Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9527:2012 về Sữa - Xác định dư lượng nhóm tetracycline

• Số hiệu: TCVN9527:2012
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2012

Gradient

0 min: Cân bằng 100 % dung môi A ở 1 ml/min. Dung môi A cân bằng chậm. Trong ngày phân tích cân bằng cột sắc kí đã được bảo quản trong dung dịch acetonitrile 50 % trong khoảng 1 h trước khi bắt đầu chạy mẫu. Tiến hành chạy mẫu lần đầu sử dụng dung dịch đệm trắng để loại bỏ pic lạ tạo thành từ việc chạy các dung dịch đệm kéo dài qua cột sắc kí lỏng. Sự cân bằng cột sắc kí lỏng giữa các lần chạy thực hiện trong vài phút.

Từ 0 min đến 1 min: 100 % dung môi A ở 1 ml/min.

Từ 1 min đến 6 min: dung môi A-acetonitrile-methanol (70 + 22 + 8).

Từ 6 min đến 17 min: Dung môi A-acetonitrile-methanol (70 + 22 + 8) ở 1 ml/min. Có thể kéo dài thời gian nếu cần rửa giải tất cả các tetracycline.

Từ 17 min đến 19 min: 100 % dung môi A với độ tuyến tính từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min.

Từ 19 min đến 20 min: 100 % dung môi A với độ dốc tuyến tính giảm từ 1,5 ml/min đến 1 ml/min.

Từ 20 min đến 24 min: 100 % dung môi A ở 1 ml/min.

Hệ thống bơm hai kênh

Nếu dung môi B chứa axetonitril-metanol (22 + 8, thể tích) thì bắt đầu ở 100 % dung môi A và tăng dần dung môi A lên 70 % và dung môi B 30 % trong 5 min và duy trì trong 11 min.

Nếu dung môi B chứa axit oxalic-axetonitrile-metanol (70 + 22 + 8, thể tích) 10 mM thì bắt đầu ở 100 % dung môi A và tăng dần dung môi B lên 100 % trong 5 min và duy trì trong 11 min.

Cân bằng lại cột sắc kí lỏng trong khoảng ³ 4 min ( để ổn định thời gian lưu) ở điều kiện ban đầu trước khi bơm dung dịch thử tiếp theo.

Các hệ thống không có bộ bơm heli tự động thì có thể gặp phải vấn đề về khử khí, điển hình là sự xuất hiện pic lớn, rộng quanh thời gian rửa giải oxytetracycline. Nếu khó khử khí trong quá trình sắc kí gradient, thì bổ sung các lượng nhỏ axetonitril (từ 2 % đến 5 %) vào dung môi A và tăng thời gian cân bằng giữa các lần chạy mẫu. Điều này có thể cần phải chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tetracycline (3.4.2) dùng nước thay cho metanol.

Tetracycline không bền trong dung dịch nước, do đó phải chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tetracycline (3.4.2) trong ngày phân tích.

Bảo quản cột sắc kí lỏng trong dung dịch axetonitril-nước (1 + 1). Trước và sau bảo quản, thổi rửa cột sắc kí và hệ thống sắc kí bằng nước dùng cho sắc kí (khoảng 10 min đến 15 min ở tốc độ dòng 1 ml/min) để ngăn ngừa sự kết tủa của axit oxalic do nồng độ dung môi hữu cơ cao.

6.6.2 Bơm dung dịch thử

...

...

...

Trong mỗi ngày thử nghiệm cho chạy từ 1 đến 2 gradient thử trắng trước khi bơm dung dịch chuẩn sắc kí tetracycline (3.4.1) hoặc dung dịch thử để đảm bảo không có chất gây nhiễu nền cạnh thời gian lưu của tetracycline.

6.6.3 Nhận biết pic

Tetracycline rửa giải theo thứ tự sau: minocycline, oxytetracycline, tetracycline, demeclocycline, chlortetracycline, methacycline và doxycycline.

CHÚ THÍCH Thời gian lưu có xu hướng thay đổi nhẹ theo thời gian sử dụng cột và số lần bơm.

