Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6265:1997 sữa và các sản phẩm sữa - định lượng đơn vị khuẩn lạc

• Số hiệu: TCVN6265:1997
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 1997

Bột cao men                                                                              5,0 g Dextroza (C6H12O6)                                                                     20,0 g Thạch                                                                                       10 g đến 15 g^1) Nước                                                                                        900 ml

^1) Tuỳ theo độ đông của thạch

5.6.1.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 6,6, ở 25^oC.

Khử trùng bằng hấp trong nồi hấp áp lực (6.1 ) ở 121^oC ± 1^oC khoảng 15 phút.

5.6.2. Dung dịch oxitetraxiclin

5.6.2.1. Thành phần

Oxitetraxiclin hidroclorua (C₂₂H₃₀N₂O₁₁) . HCl                                 50 mg

Nước                                                                                       50 ml

6.2.2. Chuẩn bị

Hoà tan oxitelraxiclin trong nước. Chuẩn bị dung dịch mới trước mỗi lần sử dụng. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc.

...

...

...

5.6.3.1. Thành phần

Oxitetraxiolin hidroclorua                                                            10 ml

Môi trường cơ bản                                                                    90 ml

5.6.3.2. Chuẩn bị

Làm nguội môi trường cơ bản đã khử trùng (5.6.1) tới 45^oC. Ngay trước khi sử dụng, đưa dung dịch oxitetraxiclin (5.6.2) về 45^oC và cho 10 ml dung dịch này vào 90 ml môi trường cơ bản.

5.7. Môi trường cao men / dextroza / cloramphenicol / thạch

5.7.1. Thành phần

Bột cao men                                                                              5,0 g

Dextroza (C₆H₁₂O₆)                                                                     20,0 g

...

...

...

Thạch                                                                                       12 đến 15 g₂₎

Nước                                                                                        1000 ml

^1) Để thu được nồng độ cuối cùng của môi trường là 100 mg/ml.

^2) Tuỳ theo độ đông của thạch.

5.7.2. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,6, ở 25^oC. Phân phối môi trường thạch vào các hộp đựng thích hợp (6.8).

Khử trùng bằng hấp trong nồi hấp áp lực (6.1), ở 121^oC ± 1^oC 15 phút .

6. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

...

...

...

Chú thích 3 - Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thuỷ tinh sử dụng nhiều lần, nếu như nó phù hợp với các yêu cầu qui định.

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử và các dung dịch pha loãng theo qui định của TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) và đặc biệt là:

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp), xem ISO 7218.

6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 25^oC ± 1^oC.

6.3. Đĩa Petri, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.4. Pipet chia độ, được nhét nút bông, đã hiệu chỉnh dung tích 1 ml ± 0,02 ml hoặc 10 ml ± 0,2 ml hoặc 11 ml ± 0,2 ml.

6.5. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động ở 45^oC ± 1^oC.

6.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm một bộ phận chiếu sáng có nến đen, được gắn với kính lúp có độ khuếch đại 1,5 lần và có một dụng cụ đếm cơ hoặc điện tử.

6.7. pH mét bù nhiệt, chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH, ở 25^oC.

...

...

...

Chú thích 3 - Có thể dùng chai hoặc bình có nắp xoáy, bằng kim loại không độc.

7. Lấy mẫu.

Lấy mẫu theo ISO 707.

Chú thích 4 - Khi phomát đã phủ kín nấm men và nấm mốc thì phải loại bỏ lớp phủ khỏi mẫu thử. Trog những trường hợp như thế phải dùng dao đã khử trùng để cắt bỏ lớp vỏ trước khi lấy mẫu.

8. Cách tiến hành.

Chú thích 5 - Để tăng độ chính xác của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cẩn thận. Những yếu tố tác động đến độ chính xác là:

- Kiểu loại thiết bị khuấy trộn;

- Thời gian khuấy trộn:

- Chất pha loãng:

...

...

...

- Thời gian trộn cho phép khi chuẩn bị các dung dịch loãng thập phân.

Chú ý - Phải thực hiện các thao tác vô trùng thông thường. Những thao tác qui định trong 8.1 và 8.2 không được tiến hành dưới ánh nắng mặt trời.

8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

8.2. Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Xem

TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

8.3. Thời gian tiến hành

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989); 8.3.

