Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8972-2:2011 về Thực phẩm - Xác định vitamin A – Phần 2: Xác định β-caroten

• Số hiệu: TCVN8972-2:2011
• Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam
• Nơi ban hành: ***
• Người ký: ***
• Ngày ban hành: Năm 2011

Khối lượng mẫu	Ancol	Chất chống oxi hóa	Kali hydroxit
2 g đến 5g	50 ml metanol	0,25 g AA	5 ml dung dịch 50 g/100 ml
5 g đến 10 g	100 ml etanol	1,0 g AA + 0,04 g Na2S	20 ml dung dịch 60 g/100 ml
10 g	150 ml etanol	1,0 g AA	50 ml dung dịch 60g/100 ml

Thời gian xà phòng hóa thường từ 15 min đến 45 min ở nhiệt độ từ 80 °C đến 100 °C (đối lưu).

Nếu sau khi xà phòng hóa và làm nguội, vẫn còn chất béo hoặc dầu thực vật trên bề mặt hỗn hợp xà phòng hóa, thì bổ sung kali hydroxit trong etanol và kéo dài thời gian xà phòng hóa.

CHÚ THÍCH Thực tế cho thấy rằng các mẫu có hàm lượng chất béo thấp như quả hoặc rau có thể chiết được trực tiếp bằng các dung môi thích hợp bằng phương pháp tương ứng, ví dụ như quy định trong [9] đến [11]. Tuy nhiên, cũng nên kiểm tra để chắc chắn rằng việc tách sắc ký có đáp ứng được các tiêu chí xác định ở trên (vấn đề gây nhiễu).

7.2.2. Chiết

Để tránh tạo nhũ, nên bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đã xà phòng hóa sao cho tỷ lệ của ancol với nước có trong dung dịch tạo thành 1:1.

Chiết b-caroten ra khỏi dung dịch mẫu đã xà phòng hóa bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp (4.7). Lặp lại quy trình chiết từ 3 đến 4 lần dùng các lượng từ 50 ml đến 150 ml. Rửa hỗn hợp các dịch chiết bằng nước (thường từ 2 đến 4 lần, mỗi lần dùng từ 50 ml đến 150 ml) đến trung tính.

7.2.3. Làm bay hơi

Làm bay hơi dịch chiết bằng máy cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 50°C. Loại bỏ hết nước bằng cách dùng natri sulfat (4.4) hoặc chưng cất đồng sôi với etanol tuyệt đối (4.2) hoặc toluen (4.6). Có thể dùng các kỹ thuật tương đương khác như dùng giấy lọc tách pha (5.7) để loại nước, với điều kiện chúng đã được chứng minh không ảnh hưởng đến kết quả.

7.2.4. Pha loãng

...

...

...

7.3. Nhận biết

Nhận biết b-caroten bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic đơn lẻ trong các sắc đồ thu được bằng dung dịch mẫu thử (xem 7.2.4) với thời gian lưu của các pic của dung dịch chuẩn (4.12.3 và 4.12.4). Việc nhận biết pic có thể cũng được thực hiện bằng các bổ sung các lượng nhỏ dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử.

CHÚ THÍCH 1: Việc tách và định lượng cho thấy thỏa mãn nếu tuân thủ các điều kiện sắc ký sau đây (xem thêm Hình Α.1).

Pha tĩnh

Spherisorb®4) ODS2, 5 µm, ống cartridge 100 mm x 4,6 mm được kết hợp với Vydac® ^4) 201TP54, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm;

Pha động

Axetonitril + dung dịch amoni axetat trong metanol + diclometan (75 + 20 + 5) (thể tích) chứa 0,1 % khối lượng hydroxytoluen đã butyl hóa và 0,05 % khối lượng triethylamin;

Tốc độ dòng

1,5 ml/min;

...

...

...

50 µl;

Bước sóng phát hiện

45 nm.

7.4. Xác định

Bơm các thể tích thích hợp (ví dụ 20 µl) của dung dịch chuẩn (4.12.3) cũng như dung dịch mẫu thử (xem 7.2.4) vào hệ thống HPLC (5.3). Tiến hành định lượng  bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic thu được đối với dung dịch mẫu thử và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có thời gian lưu tương tự, hoặc dựng đường chuẩn.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và của các dung dịch chuẩn (4.12.3 và 4.12.4) hoặc bù bằng hệ số tương ứng trong phép tính kết quả. Kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn, dùng tối thiểu ba mức pha loãng của dung dịch gốc b-caroten (4.12.1).

7.5. Số lần xác định:

Tiến hành ít nhất hai lần xác định độc lập.

8. Tính kết quả

...

...

...

Tính nồng độ khối lượng của b-caroten tổng số, r, bằng mililit trên 100g mẫu (mg/100g), theo Công thức (2):

  (2)

Trong đó

A_s

là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với các đồng phân b-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử (7.2.4), tính bằng các đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao;

c

là độ tinh khiết đã được hiệu chỉnh (xem 4.12.2) của nồng độ b-caroten trong dung dịch chuẩn tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

V_s

là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử (7.2.4), tính bằng mililit (ml);

...

