên của mẫu thử. Sau đó đặt kính giữ ẩm lên trên. Giữ lại 3 miếng vải tiêu chuẩn để đếm số vi khuẩn sống sót thực hiện ngay sau khi cấy huyền phù vi khuẩn thử nghiệm, số còn lại tiến hành thử với điều kiện có chiếu xạ như mô tả trong 9.3.

CHÚ THÍCH 1: Thêm 4 mL đến 6 mL nước tiệt trùng vào trong từng đĩa Petri là đủ

CHÚ THÍCH 2 Lượng huyền phù quy định có thể gây ra sự rò rỉ ở biên màng mẫu xúc tác quang hoặc không đủ để dàn đều huyền phù trên bề mặt. Trong trường hợp như vậy, có thể chấp nhận giảm một nửa hoặc tăng gấp đôi lượng huyền phù quy định. Tuy nhiên, ngay cả khi lượng huyền phù vi khuẩn để cấy có thay đổi thì số tế bào trên mỗi mẫu thử phải bằng số tế bào trên mẫu thử kích thước tiêu chuẩn, với 1,4 x 10^4 tế bào đến 2,6 x 10^4 tế bào.

CHÚ THÍCH 3: Để mẫu thấm tốt với huyền phù vi khuẩn thử nghiệm, có thể sử dụng huyền phù vi khuẩn thử nghiệm chứa 0,05 % chất hoạt động bề mặt không ion. Nếu sử dụng chất hoạt động bề mặt không ion trong huyền phù vi khuẩn thử nghiệm, ghi lại thông tin trong báo cáo thử nghiệm.

9.2.3 Đối với 3 mẫu vải tiêu chuẩn (sau khi đã cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm), sử dụng cặp nhíp đã tiệt trùng đặt kính kết dính tiệt trùng, lớp vải tiêu chuẩn không xử lý xúc tác quang và tấm kính vào trong túi Stomacher, cẩn thận tránh làm rò rỉ huyền phù vi khuẩn. Thêm 20 mL dung dịch muối sinh lý để rửa, xoa bóp túi stomacher kỹ bằng tay và cả vải không xử lý và các tấm kính, và rửa vi khuẩn thử nghiệm. Nhanh chóng sử dụng dung dịch rửa này để tiến hành phép đo số lượng tế bào tồn tại.

...

...

...

9.2.4 Đối với các mẫu thử của 9.3.3 và 9.3.4, tiến hành rửa giống như cách trong 9.2.3.

9.3 Điều kiện chiếu xạ UV

9.3.1 Đặt cảm biến quang điện của thiết bị đo bức xạ UV trên nền của thiết bị bức xạ. Đặt màng và đĩa thủy tinh được sử dụng để thử nghiệm trên mặt trên của cảm biến. Tìm vị trí cường độ UV xem 9.3.2 phù hợp với giá trị hiển thị.

9.3.2 Thử điều kiện cường độ UV, phụ thuộc vào điều kiện vật liệu được sử dụng. Nếu cường độ UV được mô tả không thể nhận được bằng cách điều chỉnh độ cao của nguồn sáng thì giảm cường độ bằng cách sử dụng tấm kim loại đục lỗ.

Bảng 2 - Cường độ chiếu xạ UV để tham khảo trong phép thử

Cường độ UV

Ví dụ

0,25 mW/cm^2

Bên cạnh cửa sổ vào ban ngày, bên cạnh đèn hỗ trợ để phản ứng xúc tác quang (ví dụ BLB)

...

...

...

Trong phòng (bên trong, cách cửa sổ khoảng 1,5 m) vào ban ngày, cạnh cửa sổ vào sáng sớm hoặc trước bình minh

0,01 mW/cm^2

Trong phòng (bên trong, cách cửa sổ khoảng 3 m) vào ban ngày

0,001 mW/cm^2

Trong phòng không có cửa sổ (chỉ có ánh sáng trong phòng), trong phòng vào buổi tối (chỉ có ánh sáng trong phòng)

CHÚ THÍCH: Cường độ UV tối đa là 0.25 mW/cm^2 để tránh làm tổn hại bởi chiếu xạ UV. Cường độ UV tối thiểu của cảm biến quang điện hiện tại là 0,001 mW/cm^2. Dữ liệu tham khảo về khả năng tiêu diệt vi khuẩn của bức xạ UV xem trong Phụ lục C.

9.3.3 Phơi ra ánh sáng các đĩa Petri có chứa mẫu (3 mẫu không xử lý và 3 mẫu xử lý xúc tác quang) với huyền phù vi khuẩn trong 8 h.