8.4. Cấy và nuôi ấm

...

...

...

8.4.2. Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng.

Dùng một pipet vô trùng khác, cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10^-1 (sản phầm ở dạng lỏng), hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10^-2 (sản phầm ở dạng khác).

8.4.3. Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

8.4.4. Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường chứa oxitetraxiclin (5.6), hoặc môi trường chứa cloramphenicol (5.7) đã được làm cho nóng chảy từ trước và giữ ở 45^oC trong nồi cách thủy (6.5).

8.4.5. Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt các đĩa Petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát.

8.4.6. Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy với môi trường không được vượt quá 15 phút.

8.4.7. Chuẩn bị đủ số đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng.

8.4.8. Lật ngược các đĩa đã cấy xong (8.4.5) và đặt chúng vào tủ ấm (6.2) 4 ngày, ở nhiệt độ 25^oC.

Chú thích 6 - Để tránh hiện tượng lan rộng cần phải để phòng như sau:

...

...

...

- Nhỏ thêm một giọt glixerol lên trên giấy lọc của nắp đĩa.

8.4.9. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau, cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm.

8.5. Đọc kết quả

8.5.1. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa; tránh đếm nhầm các khuẩn lạc mọc bất thường. Nếu cần, phân biệt các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc dựa trên cơ sở đặc tính hình thái sinh vật. Xem 8.6.

8.5.2. Chỉ giữ lại các đĩa có từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Nếu các phần của đĩa bị nấm móc che phủ; hoặc nếu khô có thể đếm các khuẩn lạc riêng biệt, thì đếm các khuẩn lạc trong các đĩa có độ pha loãng cao hơn tiếp theo, thậm chí số khuẩn lạc đó có thể ít hơn 10. Trong trường hợp như thế tiến hành theo 9.2.

8.6. Khẳng định

Phân biệt các chấm đen hoặc các khuẩn lạc nghi ngờ bằng cách kiểm tra qua kính hiển vi. Nếu cần, khẳng định ít nhất là các khuẩn lạc xác định bằng kính hiển vi, trong đó n là số khuẩn lạc đếm được.

9. Biểu thị kết quả

9.1. Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 150 khuẩn lạc.

...

...

...

Trong đó

N =

∑c là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại;

n₁ là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc; n₂ là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

Chú thích 7 - Nếu có nhiều hơn hai độ pha loãng có thể đếm được, cho kết quả từ 10 đến 150 khuẩn lạc thì công thức phải được sửa đổi, có tính đến những độ pha loãng tiếp theo đó. Với ba độ pha loãng thì theo công thức:

N =

Trong đó

N₃ là số đĩa của độ pha loãng thứ 3 được giữ lại, có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc.

...

...

...

28.500 làm tròn thành 28.000, và 11.500 được làm tròn thành 12.000.

Lấy kết quả là số CFU nấm mốc và / hoặc nấm men có trong 1 mililít hoặc trong 1 gam sản phẩm, biểu thị bầng số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10.

Thí dụ:

Việc đếm khuẩn lạc CFU của nấm men và/ hoặc nấm mốc cho kết quả sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng đã được ủ):

- Độ pha loãng thứ nhất (10^-2) được giữ lại chứa 83 và 97 khuẩn lạc

- Độ pha loãng thứ hai (10^-3) được giữ lại chứa 33 và 28 khuẩn lạc

N =

Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên (9.1) thu được 11.000 hoặc 11 x 10^4 CFU của nấm men và / hoặc nấm mốc có trong một gam, hoặc một milillt sản phẩm.

9.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau:

...

...

...

- Ít hơn 10 x 1/d CFU của nấm men và / hoặc nấm mốc có trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của chất huyền phù ban đầu.

9.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 150 khuẩn lạc thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 150 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của hệ số pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc CFU nấm men và / hoặc nấm mốc ước tính trong một gam hoác một mililít sản phẩm”

10. Độ lặp lại

Độ chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm, dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá 30% của kết quả thấp hơn.

Chú thích

8) Nếu các trường hợp không thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại là 5%, hoặc lớn hơn thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng gây ra sai lỗi.

9) Định nghĩa về độ lặp lại xem TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725).

11. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng, kết quả thử nghiệm thu được và phương pháp biểu thị đã sử dụng. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tuỳ ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

...

...

...