Thuộc tính
Nội dung
Tiếng Anh (English)
Văn bản gốc/PDF
Lược đồ
Liên quan hiệu lực
Liên quan nội dung
Thuộc tính
Tải về
Các bản dự thảo

Đang tải văn bản...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9711:2013 Thực phẩm - fumonisin B1 và B2 trong thực phẩm từ ngô - Phương pháp HPLC

Số hiệu:	TCVN9711:2013	Loại văn bản:	Tiêu chuẩn Việt Nam
Nơi ban hành:	***	Người ký:	***
Ngày ban hành:	Năm 2013	Ngày hiệu lực:
ICS:	67.060	Tình trạng:	Đã biết

Dung dịch chuẩn hỗn hợp	Thể tích lấy từ dung dịch gốc hỗn hợp, ml	Thể tích dung dịch axetonitril-nước cần bổ sung, ml	Nồng độ fumonisin cuối cùng của dung dịch chuẩn hỗn hợp, ng/ml
Dung dịch chuẩn hỗn hợp	Thể tích lấy từ dung dịch gốc hỗn hợp, ml	Thể tích dung dịch axetonitril-nước cần bổ sung, ml	FB₁	FB₂
1	50	4 950	0,10	0,050
2	125	4 875	0,25	0,125
3	500	4 500	1,00	0,500
4	1 000	4 000	2,00	1,000

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường

Và cụ thể như sau:

5.2. Máy lắc tròn.

5.3. Bình ly tâm, dung tích 250 ml, có nắp vặn.

5.4. Máy ly tâm, có thể tạo lực ly tâm lên đến 2 500 g.

5.5. Giấy lọc, có cỡ lỗ 20 mm đến 25 mm.

5.6. Giấy lọc vi sợi thủy tinh, có cỡ lỗ 11 mm.

5.7. Bầu chứa, dung tích 25 ml có bộ nối đầu tip dùng cho cột ái lực miễn nhiễm (IAC).

...

Bạn phải đăng nhập hoặc đăng ký Thành Viên TVPL Pro để sử dụng được đầy đủ các tiện ích gia tăng liên quan đến nội dung TCVN.

Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66

5.9. Cân phòng thử nghiệm, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

5.10. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.11. Bộ cấp chân không để điều tiết cột ái lực miễn nhiễm.

5.12. Máy trộn Vortex.

5.13. Bộ cô dung môi, có modul nhiệt hoặc tương đương.

5.14. Bộ lọc màng, dùng để lọc nước, có cỡ lỗ 0,45 mm.

5.15. Thiết bị HPLC, bao gồm:

5.15.1. Bơm HPLC, đẳng dòng, phù hợp với tốc độ dòng không đổi, ví dụ: 1 ml/min.

5.15.2. Hệ thống bơm, có thể phân phối thể tích, ví dụ: 20 ml.

...

- được làm bằng thép không gỉ;

- dài 150 mm;

- đường kính trong 4,6 mm;

- pha tĩnh có cỡ hạt 5 mm;

- cột bảo vệ pha đảo tương ứng phù hợp.

Có thể sử dụng cột có đường kính khác.

5.15.4. Detector huỳnh quang, được gắn với cuvet dòng chảy và cài đặt ở bước sóng 335 nm (kích thích) và 440 nm (phát xạ). Có thể phát hiện được ít nhất 0,5 ng FB₁ và FB₂ (tín hiệu/nhiễu = 3).

5.15.5. Hệ thống phân tích dữ liệu.

6. Lấy mẫu

...

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền mẫu cho qua sàng 1 mm và đồng nhất mẫu.

7.2. Chiết

Cân 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình ly tâm 250 ml (5.3) và thêm 50 ml dung môi chiết (4.14). Đậy bình ly tâm và lắc trong 20 min bằng máy lắc tròn (5.2). Ly tâm bằng máy ly tâm (5.4) trong 10 min với gia tốc 2 500 g và lọc lớp trên qua giấy lọc (5.5), tránh để phần chất khô vào giấy lọc. Chiết lại phần chất khô còn lại bằng cách thêm 50 ml dung môi chiết vào bình ly tâm và lắc tiếp trong 20 min. Ly tâm 10 min với gia tốc 2500 g và lọc dịch chiết qua giấy lọc.

Trộn hai dịch lọc chiết được và hút 10 ml dịch lọc vào bình 100 ml. Thêm 40 ml PBS (4.16) vào 10 ml dịch lọc và trộn kỹ. Lọc dịch chiết đã pha loãng qua màng lọc vi sợi (5.6) và thu lấy 10 ml dịch lọc (tương đương 0,4 g mẫu thử) sau đó làm sạch qua cột ái lực miễn nhiễm (4.17).