CHÚ THÍCH: Thời gian phơi này có thể giảm xuống 4 h để tính đến điều kiện thực mà vật liệu xúc tác quang được sử dụng có hiệu quả

9.3.4 Giữ các đĩa Petri có chứa mẫu (3 mẫu không xử lý và 3 mẫu xử lý xúc tác quang) với huyền phù vi khuẩn trong nơi tối, trong cùng thời gian như trong 9.3.3.

...

...

...

Dùng pipet tiệt trùng lấy 1 mL dung dịch rửa và thêm (9 ± 0,1) mL dung dịch muối sinh lý vào trong ống thử nghiệm và khuấy kỹ, lấy 1 mL dung dịch được chiết ra bằng pipet tiệt trùng mới và thêm vào ống thử nghiệm khác (9 ± 0,1) mL dung dịch muối sinh lý và lại khuấy kỹ. Quá trình này được lại lại để nhận được một dãy dung dịch pha loãng, theo phương pháp pha loãng 10 lần. 1 mL của dung dịch từ các ống của mỗi dãy được lấy ra bằng pipet tiệt trùng mới và đổ vào mỗi hai đĩa Petri. 15 mL đến 20 mL thạch dinh dưỡng được giữ tại nhiệt độ 45 °C đến 48 °C được thêm vào mỗi đĩa Petri; để yên chúng trong 15 min ở nhiệt độ phòng. Khi môi trường thạch trở nên rắn các đĩa Petri được đặt mặt trên xuống và ủ trong 40 h đến 48 h ở (37 ± 1) °C. Số lượng khuẩn lạc được đếm trong dãy đĩa Petri với 30 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc. Nồng độ vi khuẩn của dung dịch rửa nhận được theo công thức (1) và biểu thị đến hai con số có nghĩa.

P = Z x R                                                                                                          (1)

trong đó

P là nồng độ vi khuẩn (tế bào/mL);

Z là số lượng trung bình của khuẩn lạc trong 2 đĩa Petri;

R là hệ số pha loãng.

Nếu số lượng vi khuẩn còn sống nhỏ hơn 30 trong đĩa Petri với 1 mL dung dịch rửa, số lượng tế bào được sử dụng để tính số lượng trung bình. Nếu số lượng vi khuẩn còn sống nhỏ hơn 1 trong đĩa Petri với 1 mL dung dịch rửa, số lượng trung bình được lấy là 1.

10 Tính toán

Kết quả thử nghiệm được tính như sau. Các giá trị tính được luôn luôn được làm tròn đến dấu thập phân thứ hai theo TCVN 7870-1 (ISO 80000-1).

...

...

...

10.1 Phương pháp màng kết dính

10.1.1 Công nhận hoàn thành yêu cầu thử nghiệm

Sử dụng nồng độ vi khuẩn nhận được trong 9.4 và áp dụng công thức (2) để tính số lượng vi khuẩn tồn tại.

N = P x V                                                                                                          (2)

trong đó

N là số lượng tế bào của vi khuẩn còn sống;

P là nồng độ vi khuẩn nhận được trong 9.4 (tế bào/mL);

V là thể tích của môi trường SCDLP để rửa (mL).

Phép thử được coi là có giá trị nếu nó hoàn thành tất cả 4 hạng mục sau. Nếu một hoặc nhiều hơn các hạng mục này không được hoàn thành, phép thử được coi là không có giá trị và phải tiến hành làm lại.

...

...

...

(L_max - L_min)/(L_mean) £ 0,2                                                                                       (3)

trong đó

L_max là giá trị logarit lớn nhất của vi khuẩn còn sống;

L_min là giá trị logarit nhỏ nhất của vi khuẩn còn sống;

L_mean là giá trị logarit trung bình của vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu.

2) Giá trị logarit của vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý sau khi nuôi cấy phải nằm trong dải từ 1,0 x 10^5 đến 4,0 x 10^5 tế bào.

3) Vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý sau khi phơi ngoài ánh sáng phải nhiều hơn 1,0 x 10^3 tế bào đối với tất cả 3 mẫu. Tuy nhiên, nếu sử dụng tấm kính làm mẫu chưa được xử lý thì số lượng vi khuẩn còn sống sau khi phơi ngoài ánh sáng phải nhiều hơn 1,0 x 10^4 tế bào.

4) Sau khi được giữ ở nơi tối, vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý phải nhiều hơn 1,0 x 10^3 tế bào đối với tất cả 3 mẫu. Tuy nhiên, nếu sử dụng tấm kính làm mẫu chưa được xử lý thì số lượng vi khuẩn còn sống sau khi phơi ngoài ánh sáng phải nhiều hơn 1,0 x 10^4 tế bào.

10.1.2 Tính giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang

...

...

...

