Dịch thủy phân
casein bằng enzym 17,0
g
Dịch thủy phân đậu
tương bằng enzym 3,0
g
D(+)-glucoza 2,5
g
Muối mật No.3 1,5
g
Natri clorua 5,0
g
Dikali hydrophosphat
(K2HPO4) 4,0
g
Nước 1
000 ml
|
5.1.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần
trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần.
Chỉnh pH, sử dụng máy đo pH (6.6), sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở
25oC, nếu cần.
Phân phối môi trường
với các lượng thích hợp vào các bình cầu hoặc chai (6.7). Khử trùng 15 phút
trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121oC.
5.1.2. Dung dịch
novobioxin
5.1.2.1. Thành phần
Novobioxin 0,45
g
Nước 100
ml
5.1.2.2. Chuẩn bị
Hòa tan novobioxin
trong nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.1.2.3. Chuẩn bị môi
trường hoàn chỉnh
Ngay trước khi sử
dụng, cho 1 ml hoặc 4 ml dung dịch novobioxin (5.1.2) vào 225 ml hoặc 900 ml
môi trường mTSB (5.1.1) đã nguội.
Nồng độ cuối cùng của
novobioxin của mTSB là 20 mg/l.
5.2.
Môi trường phân lập chọn lọc thứ nhất: MacConkey sorbitol telurit xefixim (CT-SMAC)
Xem [2].
5.2.1. Môi trường cơ
bản
5.2.1.1. Thành phần
Dịch thủy phân
casein bằng enzym 17,0 g
Dịch thủy phân đậu
tương bằng enzym 3,0 g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Muối mật No.3 1,5
g
Natri clorua 5,0
g
Đỏ trung tính 0,03
g
Tím tinh thể 0,001
g
Thạch 9
g đến 18 g a
Nước 1
000 ml
a Tùy thuộc vào sức
đông của thạch.
5.2.1.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần
cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng đun sôi. Chỉnh pH (6.6),
sao cho sau khi khử trùng pH là 7,1 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.2. Dung dịch kali
telurit
5.2.2.1. Thành phần
Kali telurit dùng
cho vi khuẩn 0,25
g
Nước 100
ml
5.2.2.2. Chuẩn bị
Hòa tan kali telurit
trong nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
Dung dịch này có thể
bền đến 1 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, nhưng khi thấy có kết tủa màu
trắng thì loại bỏ.
5.2.3. Dung dịch
xefixim
5.2.3.1. Thành phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước 100,0
ml
5.2.3.2. Chuẩn bị
Hòa tan xefixim trong
nước và lọc qua màng lọc để khử trùng.
CHÚ THÍCH: Xefixim có
thể cần phải được hòa tan trong etanol.
Dung dịch này có thể
bền đến 1 tuần khi bảo quản ở nhiệt độ 3oC ± 2oC
5.2.4. Môi trường
hoàn chỉnh
5.2.4.1. Thành phần
Môi trường cơ bản
(5.2.1) 1
000 ml
Dung dịch kali
telurit (5.2.2) 1,0
ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.2.4.2. Chuẩn bị
Làm nguội môi trường
cơ bản mới khử trùng (5.2.1) đến nhiệt độ khoảng từ 44oC đến 47oC
(6.5), hoặc làm tan chảy môi trường cơ bản đông đặc và đã khử trùng bằng hơi
nóng, rồi làm nguội đến nhiệt độ khoảng từ 44oC đến 47oC.
Cho 1 ml dung dịch
telurit và 1 ml dung dịch xefixim vào 1 000 ml môi trường cơ bản. Trộn đều và
rót các lượng 15 ml môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng (6.15). Để cho
đông đặc.
Nồng độ cuối cùng của
telurit là 2,5 mg/l và xefixim là 0,05 mg/l.