Xác định rõ việc nhận biết pic, vì các tetracycline rửa giải gần như cùng nhau. Tất cả các pic dư lượng yêu cầu cần có thời gian lưu trong khoảng 0,05 min của các thời gian lưu quan sát được từ các chuẩn nằm trong khung.

Một số chất chuyển hóa có thể làm nhiễu phép phân tích các hợp chất gốc khác. Thuốc tetracycline uống cho bò có thể làm xuất hiện cả pic của tetracycline và các pic trước (ví dụ: epitetracycline) mà rửa giải rất gần oxytetracycline.

Đôi khi, có thể xuất hiện pic nội sinh giữa oxytetracycline và tetracycline. Điều này có thể do nồng độ của riboflavin trong sữa cao, thời gian lưu xuất hiện sớm hơn khoảng 0,1 min so với thời gian lưu của tetracycline. Để giảm độ nhiễu của riboflavin, thì trong quy trình chiết dùng thể tích dung dịch đệm natri sucxinat (3.6) lớn gấp đôi để rửa cột mini (việc này chỉ hơi giảm độ thu hồi của oxytetracycline hoặc tetracycline).

6.6.4 Ổn định dịch chiết

Các tetracycline không bền ở nhiệt độ phòng trong các môi trường axit [nghĩa là trong dung dịch đệm Mcllvaine-EDTA-NaCl (3.3)]. Tetracycline và chlortetracycline suy giảm chất lượng ³ 50 % trong vòng 24 h. Các sản phẩm phân hủy có xu hướng rửa giải sớm hơn so với hợp chất gốc và thường dịch chuyển về oxytetracycline. Để tránh điều này, nên tiến hành tất cả các bước li tâm ở 10 ^oC. Làm lạnh dịch chiết hoặc phân tích trong vòng 4 h. Dung dịch rửa giải cột mini có thể được làm lạnh không quá 2 ngày hoặc đông lạnh không quá 1 tuần chỉ hơi làm thay đổi nồng độ tetracycline.

...

...

...

Chuẩn bị đường chuẩn đối với từng loại tetracycline từ sắc đồ chuẩn.

Tính nồng độ tetracycline sử dụng đường hồi quy tuyến tính sau:

y = ax + b

Trong đó:                      

y là nồng độ tetracycline của dịch chiết được bơm, tính bằng ng/ml;

x là diện tích pic hoặc chiều cao pic của tetracycline.

Đường chuẩn của mỗi loại tetracycline phải tuyến tính.

Tính nồng độ tetracycline trong sữa nguyên chất bằng cách chia nồng độ xác định được đối với dung dịch thử được bơm cho 2 (hệ số pha loãng được dùng cho cột mini, để giảm thể tích của phần mẫu thử từ 5 ml xuống 2,5 ml).

Đường nền xác định được bằng hệ thống phân tích dữ liệu tự động cần được kiểm tra đối với từng sắc đồ (xem Phụ lục B về xây dựng đường nền thích hợp).

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

Bảng A.1 và Bảng A.2 đưa ra các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về chấp nhận phương pháp.

Bảng A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về phép xác định nhóm dư lượng tetracycline trong sữa có bổ sung chuẩn, bằng sắc kí lỏng ái lực dùng chelat kim loại^a

Chất kháng sinh

Độ thu hồi trung bình

Độ lệch chuẩn lặp lại

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

Giới hạn lặp lại

Độ lệch chuẩn tái lập

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

...

...

...

%

s_r

RSD_r, %

r

s_R

RSD_R, %

R

Sữa bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 15 ng/ml

...

...

...

69,0

11,4

17

32

16,8

24

47

Oxytetracycline

75,2

...

...

...

12

26

14,4

19

40

Tetracycline

73,6

9,30

13

...

...

...

16,2

22

45

Demeclocycline

71,0

11,6

16

32

11,6

...

...

...

32

Chlortetracycline

61,7

15,6

25

44

15,6

25

44

...

...

...

58,9

10,3

18

29

10,6

18

30

Doxycycline

64,9

...

...

...

22

41

14,5

22

41

Sữa bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 30 ng/ml

Minocycline

69,2

12,4

...