7.3. Làm sạch bằng ái lực miễn nhiễm

Tháo nắp trên khỏi cột và nối với bầu chứa (5.7). Tháo nắp dưới khỏi cột và nối với bộ cấp chân không (5.11). Dùng pipet hút 10 ml phần lỏng của mẫu chiết đã lọc cho vào bầu chứa. Để dịch lọc chảy qua cột từ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây và loại bỏ dịch qua cột. Rửa cột bằng 10 ml PBS (4.16) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Loại bỏ nước rửa và đặt bình 4 ml dưới cột. Rửa giải fumonisin bằng 1,5 ml metanol (4.2), ở tốc độ dòng không quá 1 giọt mỗi giây. Dùng bộ cô (5.13) cho bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng hơi nitơ ở nhiệt độ khoảng 60 °C hoặc nhỏ hơn. Giữ lại phần cặn đã khô ở nhiệt độ khoảng 4 °C cho đến khi tạo dẫn xuất và phân tích trên HPLC.

7.4. Tạo dẫn xuất

...

Chuyển 50 ml của mỗi dung dịch chuẩn fumonisin hỗn hợp (4.22) vào đáy của ống nghiệm nhỏ và thêm 50 ml thuốc thử tạo dẫn xuất (4.19) ngay trước khi phân tích mỗi dung dịch chuẩn. Trộn đều dung dịch trong 30 s bằng máy trộn Vortex (5.12) và tiến hành tách bằng HPLC (7.5.2) ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi bổ sung thuốc thử tạo dẫn xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành dẫn xuất trong hệ thống tự động. Nồng độ fumonisin cuối cùng trong các dung dịch hiệu chuẩn được liệt kê trong Bảng 2.

Bảng 2 - Nồng độ cuối cùng của dung dịch hiệu chuẩn sau khi dẫn xuất

Dung dịch hiệu chuẩn

Nồng độ fumonisin cuối cùng trong dung dịch hiệu chuẩn (ng/ml)

FB₁

FB₂

0,050

0,025

...

0,125

0,063

0,500

0,250

1,000

0,500

7.4.2. Dung dịch mẫu thử

...

7.5. HPLC

7.5.1. Các điều kiện vận hành HPLC

Khi cột đáp ứng quy định trong 5.15.3 (kích thước 4,6 mm x 150 mm có cỡ lỗ 5 mm) và sử dụng pha động quy định trong 4.18, các thông số cài đặt như sau được cho là thích hợp:

- tốc độ dòng pha động (cột): 1,0 ml/min;

- detector huỳnh quang, bước sóng phát xạ: 440 nm;

- detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 335 nm;

- thể tích bơm: 20 ml.

7.5.2. Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn đối với FB₁ và FB₂ trong mỗi ngày phân tích hoặc khi thay đổi các điều kiện sắc ký bằng cách sử dụng dung dịch hiệu chuẩn fumonisin 1, 2, 3 và 4 theo Bảng 2.

...

Hệ số biến thiên lặp lại của các lần bơm HPLC đối với FB₁ và FB₂ phải nhỏ hơn 5 % tính trên 10 lần bơm lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp fumonisin số 3 đã tạo dẫn xuất (xem Bảng 1).

7.5.3. Dung dịch mẫu thử

Bơm ví dụ 20 ml (nghĩa là 0,02 g mẫu thử) theo 7.4.2 vào hệ thống HPLC ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi thêm thuốc thử tạo dẫn xuất (4.19).

7.5.4. Nhận biết

Nhận biết fumonisin B₁ và fumonisin B₂ bằng cách so sánh thời gian lưu của từng mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn.

Đôi khi có thể cần nhận biết pic fumonisin bằng cách bơm hỗn hợp dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

7.5.5. Xác định

Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với đường chuẩn. Đối với phép xác định này, cần chuẩn bị dung dịch có nồng độ trong dải tuyến tính để thiết lập đường hồi quy tuyến tính của đường chuẩn.

Bơm các lượng bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.

...

CHÚ THÍCH 1: Việc tuân thủ thời điểm lặp lại giữa các lần bổ sung thuốc thử tạo dẫn xuất và giữa các lần bơm vào hệ thống HPLC là rất quan trọng do huỳnh quang của dẫn xuất fumonisin giảm nhanh sau thời gian quá 3 min.