...

...

thể tích bơm của dung dịch chuẩn (7.4), tính bằng microlit (µl);

A_st

là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với b-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử (4.12.3), tính bằng các đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao;

m

 là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

V_iS

là thể tích bơm của dung dịch mẫu thử, tính bằng microlit (µl);

1000

 là hệ số chuyển đổi (microgam sang miligam);

...

...

...

là hệ số chuyển đổi về hàm lượng trên 100g.

9. Độ chụm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) [12] được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng để phân tích các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với b-caroten tổng số là:

Margarin

mg/100g

...

...

...

mg/100g

Đồ uống có vitamin

mg/100g

r = 0,19

mg/100g

Bột bánh pudding

mg/100g

...

...

...

mg/100g

Rau trộn

mg/100g

r = 2,0

mg/100g

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi tiến hành thử trên vật liệu giống nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện, không quá 5% các trường hợp lớn giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với b-caroten tổng số là:

...

...

...

mg/100 g

R = 0,069

mg/100 g

Đồ uống có vitamin

mg/100 g

R = 0,41

mg/100 g

...

...

...

mg/100 g

R = 0,40

mg/100 g

Rau trộn

mg/100 g

R = 7,6

mg/100 g

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm thông tin sau đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

- các kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

- ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ HPLC

a) Độ hấp thụ;

b) Thời gian;

Pha tĩnh: Spherisorb®5) ODS2, dài 5m, ống cartridge 100 mm x 4,6 mm được kết hợp với Vydac®^5) 201TP54, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm;

Pha động: axetonitril + dung dịch nhôm axetat trong metanol + diclometan (75 + 20 +5) (thể tích) chứa 0,1% khối lượng hydroxytoluen đã butyl hóa và 0,05% khối lượng trietylamin;

Tốc độ dòng:    1,5 ml/min;

...

...

...

Phát hiện:         450 nm

Hình Α.1 – Ví dụ về chiết α-caroten, b-caroten và lycopen trong mẫu rau trộn bằng HPLC

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các kết quả và dữ liệu về độ chụm được nêu trong Bảng B.1 về xác định b-caroten tổng số thu được từ một phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) [12] do W.Shüep và J. Schierle [11] tổ chức.

Bảng B.1 – Kết quả thử nghiệm

Mẫu

...

...

...

Đồ uống có vitamin

Bột pudding

Rau trộn

Chất phân tích

b-caroten tổng số

b-caroten tổng số

b-caroten tổng số

b-caroten tổng số

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

...

...

...

1995

1995

1995

Số lượng phòng thử nghiệm

13

13

13

13

Số lượng mẫu

...

...

...

1

1

1

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

12

12

11

12

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

...

...

...

1

2

1

Số lượng các kết quả chấp nhận được

55

59

51

56

Giá trị trung bình mg/100 g

...

...

...

2,248

1,531

18,05

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100g

0,011

0,065

0,085

0,71

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r­, %

...

...

...

2,9

5,6

3,9

Giá trị lặp lại r(2,83 x s_r), mg/100 g

0,032

0,19

0,24

2,0

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

...

...

...

0,15

0,14

2,7

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R,%

9,7

6,5

9,3

15

Giá trị tái lập, R (2,83 x s_R), mg/100g

...

...

...

0,41

0,40

7,6

Các dữ liệu được kiểm tra xác nhận nêu trong Bảng B.2 đã xác định được trong nghiên cứu so sánh do chương trình Tiêu chuẩn, Đo lường và Thử nghiệm của Ủy ban Châu Âu do Viện nghiên cứu thực phẩm Norwich, Vương quốc Anh tổ chức thực hiện năm 1996 về việc đo all-trans-b-caroten trong mẫu rau trộn [10].

Bảng B.2 – Kết quả thử liên phòng thử nghiệm đối với all-trans-b-caroten

Mẫu

Rau trộn

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1996

...

...

...

14

Số lượng mẫu

1

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14

Số lượng bộ dữ liệu

0

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

14

...

...

...

60

Giá trị trung bình mg/100 g

2,37

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,159

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

6,7

Giá trị lặp lại, r(2,83 x s_r), mg/100 g

0,450

...

...

...

0,241

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

10,2

Giá trị tái lập, R(2,83 x s_R), mg/100 g

0,682

CHÚ THÍCH Dữ liệu thu được trong nghiên cứu so sánh quốc tế này thu được bằng phương pháp tương đương khác với quy trình thông thường trong các phòng thử nghiệm dùng hệ thống HPLC như Phụ lục C.

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

...

...

...

Việc tách và định lượng retinol cho thấy thỏa mãn nếu sử dụng các điều kiện sắc ký trong Bảng C.1 [10]. Xem thêm [11].