Ngay trước khi sử
dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới,
để vào tủ sấy (6.2) ở nhiệt độ từ 25oC đến 50oC cho đến
khi bề mặt thạch khô. Không làm khô tiếp. Cũng có thể làm khô các đĩa thạch
bằng cách mở một nửa nắp để trong buồng sấy an toàn 30 min, hoặc đậy nắp để qua
đêm.
Nếu đã chuẩn bị trước
thì các đĩa thạch chưa khô có thể bảo quản được đến 2 tuần trong các túi chất
dẻo để nơi tối hoặc để trong các vật chứa khác có thể giữ được độ ẩm, để trong
tủ lạnh ở 3oC ± 2oC.
5.3.
Môi trường phân lập chọn lọc thứ hai
Môi trường đặc chọn lọc
khác do phòng thử nghiệm tự chọn để sử dụng bổ sung cho thạch CT-SMAC và phải
thích hợp đặc biệt cho việc phân lập Escherichia coli O157.
Ngay trước khi sử
dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới,
để vào tủ sấy (6.2) ở nhiệt độ từ 25oC đến 50oC cho đến
khi bề mặt thạch khô. Không làm khô tiếp. Cũng có thể làm khô các đĩa thạch
bằng cách mở một nửa nắp để trong buồng sấy an toàn 30 min, hoặc đậy nắp để qua
đêm.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5.4.
Thạch dinh dưỡng
5.4.1. Thành phần
Cao thịt 3,0
g
Pepton 5,0
g
Thạch 9
g đến 18 g a
Nước 1
000 ml
a Tùy thuộc vào sức
đông của thạch.
5.4.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần
hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH
sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khử trùng 15 min
trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121oC.
5.4.3. Chuẩn bị các
đĩa thạch dinh dưỡng
Chuyển vào mỗi đĩa
Petri khoảng 15 ml môi trường đã làm tan chảy và làm nguội đến nhiệt độ khoảng
từ 44oC đến 47oC (6.5) và để cho đông đặc.
Ngay trước khi sử
dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới,
để vào tủ sấy (6.2) ở nhiệt độ từ 25oC đến 50oC cho đến
khi bề mặt thạch khô. Không làm khô tiếp. Cũng có thể làm khô các đĩa thạch
bằng cách mở một nửa nắp để trong buồng sấy an toàn 30 min, hoặc đậy nắp để qua
đêm.
Nếu đã chuẩn bị trước
thì các đĩa thạch chưa khô có thể được bảo quản đến 2 tuần trong các túi chất
dẻo để nơi tối hoặc để trong các vật chứa khác có thể giữ được độ ẩm, để trong
tủ lạnh ở 3oC ± 2oC.
5.5.
Môi trường trypton/tryptophan
5.5.1. Thành phần
Trypton 10,0
g
Natri clorua 5,0
g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước
1 000 ml
5.5.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành
phần trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH (6.6) sao cho sau khi khử
trùng pH là 7,5 ± 0,2 ở 25oC.
Phân phối các lượng 5
ml môi trường thu được sang các ống nghiệm hoặc chai (6.7) có dung tích thích
hợp. Khử trùng môi trường này 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121oC.
5.6.
Thuốc thử indol Kovacs
5.6.1. Thành phần
4-Dimetylaminobenzaldehyt
5,0 g
2-Metylbutan-1-ol
hoặc pentan-1-ol 75,0
ml
Axit clohydric (r20 = 1,18 g/ml đến
1,19 g/ml) 25,0 ml
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Hòa tan 4-Dimetylaminobenzaldehyt
trong cồn, làm ấm trên nồi cách thủy (6.5) được duy trì ở khoảng 44oC
đến 47oC, nếu cần. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung thêm axit
clohydric. Bảo quản trong chai màu nâu tránh ánh sáng và để ở 3oC ± 2oC.
Thuốc thử này phải có
màu vàng nhạt đến màu nâu nhạt và không có kết tủa.
5.7.
Các hạt từ tính miễn dịch kháng Escherichia coli O157
Các hạt từ tính miễn
dịch này được phủ các kháng thể đặc hiệu với E.coli O157 để cô đặc và
tách các vi sinh vật này.