...

...

35

16,2

24

45

Oxytetracycline

77,5

6,32

8,2

18

...

...

...

16

34

Tetracycline

74,8

6,48

8,7

18

15,1

20

...

...

...

Demeclocycline

72,3

8,16

11

23

9,13

13

26

Chlortetracycline

...

...

...

4,72

7,4

13

8,45

13

24

Methacycline

60,3

6,36

...

...

...

18

8,53

14

24

Doxycycline

65,2

7,34

11

21

...

...

...

13

24

Sữa bò có bổ sung ở nồng độ khoảng 60 ng/ml

Minocycline

72,0

4,11

5,7

12

6,97

...

...

...

20

Oxytetracycline

78,2

6,75

8,6

19

9,98

13

28

...

...

...

74,1

6,38

8,6

18

9,68

13

27

Demeclocycline

69,1

...

...

...

9,0

17

7,79

11

22

Chlortetracycline

63,5

6,25

9,8

...

...

...

11,0

17

31

Methacycline

58,6

5,84

10

16

9,48

...

...

...

26

Doxycycline

64,8

6,76

10

19

9,25

14

26

...

...

...

^b Dựa trên dữ liệu từ 7 phòng thử nghiệm.

Bảng A.2 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về phép xác định nhóm dư lượng tetracycline trong sữa có bổ sung bằng sắc kí lỏng ái lực dùng chelat kim loại.

Chất kháng sinh

Trung bình

Độ lệch chuẩn lặp lại

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

Giới hạn lặp lại

Độ lệch chuẩn tái lập

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

...

...

...

ng/ml

s_r

RSD_r, %

r

s_R

RSD_R, %

R

Minocycline

...

...

...

2,74

24

7,7

9,25

80

26

Oxytetracycline

18,6

2,50

...

...

...

7,0

3,97

21

11

Oxytetracycline

18,8

3,03

16

8,5

...

...

...

34

18

Oxytetracycline

30,0

4,47

15

13

10,3

34

...

...

...

Oxytetracycline (40)^b

31,4

2,55

8.1

7,1

3,79

12

11

Tetracycline

...

...

...

3,73

16

10

8,62

37

24

Tetracycline

45,3

3,44

...

...

...

9,6

13,3

29

37

Tetracycline (80)

54,1

3,94

7,3

11

...

...

...

16

24

Demeclocycline

37,0

4,39

12

12

5,93

16

...

...

...

Chlortetracycline (25)

14,5

1,87

13

5,2

2,94

20

8,2

Chlortetracycline

...

...

...

4,06

12

11

6,28

18

18

Chlortetracycline

37,4

3,98

...

...

...

11

6,02

16

17

Methacycline^c

38,2

5,51

14

15

...

...

...

18

20

Doxycycline

30,1

3,60

12

10

6,25

21

...

...

...

^a Mẫu mù lặp lại hai lần được các phòng thử nghiệm tham gia chuẩn bị; dựa trên dữ liệu do 8 phòng thử nghiệm cung cấp.

^b Số thành trong dấu ngoặc đơn là nồng độ sữa danh định đối với dư lượng tetracycline có bổ sung, tính bằng ng/ml.

^c Dựa trên dữ liệu từ 7 phòng thử nghiệm.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc đồ

Hình B.1 - Ví dụ về sắc đồ của mẫu thử

...

...

...

A Dịch chiết của sữa có bổ sung chất kiểm soát với nồng độ 30 ng của từng tetracycline/ml:

1) minocycline,

5) chlortetracycline,

2) oxytetracycline,

6) methacycline

3) tetracycline,

7) doxycycline.

4) demeclocycline

...

...

...

C Dịch chiết của sữa kiểm soát.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Simultaneous Determination of Multiple Tetracycline Residues in Milk Using Metal Chelate Affinity Chromatography, J. AOAC International Vol. 76, No. 2, 1993, p.329

[2] Simultaneous Determination of Multiple Tetracycline Residues in Milk by Metal Chelate Affinity Chromatography: Collaborative Study, J. AOAC International Vol. 79, No. 1, 1996, p. 29-42