Bảng C.16) – Các điều kiện sắc ký

Pha tĩnh

Kích thước cột, mm

Pha động

Tốc độ dòng

Detector

Sphericorb ® ODS2,5 µm cộng với Vydac® 201TP54, 5 µm

100 x 4,6

...

...

...

CH₃CN + (MeOH + NH₄Ac 0,05 mol/l) + DCM (75 + 20 + 5) chứa 0,05% TEA

1,5 ml/min

450 nm

Nucleosil® 3 µm

Vydac® TP54, 5 µm

125 x 4,6

250 x 4,6

CH₃CN + (MeOH + NH₄Ac 0,05 mol/l) + DCM (70 + 20 + 10) chứa 0,05% TEA

...

...

...

Vydac® 201TP54, 5 µm

250 x 4,6

MeOH + THF (95 + 5) + 0,1% BHT

1,0 ml/min

mảng diot

Vydac® 218TP54, 5 µm

250 x 4,6

MeOH + THF (99 + 1) + 50 ppm AA

1,5 ml/min

...

...

...

Eurospher® 100-C18, 5 µm

250 x 4,0

CH₃CN + MeOH (85 + 15)

0 min đến 6 min: 1,8 ml/min.

6 min đến 20 min: 3,5 ml/min

mảng diot

Spheri-5-ODS, 5 µm

220 x 4,6

Gradient với:

...

...

...

mảng diot

Hypersil® ODS 3 µm

CH₃CN + MeOH + DCM + H₂O (700 + 150 + 100 + 25)

UV/VIS

Lychrospher® RP18, 5 µm

250 x 4,0

...

...

...

2,0 ml/min

UV/VIS

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] World Health Organisation, Expert Committee on Biological Standardisation, Techn. Report No. 147, 11, WHO, Geneva, 1958 and Techn. Report 222, I O, 51-52, WHO, Geneva, 1961.

[2] Int. Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), The Vitamin A Potency of b-Carotene, Butterworths Scientific Publications, London 1959.

[3] Bushway, R.J.: Separation of Carotenoids in Fruits and Vegetables by High-Performance Liquid Chromatography, J. Liên quan. Chromatogr. 8, 1985, 1527-47.

[4] Quackenbush, F.W.: Reversed Phase HPLC Separation of Cis- and Trans-Carotenoids and its Application in Food Materials, J. Liên quan. Chromatogr. 10, 1987, 643-653.

[5] O Neil, C.A., Schwartz, S.J., Catignani, G.L: Comparision of Liquid Chromatographic Methods for Determination of Cis-Trans Isomers of b-Carotene, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74, 1991, 36-42.

...

...

...

[7] Lumley, i. D.: in The Technology of Vitamins in Food, ed. P. B. Ottaway, Blacie Academic & Professional, Glasgow, 1993, 183-186.

[8] De Ritter, E. and Purcell, Α.E.: Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors, ed. By J. Christopher Bauernfeind, Academic Press Inc., New York, 1981,889.

[9] Hart, D.J. and Scott, K.J. , 1995. Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chem 54, 101-1 11.

[10] Finglas, P.M., Scott, K.J., Wilthöft, C.M., van der Berg, H.8, de Froidmont – Görtz, I., 1999. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilized mixed vegetables (CRM 485) and lyophilized pig’s liver (CRM 487). EUR-Report DOC/BCR/O1/98. Commission of the European Union, Luxembourg.

[11] Schüep, W. and Schiede, J., 1997. Determination of b-Carotene in Commercial Foods: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International Vol. 80 No.5,1057-1064.

[12] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994),Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

1)Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải theo đúng tên nhà cung cấp. Các sản phẩm tương đương có thể được sử dụng nếu chúng cho cùng một kết quả.

2) Các dung dịch chuẩn b-caroten và lycopen là không cần thiết đối với việc định lượng b-caroten trong dịch chiết mẫu nhưng giúp cho việc nhận biết các hợp chất khác nhau.

3) Vydac ® 201TP54, Vydac ® 218TP54, Eurospher® 100-C₁₈, Ultrasphere® ODS, Spherisorb® ODS2, Zorbax® ODS và LiChrospher® RP18 là các ví dụ về sản phẩm bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.

...

...

...

5) Spherisorb® ODS2 là tên thương mại của sản phẩm do Phase Separations Inc cung cấp; Vydac® là tên thương mại của sản phẩm do Separations Group cung cấp. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác tương đương nếu cho kết quả tương tự.

6) Chữ viết tắt:

MeOH: metanol

AA: axit ascorbic hoặc natri ascorbat

KOH: Kali Hydroxit

THF: Tetrahydrofuran

CH₃CN: axetonitril

DCM: diclometan

NH₄Ac: Nhôm axetat

...

...

...

BHT: hydroxy toluen đã butyl hóa.