CHÚ THÍCH: Các nguồn
này có bán sẵn. Cần tuân thủ chặt chẽ các hướng dẫn của nhà sản xuất về việc
chuẩn bị để sử dụng.
5.8.
Dung dịch đệm rửa: Dung dịch đệm phosphat cải biến 0,01 mol/l, pH 7,2
5.8.1. Thành phần
Natri clorua 8,0
g
Kali clorua 0,2
g
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Kali dihydro
phosphat (khan) 0,24
g
Polyoxyetylen
sorbitan monolaurat (xiro Tween 20) 0,2 ml
Nước 1
000 ml
5.8.2. Chuẩn bị
Hòa tan các thành
phần trên trong nước. Chỉnh pH (6.6) đến 7,2 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần.
Phân phối môi trường
vào các bình cầu hoặc chai (6.7) với các lượng thích hợp cho sử dụng.
Khử trùng 15 min
trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121oC. Dung dịch này có thể bị đục nhưng
khi để yên sẽ trong. Có thể sử dụng dung dịch đệm phosphat bán sẵn có cùng
thành phần và cùng tính năng sử dụng.
5.9.
Dung dịch muối thông thường
5.9.1. Thành phần
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nước 1
000 ml
5.9.2. Chuẩn bị
Hòa tan natri clorua
trong nước. Phân phối môi trường vào các bình cầu hoặc chai (6.7) với các lượng
thích hợp cho sử dụng.
Khử trùng 15 min
trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121oC.
5.10.
Kháng huyết thanh Escherichia coli O157, có sẵn từ các phòng thử
nghiệm chuyên môn hoặc từ các nguồn bán sẵn ở thể “O” 157 riêng biệt.
Kháng huyết thanh phải
được kiểm tra bằng các kiểm chứng dương tính và âm tính trước khi sử dụng với
các chủng phân lập chưa biết.
6. Thiết bị và dụng
cụ thủy tinh
Sử dụng các thiết bị,
dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ
thể như sau:
6.1. Thiết bị để khử
trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.2. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có
khả năng duy trì nhiệt độ ở khoảng từ 25oC đến 50oC.
6.3. Tủ ấm, có khả năng duy trì ở
37oC ± 1oC.
6.4. Tủ ấm, có khả năng duy trì ở
41,5oC ± 1oC.
6.5. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì
nhiệt độ ở khoảng từ 44oC đến 47oC.
6.6. Máy đo pH, có đọc đến 0,01 đơn
vị pH ở 25oC, có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.
6.7. Ống nghiệm, bình
cầu hoặc
chai có dung tích thích hợp, để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi
cấy và ủ môi trường lỏng.
6.8. Ống đong, có dung tích thích
hợp để chuẩn bị các dung dịch pha loãng và môi trường hoàn chỉnh.
6.9. Pipet chia độ xả
hết, dung
tích danh định 1 ml và 10 ml được chia độ đến 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng.
6.10. Que cấy vòng và
que cấy, bằng
platin/iridi hoặc niken/crom hoặc pipet Pasteur hoặc que cấy vòng dùng
một lần.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.12. Thiết bị tách
bằng từ tính có giá đỡ từ để cô đặc các hạt từ miễn dịch, để sử dụng với các ống
nghiệm bằng chất dẻo Eppendorf (6.13).
6.13. Ống nghiệm bằng
chất dẻo kiểu Eppendorf, có nắp vặn, vô trùng, sử dụng một lần, kiểu ly tâm, có
dung tích 1,5 ml thích hợp với giá đỡ từ tính.
Tránh sự tạo thành
bọt khí khi mở.
6.14. Bộ trộn quay (kiểu máy nghiền
quay, máy trộn mẫu huyết), có khả năng quay với tốc độ 15 vòng/min đến 20
vòng/min.
6.15. Đĩa Petri, có đường kính từ 90
mm đến 140 mm.
6.16. Máy trộn
Vortex.
