Tripton
Cao men
Glucoza ngậm 1 phân
tử nước (C6H12O6.H2O)
Sữa bột gầy[1])
Thạch
Nước
|
5,0 g
2,5 g
1,0 g
1,0 g
10 g đến 15 g 2)
1 000 ml
|
1) Sữa bột gầy không được chứa các chất ức chế. Điều này phải được kiểm
tra bằng thử so sánh dùng sữa bột gầy đã biết trước là không chứa các chất
này.
2) Tùy theo độ đông của thạch.
|
5.6.2. Chuẩn bị
5.6.2.1. Chuẩn bị từ
môi trường hoàn chỉnh khô thương phẩm
Tiến hành theo hướng
dẫn của nhà sản xuất, nhưng trong mọi trường hợp, phải cho thêm sữa bột gầy,
ngay cả khi nhà sản xuất coi việc thêm như vậy là không cần thiết.
Nếu cần, chỉnh pH để
sau khi khử trùng, pH là 7,0, ở 250C.
5.6.2.2. Chuẩn bị từ
các thành phần chính khô
Hòa tan và phân tán
trong nước theo trình tự sau: cao men, tripton, glucôza và cuối cùng là sữa bột
gầy. Nước được hâm nóng sẽ giúp cho việc hòa tan tốt hơn.
Cho thêm thạch và đun
sôi, khuấy đều cho đến khi thạch tan hoàn toàn, hoặc đun nóng trong nồi hơi
nước trong khoảng 30 phút. Nếu cần, dùng giấy lọc để lọc.
Nếu cần, chỉnh pH,
sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0, ở 250C.
5.6.2.3. Phân phối,
khử trùng và bảo quản
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Khử trùng bằng nồi hấp (6.1) ở 1210C
± 10C trong 15 phút. Nếu môi trường dùng ngay thì làm nguội đến 450C
trong nồi cách thủy (6.5). Nếu không dùng ngay, trước khi bắt đầu tiến hành thử
nghiệm vi sinh, để tránh mọi sự chậm trễ khi rót môi trường, làm tan chảy hoàn
toàn môi trường trong nồi cách thủy nóng (6.6), sau đó làm nguội đến 450C
trong nồi cách thủy (6.5).
Chú thích
1) Để kiểm tra được nhiệt độ của
thạch, đặt một nhiệt kế vào một lượng dung dịch 15g/l thạch được đựng trong một
bình riêng biệt giống hệt loại bình để đựng môi trường. Dung dịch kiểm tra
nhiệt độ này phải được tiến hành các thao tác tương tự về đun nóng và làm
nguội, giống như đối với môi trường nuôi cấy.
2) không được để môi trường trong
nồi cách thủy quá 3 giờ.
6. Thiết bị và
dụng cụ thủy tinh
Chú ý - Phải khử trùng tất
cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, với chất pha loãng, với dung dịch pha
loãng, hoặc với môi trường nuôi cấy phù hợp với TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 :
1989) (6.1).
Chú thích 3 - Có thể dùng các dụng
cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thủy tinh có thể sử dụng nhiều lần,
nếu như nó phù hợp với các yêu cầu quy định.
Sử dụng các thiết bị thông thường
của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử và các
dung dịch pha loãng theo quy định của TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) và đặc
biệt là:
6.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò
sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp), xem ISO 7218.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6.3. Đĩa Petri, làm bằng thủy tinh
hoặc chất dẻo, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.
6.4. Pipet chia độ, được nhét nút
bông, đã hiệu chỉnh dung tích 1 ml ± 0,02ml, hoặc 10 ml ± 0,2 ml.
6.5. Nồi cách thủy, có khả năng
hoạt động ở 450C ± 10C.
6.6. Nồi cách thủy, có khả năng
hoạt động từ 1000C trở lên.
6.7. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao
gồm một bộ phận chiếu sáng có nền đen, được gắn với kính lúp có độ khuếch đại
1,5 lần và có một dụng cụ đếm cơ hoặc điện tử.
6.8. pH mét bù nhiệt, chính xác tới
± 0,1 đơn vị pH, ở 250C.
6.9. Ống nghiệm có dung tích khoảng
20 ml (hoặc bình, lọ có dung tích tương tự) và lọ hoặc bình có dung tích từ 150
ml đến 250 ml, dùng để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy.
Chú thích 4 - Có thể dùng lọ hoặc
bình có nắp xoáy, bằng kim loại không độc.
Lấy mẫu theo ISO 707.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Chú thích 5 - Để tăng độ chính xác
của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cẩn
thận. Những yếu tố tác động đến độ chính xác là:
- kiểu loại thiết bị khuấy trộn;
- thời gian khuấy trộn;
- chất pha loãng;
- thời gian để cho các hạt to lắng
xuống;
- thời gian khuấy cho phép khi
chuẩn bị các dung dịch loãng theo hệ thập phân.
Chú ý - Phải thực hiện các thao tác
vô trùng thông thường. Những thao tác quy định trong 8.1 và 8.2 không được tiến
hành dưới ánh nắng mặt trời.
8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch
pha loãng ban đầu
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 :
1989).