Bỏ dấu thập phân thứ hai và biểu thị giá trị với một dấu thập phân.

R_L = [log(B_L / A) - log(C_L / A)] = log[B_L / C_L]                                                         (4)

trong đó

R_L

là giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L;

L

là cường độ chiếu xạ UV (mW/cm^2);

A

là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý, chỉ sau khi nuôi cấy;

...

...

...

là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L;

C_L

là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của các mẫu đã xử lý xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L.

∆R = log[B_L /C_L]-[log(B_D / A) - log(C_D / A)] = log[B_L / C_L] - log[B_D / C_D]                   (5)

trong đó

∆R

là giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang với chiếu xạ UV;

B_D

là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của các mẫu chưa được xử lý, sau khi được giữ ở nơi tối;

...

...

...

là số lượng trung bình của vi khuẩn còn sống của các mẫu đã xử lý xúc tác quang, sau khi được giữ ở nơi tối.

10.2 Phương pháp kết dính thủy tinh

10.2.1 Công nhận hoàn thành yêu cầu thử nghiệm

Sử dụng nồng độ vi khuẩn nhận được trong 9.4 và áp dụng công thức (6) để tính số lượng vi khuẩn còn sống.

M = P x 20                                                                                                        (6)

trong đó

M là số lượng tế bào của vi khuẩn còn sống;

P là nồng độ vi khuẩn nhận được trong 9.4 (tế bào/mL);

20 là lượng dung dịch muối sinh lý để rửa (mL).

...

...

...

F_BL = M_BL - M_BA                                                                                                   (7)

trong đó

F_BL

là giá trị tăng trưởng, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L;

L

là cường độ chiếu xạ UV (mW/cm^2);

M_BL

là giá trị logarit trung bình của số lượng vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu chưa được xử lý, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L;

M_BA

...

...

...

F_BD = M_BD - M_BA                                                                                                  (8)

trong đó

F_BD

là giá trị tăng trưởng, sau khi được giữ ở nơi tối;

M_BD

là giá trị logarit trung bình của số vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu chưa được xử lý, sau khi được giữ ở nơi tối.

10.2.2 Tính giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang

Đối với phép thử đã hoàn thành, giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang nhận được với trên 2 con số sử dụng công thức (9) và (10).

S_L = M_BL - M_L                                                                                                     (9)

...

...

...

S_L

là giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L;

M_L

là giá trị logarit trung bình của số vi khuẩn còn sống đối với 3 mẫu đã xử lý xúc tác quang, sau khi chiếu xạ UV với cường độ L.

∆S = (M_BL - M_L) - (M_BD - M_D)                                                                                (10)

trong đó

ΔS

là giá trị hoạt tính kháng khuẩn của chất xúc tác quang với chiếu xạ UV;

M_D

...

...

...

11 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) Mô tả loại, kích cỡ, hình dạng và độ dày của chất xúc tác quang và các mẫu chưa được xử lý;

b) Mô tả các điều kiện trước khi áp dụng việc phơi ánh sáng;

c) Loại vi khuẩn thử nghiệm và ký hiệu chủng vi khuẩn;

d) Nhà sản xuất đèn huỳnh quang UV và số sản phẩm;

e) Nhà sản xuất thiết bị đo bức xạ ánh sáng tử ngoại và số sản phẩm;

f) Các điều kiện phơi ngoài ánh sáng bao gồm cường độ chiếu xạ UV và thời gian phơi ngoài ánh sáng;

g) Phương pháp kết dính màng, loại và kích cỡ màng kết dính và kính giữ ẩm; số lượng huyền phù vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy; số lượng vi khuẩn còn sống trong huyền phù thử nghiệm; các giá trị A, B_L, C_L, R_L, B_D, C_D, ∆R trong 10.1.2;

...

...

...

i) Phương pháp kết dính thủy tinh, thông tin khi sử dụng chất hoạt động bề mặt không ion trong huyền phù vi khuẩn thử nghiệm.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

VÍ DỤ VỀ KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM

Các ví dụ về kết quả thử nghiệm của phương pháp kết dính màng được chỉ ra trong Bảng A.1 và A.2.

Bảng A.1 - Ví dụ về kết quả thử nghiệm đối với Staphylococcus aureus

Phòng thử nghiệm

0,01 mW/cm^2, 8 h

...

...

...

∆R

A

3,4

2,9

B

2,5

2,0

C

2,3

...

...

...

D

3,4

3,0

Trung bình

2,90

2,55

s_{n - 1}

0,58

0,48

...

...

...

Phòng thử nghiệm

0,01 mW/cm^2, 8 h

R_0,01

∆R

E

5,1

4,1

F

...

...

...