7. Lấy mẫu
Điều quan trọng là
mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay
đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Nên làm nguội nhanh
mẫu trước khi bảo quản.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo
các tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan. Nếu không có các
tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề
này.
9. Cách tiến hành (xem Phụ lục A)
9.1.
Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu
Xem TCVN 6507-1 (ISO
6887-1) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.
CHÚ THÍCH: Các phần
khác của TCVN 6507 (ISO 6887), xem Thư mục tài liệu tham khảo.
Nhìn chung, để chuẩn bị
huyền phù ban đầu, cho x g hoặc x ml phần mẫu thử vào 9x ml
hoặc 9x g canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N)
(5.1), đã được làm ấm sơ bộ trong tủ ấm (6.4) ở 41,5oC để thu được
tỷ lệ của phần mẫu thử và mTSB + N là 1/10 (khối lượng/thể tích hoặc thể
tích/thể tích).
Nên sử dụng các túi
nhu động có mắt lưới để giảm việc gây nhiễu của thực phẩm dạng hạt gắn bộ thử
hút miễn dịch (9.3).
9.2.
Tăng sinh
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Việc tách từ miễn
dịch và cấy lên đĩa thạch chọn lọc sau khi ủ 6 h có thể cho các kết quả dương
tính giả, sau khi ủ tiếp 18 h có thể trở thành âm tính.
9.3.
Tách bằng từ miễn dịch (IMS)
9.3.1. Khái quát
Sau khi ủ từ 12 h đến
18 h thì cứ sau 6 h có thể tiến hành IMS, nếu cần.
Các chỉ dẫn dưới đây
là để hướng dẫn chung và có thể chưa hoàn chỉnh đến mọi chi tiết. Do đó, cần
tuân theo các hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến cách tiến hành và phương
pháp sử dụng các bộ thử bắt giữ miễn dịch và thiết bị cần thiết.
9.3.2. Bắt giữ miễn
dịch
CẢNH BÁO - Sử dụng kỹ
thuật vô trùng để tránh mọi nhiễm bẩn từ bên ngoài và việc tạo bọt khí. Thực
hiện thủ tục này trong tủ an toàn, nếu có sẵn. Mang găng tay bảo vệ.
Việc sử dụng thiết bị
tách bằng từ tính (6.12) và các hạt từ miễn dịch được phủ kháng thể (5.7), cần
thực hiện quy trình bắt giữ/tách dưới đây:
Trộn dịch cấy tăng
sinh (9.2) và để cho nguyên liệu thô lắng xuống. Cho 20 µl các hạt từ miễn dịch
đã chuẩn bị (5.7) ở nhiệt độ phòng vào ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu Eppendoft
(6.13). Lấy 1 ml dịch lỏng phía trên dịch cấy tăng sinh, nếu có thể, tránh hết
các hạt thực phẩm hoặc chất béo, cho vào ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu
Eppendoft.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.3.3. Tách
Đặt từng ống nghiệm
bằng chất dẻo kiểu Eppendoft (xem 9.3.2) vào giá từ (6.12) và để cho các hạt từ
dính kết dựa vào nam châm bằng cách dịch chuyển nhẹ nhàng giá từ qua lại 180o.
Mở nắp cẩn thận mà không làm nhiễu loạn các hạt trên thành ống. Dùng pipet
Pasteur vô trùng mới (6.10) cho mỗi mẫu và với ống nghiệm vẫn còn trong giá từ,
loại bỏ dung dịch bằng cách hút từ từ dịch lỏng từ dưới đáy ống nghiệm. Thêm 1
ml dung dịch đệm rửa vô trùng (5.8) và đậy nắp. Lấy nam châm ra khỏi giá. Trộn
phần chứa trong ống bằng cách đảo nhẹ nhàng giá qua 180o và đặt nam
châm trở lại giá.
Chú ý để tránh làm
nhiễm bẩn chéo khi bổ sung dung dịch đệm mới.