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 :
1989).
8.3. Thời gian tiến hành
Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989),
8.3.
8.4. Cấy và nuôi ấm
8.4.1 Lấy hai đĩa Petri (6.3) vô
trùng. Dùng một pipet vô trùng (6.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử, nếu là dạng
lỏng, hoặc 1 ml chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác.
8.4.2. Lấy tiếp hai đĩa Petri vô
trùng. Dùng một pipet vô trùng khác cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10-1
(sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10-2 (sản
phẩm ở dạng khác).
8.4.3. Nếu cần, lặp lại thao tác
này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.
8.4.4. Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng
từ 12 ml đến 15 ml môi trường nuôi cấy (5.6), đã được làm cho tan chảy từ trước
và giữ ở 450C trong nồi cách thủy (6.5).
8.4.5. Khuấy trộn thật kỹ chất cấy
với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách
đặt các đĩa Petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
8.4.7. Chuẩn bị đủ số đĩa đối chứng
để kiểm tra độ vô trùng.
8.4.8. Lật ngược các đĩa đã cấy
xong và đặt chúng vào tủ ấm (6.2), đặt ở nhiệt độ 300C trong 72 h ±
3 h.
Chú thích 6 - Để ngăn hiện tượng
lan rộng cần phải đề phòng như sau:
- phủ thêm một lớp môi trường nuôi
cấy lên trên mặt các đĩa cấy sau khi đã đông đặc, hoặc
- nhỏ thêm một giọt glixerol lên
giấy lọc ở nắp của đĩa.
8.4.9. Không chồng quá 6 đĩa lên
nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm.
8.5. Đọc kết quả
8.5.1. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi
đĩa (xem 9.1) sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.7).
Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu.
Điều này rất quan trọng vì những chấm khuẩn lạc nhỏ cũng phải được đếm, nhưng
điều cơ bản là người kỹ thuật viên phải tránh lẫn lộn các hạt nhỏ không tan
hoặc các chất kết tủa trong đĩa với khuẩn lạc nhỏ. Kiểm tra thật cẩn thận các
đốm còn nghi ngờ, dùng kính lúp có độ khuếch đại cao hơn nếu thấy cần, để phân
biệt được khuẩn lạc với các chất lạ.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
9. Biểu thị kết
quả
9.1. Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất
là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 300 khuẩn lạc.
Tính số vi sinh vật CFU từ các vi
sinh vật, N, trong 1 gam hoặc trong 1 mililít sản phẩm, theo công thức:
trong đó:
åC
là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại;
n1 là số đĩa của độ pha
loãng thứ nhất, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;
n2 là số đĩa của độ pha
loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;
d là hệ số pha loãng tương
ứng với độ pha loãng thứ nhất.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
trong đó:
n3 là số đĩa của độ pha
loãng thứ 3 được giữ lại, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
Làm tròn số kết quả thu được đến 2
chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn là 5 mà không có chữ số có nghĩa nào đứng
theo sau thì làm tròn số đứng trước chữ số 5 cho thành số chẵn. Thí dụ: 28 500
làm tròn thành 28 000, và 11 500 được làm tròn thành 12 000.
Lấy kết quả là số đơn vị khuẩn lạc
CFU của vi sinh vật trong 1 mililít hoặc trong 1 gam sản phẩm, biểu thị bằng
một số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng
của 10.
Thí dụ:
Việc đếm khuẩn lạc vi sinh vật ở 300C
cho kết quả sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng đã được ủ):
- độ pha loãng thứ nhất (10-2)
được giữ lại, chứa 168 và 215 khuẩn lạc
- độ pha loãng thứ hai (10-3)
được giữ lại, chứa 14 và 25 khuẩn lạc
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên
thu được 19 000 hoặc 1,9 x 104 CFU vi sinh vật trong một gam hoặc
trong một mililít sản phẩm.
9.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với
mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít
hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau:
- ít hơn 10 vi sinh vật CFU trong
một mililít (sản phẩm lỏng).
- ít hơn 10 x 1/d vi sinh vật CFU
trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng
của huyền phù ban đầu.
9.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa
nhiều hơn 300 khuẩn lạc, thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc
gần 300 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất. Báo
cáo kết quả theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật ước tính trong một gam
hoặc một mililít sản phẩm”.
10. Độ lặp lại
Độ chênh lệch tuyệt đối giữa kết
quả thu được từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp,
phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một
phòng thí nghiệm dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không
được vượt quá 30% của kết quả thấp hơn.
Chú thích
8) Nếu các trường hợp không thỏa mãn
yêu cầu về độ lặp lại là 5%, hoặc lớn hơn thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng
gây ra sai lỗi.
...
...
...
Bạn phải
đăng nhập hoặc
đăng ký Thành Viên
TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.
Mọi chi tiết xin liên hệ:
ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
11. Báo cáo
kết quả
Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương
pháp đã sử dụng, kết quả thử nghiệm thu được và phương pháp biểu thị đã sử
dụng. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong
tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có
thể ảnh hưởng tới kết quả.
Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả
mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.