3,8

G

2,6

2,2

H

4,9

4,4

Trung bình

4,28

...

...

...

s _{n - 1}

1,14

0,98

Các ví dụ về kết quả thử nghiệm của phương pháp kết dính thủy tinh được chỉ ra trong Bảng A.3 và A.4.

Bảng A.3 - Ví dụ về kết quả thử nghiệm đối với Staphylococcus aureus

Phòng thử nghiệm

0,01 mW/cm^2, 8 h

S_0,01

∆S

...

...

...

0,9

0,2

J

0,7

-1,0

K

0,3

-0,4

Trung bình

...

...

...

-0,40

s _{n - 1}

0,31

0,60

Bảng A.2 - Ví dụ về kết quả thử nghiệm đối với Escherichia coli

Phòng thử nghiệm

0,01 mW/cm^2, 8 h

S_0,01

∆S

...

...

...

2,2

1,0

M

3,1

1,3

N

2,2

1,3

Trung bình

...

...

...

1,20

s _{n - 1}

0,52

0,17

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Dữ liệu tham khảo đối với các màng kết dính và thủy tinh kết dính

Số liệu hệ số truyền đối với màng kết dính thích hợp được làm từ polyprolylen (VF-151) của Công ty KOKUYO, Nhật bản) được chỉ ra trong Hình B.1.

...

...

...

CHÚ DẪN

X bước sóng (nm)

Y hệ số truyền (%)

Hình B.1 - Số liệu hệ số truyền đối với màng kết dính thích hợp

Số liệu hệ số truyền đối với thủy tinh kết dính thích hợp được làm từ borosilicat (TEMPAX^1) của Công ty SCHOTT AG hoặc Pyrex7740^1) của CORNING) được chỉ ra trong Hình B.2.

CHÚ DẪN

X bước sóng (nm)

Y hệ số truyền (%)

...

...

...

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

DỮ LIỆU THAM KHẢO VỀ KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT VI KHUẨN CỦA BỨC XẠ TỬ NGOẠI

Sự tiêu diệt vi khuẩn của bức xạ tử ngoại được đánh giá với tấm kính (không có TiO₂). Các kết quả được chỉ ra trong Hình C.1 đối với Escherichia col và Hình C.2 đối với Staphylococcus aureus.

CHÚ DẪN

X thời gian chiếu xạ (h)

Y vi khuẩn sống sót (LOG)

...

...

...

Hình C.1 - Ảnh hưởng UV đối với Escherichia col

CHÚ DẪN

X thời gian chiếu xạ (h)

Y vi khuẩn sống sót (LOG)

1 vùng tối

Hình C.2 - Ảnh hưởng UV đối với Staphylococcus aureus

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] ISO 554, Standard atmospheres for conditioning and/or testing - Specifications (Môi trường tiêu chuẩn để ổn định và/hoặc thử nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật).

[3] ISO 835, Laboratory glassware - Graduated pipettes (Dụng cụ thủy tinh phòng thử nghiệm - Pepet chia vạch).

[4] ISO 4892-3, Plastics - Methods of exposure to laboratory light source - Part 3: Fluorescent UV lamps (Chất dẻo - Phương pháp tiếp xúc với nguồn sáng phòng thử nghiệm - Phần 3: Đèn huỳnh quang UV).

[5] TCVN 7764-2 (ISO 6353-2), Thuốc thử dùng trong phân tích - Phần 2: Yêu cầu kỹ thuật - Seri thứ nhất.

[6] TCVN 7764-3 (ISO 6353-3), Thuốc thử dùng trong phân tích - Phần 3: Yêu cầu kỹ thuật - Seri thứ hai.

[7] ISO 10523, Water quallity - Determination of pH (Chất lượng nước - Xác định pH).

[8] ISO 20743, Textiles - Determination of antibacterial activity of antibacterial finished products (Vật liệu dệt - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của thành phẩm kháng khuẩn).

[9] ISO 22196, Plastics - Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces (Chất dẻo - Xác định hoạt tính kháng khuẩn trên bề mặt chất dẻo).

[10] SUNADA, K., WATANABE, T. and HASHIMOTO, K., Studies on phototokilling of bacterial on TiO₂ thin film, J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 156, p.227 (2003) (Nghiên cứu về khả năng diệt quang của vi khuẩn trên màng mỏng TiO₂, Tạp chí quang hóa, quang sinh học, A: Hóa học 156 trang 227 (2003).

...

...

...

1) VF-15, TEMPAX và Pyrex7740 là những ví dụ về các sản phẩm thích hợp có sẵn trên thị trường. Thông tin này được đưa ra để thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không phải là chỉ định bắt buộc của ISO cho sản phẩm này.