CHÚ THÍCH 2: Giới hạn phát hiện và định lượng thay đổi đáng kể theo độ nhạy của detector được sử dụng. Giới hạn định lượng 50 mg/kg đối với FB₁ và FB₂ có thể thu được với detector thông dụng nhất, dựa trên tín hiệu/nhiễu bằng 6.

CHÚ THÍCH 3: Sắc đồ điển hình của mẫu bột ngô và bánh ngô bị nhiễm tự nhiên được nêu trong Phụ lục B.

8. Tính kết quả

Ghi lại khối lượng của fumonisin (m_a) tương ứng với sự phát huỳnh quang của dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn, tính bằng nanogam.

Tính phần khối lượng của từng fumonisin trong mẫu, w_i, bằng microgam trên kilogam, sử dụng Công thức (1):

(1)

Trong đó:

m_a là khối lượng của từng fumonisin trong dung dịch thử lỏng được bơm vào cột HPLC, tính bằng nanogam (ng);

...

D là hệ số pha loãng có thể cần sử dụng;

W là khối lượng tương đương của mẫu được tạo dẫn xuất, tính bằng gam (W = 0,1 g trong 50 ml dung dịch mẫu thử);

V_i là thể tích bơm, tính bằng microlit (V_i = 20 ml).

9. Độ chụm

9.1. Yêu cầu chung

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị được lấy từ các phép thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng để phân tích dải nồng độ và chất nền khác ngoài dải nồng độ và chất nền đã cho trong Phụ lục.

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai phép thử riêng rẽ, trên vật liệu thử giống hệt nhau do cùng một người tiến hành, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, trong trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại, r, không lớn hơn 5 % trong các trường hợp.

Các giá trị đối với fumonisin B₁ trong bột ngô là:

...

= 646 mg/kg r = 381 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 780 mg/kg r = 412 mg/kg

= 1414 mg/kg r = 792 mg/kg

Các giá trị đối với fumonisin B₂ trong bột ngô là:

= 90 mg/kg r = 56 mg/kg

= 203 mg/kg r = 148 mg/kg

= 295 mg/kg r = 154 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 558 mg/kg r = 350 mg/kg

Các giá trị đối với fumonisin B₁ trong bánh ngô là:

...

= 565 mg/kg r = 238 mg/kg

= 922 mg/kg r = 238 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 1046 mg/kg r = 325 mg/kg

Các giá trị đối với fumonisin B₂ trong bánh ngô là:

= 128 mg/kg r = 78 mg/kg

= 237 mg/kg r = 98 mg/kg

= 392 mg/kg r = 84 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 457 mg/kg r = 134 mg/kg

9.3. Độ tái lập

...

Các giá trị đối với fumonisin B₁ trong bột ngô là:

= 369 mg/kg R = 291 mg/kg

= 646 mg/kg R = 459 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 780 mg/kg R = 557 mg/kg

= 1414 mg/kg R = 868 mg/kg

Các giá trị đối với fumonisin B₂ trong bột ngô là:

= 90 mg/kg R = 56 mg/kg

= 203 mg/kg R = 168 mg/kg

= 295 mg/kg R = 188 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

...

Các giá trị đối với fumonisin B₁ trong bánh ngô là:

= 323 mg/kg R = 288 mg/kg

= 565 mg/kg R = 440 mg/kg

= 922 mg/kg R = 762 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

= 1046 mg/kg R = 804 mg/kg

Các giá trị đối với fumonisin B₂ trong bánh ngô là:

= 128 mg/kg R = 123 mg/kg

= 237 mg/kg R = 182 mg/kg

= 392 mg/kg R = 339 mg/kg (mẫu thêm chuẩn)

...

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải gồm các dữ liệu sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên mẫu);

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- kết quả thử và đơn vị biểu thị kết quả;

- độ lặp lại nếu được kiểm tra;

...

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu sau đây thu được từ một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do Chương trình Tiêu chuẩn, Đo lượng và Thử nghiệm của Cộng đồng châu Âu tổ chức theo Hướng dẫn của AOAC về quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận tính đặc thù của phương pháp phân tích [4].

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột ngô

Bột ngô

Fumonisin B₁

...

Mẫu (nhiễm tự nhiên)

Trắng

Thêm chuẩn 800 mg/kg

Nhiễm tự nhiên ở mức thấp

Nhiễm tự nhiên ở mức trung bình

Nhiễm tự nhiên ở mức cao

Trắng

Thêm chuẩn 400 mg/kg

Nhiễm tự nhiên ở mức thấp

...