Tiến hành như trên,
sử dụng pipet Pasteur mới cho mỗi mẫu để loại bỏ dịch rửa. Lặp lại quy trình rửa
vài lần.
Lấy ra khỏi thiết bị
tách từ tính và cho 100 µl dung dịch đệm rửa vô trùng (5.8) vào ống nghiệm và
hòa lại các hạt từ tính.
CHÚ THÍCH: Quy trình này
có thể gặp phải khó khăn đối với các sản phẩm chất béo hoặc phomat tươi.
9.4.
Cấy lên đĩa thạch chọn lọc và nhận dạng các khuẩn lạc E.coli O157
9.4.1. Cấy lên đĩa
Sử dụng ống hút kiểu
cơ học (6.11), chuyển 50 µl các hạt từ tính đã hòa lại và đã rửa (9.3.3) vào
đĩa thạch MacConkey sorbitol telurit (5.2) đã làm khô sơ bộ và 50 µl vào đĩa
môi trường phân lập thứ hai (5.3) đã làm khô sơ bộ.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ủ ấm (theo 6.3) môi
trường CT-SMAC (5.2) ở 37oC trong 18 h đến 24 h và ủ môi trường thạch
chọn lọc thứ hai ở nhiệt độ khuyến cáo và thời gian quy định.
Tùy thuộc vào kiểu
loại mẫu thực phẩm và hệ vi khuẩn của mẫu, mà việc ủ canh thang tăng sinh trong
20 h đến 24 h có thể làm tăng việc mọc dày các vi khuẩn khác trên các đĩa thạch
chọn lọc làm cho việc phát hiện ra các khuẩn lạc E.coli O157 gặp phải
khó khăn. Việc nuôi cấy các đĩa thạch chọn lọc với các dung dịch pha loãng của IMS
hoặc các thể tích nhỏ hơn 50 µl trên một đĩa, có thể làm tăng cơ hội thu được
các khuẩn lạc tách biệt của E.coli O157, nhưng chú ý rằng điều này cũng có
thể làm tăng giới hạn phát hiện.
9.4.2. Thừa nhận các
khuẩn lạc E.coli O157 điển hình
Các khuẩn lạc điển
hình là trong suốt và gần như không màu, có viền ngoài màu vàng nâu nhạt và đường
kính xấp xỉ 1 mm khi ở trên thạch CT-SMAC.
Kiểm tra các khuẩn
lạc điển hình của E.coli O157 trên môi trường thạch phân lập chọn lọc
thứ hai theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
9.5.
Khẳng định
CHÚ THÍCH: Có thể sử
dụng các bộ thử nhỏ nhận dạng bằng sinh hóa bán sẵn để nhận dạng E.coli dương
tính indol và âm tính sorbitol và các bộ thử kết dính keo tổng hợp về E.coli
O157, với điều kiện là các phép thử thích hợp đã có các chủng âm tính và dương
tính biết trước đã được thực hiện để khẳng định tính năng.
9.5.1. Chọn khuẩn lạc
Từ mỗi đĩa lấy năm khuẩn
lạc điển hình, như đã chọn trong 9.4. Nếu như trên đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc
thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt để kiểm tra.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Ủ (trong tủ ấm 6.3) các
đĩa trong 18 h đến 24 h ở 37oC.
Chỉ sử dụng các khuẩn
lạc thuần khiết từ đĩa thạch dinh dưỡng cho các phép thử trong 9.5.2 và 9.5.3.
9.5.2. Khẳng định
bằng sinh hóa: sinh indol
Cấy một khuẩn lạc từ
dịch cấy thuần khiết trên đĩa thạch dinh dưỡng (9.5.1) vào ống đựng môi trường
trypton/tryptophan (5.5).
Ủ (trong tủ ấm 6.3) ở
37oC trong 24 h.
Thêm 1 ml thuốc thử
Kovac’s (5.6) và để yên 10 min ở nhiệt độ phòng.
Việc hình thành màu
đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng/nâu chứng tỏ phản ứng âm tính.