Nhiễm tự nhiên ở mức cao

Năm tiến hành

2000

Số phòng thử nghiệm

21^a

Số phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

...

Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

...

Giá trị trung bình (mg/kg)

646

369

780

1414

295

...

558

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r), (mg/kg)

-^b

136

147

283

-^b

...

125

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r), (%)

-^b

21,1

24,2

18,8

20,0

-^b

...

22,0

26,8

22,5

Giới hạn lặp lại r (r = 2,8 x s_r), (mg/kg)

-^b

381

249

412

792

...

154

148

350

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), (mg/kg)

-^b

164

104

199

...

-^b

144

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R), (%)

-^b

25,7

28,2

...

21,9

-^b

22,6

22,1

29,7

25,9

Giới hạn tái lập R (R = 2,8 x s_R), (mg/kg)

-^b

459

...

557

868

-^b

188

168

403

Độ thu hồi, (%)

-^b

...

-^b

72,0

-^b

^a 2 phòng thử nghiệm trong số 23 phòng tham gia bị loại do kết quả bị đánh giá là sai.

...

Bảng A.2 - Dữ liệu độ chụm đối với bánh ngô

Bột ngô

Fumonisin B₁

Fumonisin B₂

Mẫu (nhiễm tự nhiên)

Trắng

Thêm chuẩn 800 mg/kg

Nhiễm tự nhiên ở mức thấp

Nhiễm tự nhiên ở mức trung bình

...

Trắng

Thêm chuẩn 400 mg/kg

Nhiễm tự nhiên ở mức thấp

Nhiễm tự nhiên ở mức trung bình

Nhiễm tự nhiên ở mức cao

Năm tiến hành

2000

Số phòng thử nghiệm

...

21^a

Số phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

...

Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

...

Số kết quả chấp nhận được

...

Giá trị trung bình (mg/kg)

922

323

565

...

392

128

237

457

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r), (mg/kg)

-^b

...

116

-^b

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r), (%)

-^b

9,2

...

15,0

11,1

-^b

7,7

21,7

14,6

10,4

Giới hạn lặp lại r (r = 2,8 x s_r), (mg/kg)

-^b

...

188

238

325

-^b

134

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), (mg/kg)

...

272

103

157

287

-^b

121

119

...

-^b

29,5

31,8

27,8

27,4

-^b

30,9

34,8

27,5

...

Giới hạn tái lập R (R = 2,8 x s_R), (mg/kg)

-^b

762

288

440

804

-^b

339

123

...

333

Độ thu hồi, (%)

-^b

110,0

-^b

97,0

...

-^b

^a 2 phòng thử nghiệm trong số 23 phòng tham gia, do kết quả bị đánh giá là sai.

^b Không thể áp dụng.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Sắc đồ điển hình

...

x Thời gian (tính bằng phút)

y Độ nhạy huỳnh quang (mV)

Hình B.1 - Sắc đồ điển hình của bánh ngô bị nhiễm tự nhiên

CHÚ DẪN

x Thời gian (tính bằng phút)

y Độ nhạy huỳnh quang (mV)

Hình B.2 - Sắc đồ điển hình của bột ngô bị nhiễm tự nhiên

Điều kiện vận hành: tạo dẫn xuất trước cột, 50 ml dịch chiết đã tinh sạch + 50 ml thuốc thử OPA; thể tích bơm: 20 ml (tương đương với 20 mg mẫu); cột Discovery^® C₁₈1) (đường kính trong 150 x 4,6 mm); pha động đệm metanol-phosphat (77 + 23, phần thể tích, pH 3,35), tốc độ dòng 1 ml/min; detector huỳnh quang có bước sóng kích thích 335 nm và bước sóng phát xạ 440 nm.

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Visconti A., Solfrizzo M., De Girolamo A., 2001., Determination of fumonisin B₁ and B₂ in corn and corn flakes by high performance liquid chromatography and immunoaffinity column-clean-up: collaborative study. Journal of AOAC International 84, p, 1828 - 1837.

[2] Visconti A., Solfrizzo M., De Girolamo A., 2001., Determination of fumonisin at levels of interest for future EU Legislation: development of an analytical method and interlaboratory validation for maize flour and cornflakes. EU Final Report (European Commission, DG Science, Research and Development, Brussels, Belgium), EUR 19451.

[3] Solfrizzo M., De Girolamo A., Visconti A., 2001, Determination of fumonisin B₁ and B₂ in corn flackes by HPLC and immunoaffinity clean up. Food Additives and Contaminants, 18, p. 227-235.

[4] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies p. 23-51.

1) Discovery^® C₁₈ là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.