9.5.3. Nhận dạng bằng
huyết thanh
9.5.3.1. Khái quát
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.5.3.2. Loại bỏ các
vi khuẩn phân lập tự kết dính
Cho một giọt dung dịch
nước muối (5.9) lên một phiến kính thủy tinh sạch.
Dùng vòng cấy (6.10),
trộn trong giọt nước muối này một khuẩn lạc lấy từ đĩa thạch dinh dưỡng (9.5.1)
sao cho thu được huyền phù đục và đồng nhất.
Di chuyển phiến kính
nhẹ nhàng trong 30 s đến 60 s. Quan sát kết quả thu được dựa vào nền màu đen và
dùng kính lúp, nếu cần.
Nếu huyền phù tạo thành
các mảng có thể nhìn thấy, thì chủng đó được coi là tự kết dính và không được
dùng để kiểm tra tiếp, vì không thể xảy ra phản ứng với kháng huyết thanh cụ
thể.
9.5.3.3. Phản ứng kháng
huyết thanh E.coli O157
Sử dụng một khuẩn lạc
thuần khiết từ thạch dinh dưỡng (9.5.1), hòa trong một giọt nước muối mới như trong
9.5.3.2 và thêm một giọt kháng huyết thanh E.coli O157 (5.10).
Nếu trong vòng 1 min
thấy xuất hiện dinh kết, thì phản ứng là dương tính.
9.5.3.4. Nhận dạng dương
tính
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9.6.
Đặc trưng khác
Để nhận dạng các đặc
khuẩn lạc dương tính cho việc phát hiện các kháng nguyên roi và các đặc tính
gây bệnh, cần gửi các chủng này đến phòng thử nghiệm chuẩn.
10.
Đảm bảo chất lượng
10.1. Kiểm tra các
chủng về mục đích đảm bảo chất lượng
Các chủng E.coli O157
không mang các yếu tố độc thuộc loại gây bệnh đều có sẵn từ cơ quan lưu giữ vi
khuẩn quốc tế hoặc quốc gia. Các chủng này được dùng để kiểm tra về đảm bảo
chất lượng môi trường và kháng huyết thanh.
10.2. Phương pháp cấy
Để kiểm tra khả năng
của phòng thử nghiệm và môi trường để phát hiện số lượng nhỏ Escherichia
coli O157 trong các mẫu thực phẩm cần thử nghiệm bằng phương pháp mô tả
trong tiêu chuẩn này, thì các mẫu đối chứng có lượng nhỏ dịch cấy E.coli O157
không gây bệnh và lượng lớn dịch cấy của chủng E.coli khác cần được thực
hiện song song với mẫu thử.
11.
Biểu thị kết quả
Theo phần diễn giải
các kết quả, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Escherichia coli O157 trong
phần mẫu thử, tính theo gam hoặc tính theo mililit.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Báo cáo thử nghiệm phải
ghi rõ:
a) mọi thông tin cần
thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy
mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã
sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) nhiệt độ ủ đã sử
dụng;
e) mọi chi tiết thao tác
không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết
bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
f) các kết quả thử
nghiệm thu được;
Báo cáo kết quả cũng phải
nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn,
hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Sơ đồ cách tiến hành
Thư
mục tài liệu tham khảo
[1] DOYLE M.P. and
SCHOENI J.L. Appl. Environ. Microbiol. 53, 1987, pp. 2394-2396.
[2] ZADIK P.M.,
CHAPMAN P.A. and Siddons J. Med. Microbiol., 39, 1993, phương
pháp. 155-158.
[3] TCVN 6507-2 (ISO
6887-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử,
huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật -
Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị thịt và sản phẩm thịt.
[4] TCVN 6507-3 (ISO
6887-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền
phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Phần
3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản.
[5] TCVN 6507-4 (ISO
6887-4), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền
phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Phần
4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm khác với sữa và sản phẩm sữa,
thịt và sản phẩm thịt, thủy sản và sản phẩm thủy sản.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66